Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias de camundongos em neurônios motores. Camundongo de primeira cultura, células-tronco embrionárias em fibroblastos embrionários primários de camundongos e suplemento com fator inibidor de leucemia. Em seguida, melhore o processo de normalização adicionando noggin BFG F e FGF oito induza a especificação do neurônio motor por incubação com ácido retinóico e agonista suavizado, que é seguido pelo alongamento do axônio e maturação do neurônio motor.

Finalmente, use microscopia de imunofluorescência para examinar células MES diferenciadas que expressam forte fluorescência GFP A geração de grandes quantidades de neurônio motor facilitou a pesquisa em doenças do neurônio motor em comparação com os protocolos existentes atuais. Essa abordagem de diferenciar células-tronco embrionárias de camundongos em neurônios motores é mais eficiente. Este método pode fornecer informações sobre a atrofia muscular espinhal.

Também pode ser aplicado a outras doenças do neurônio motor, como esclerose lateral amiotrófica Para revestir quatro placas de cultura de tecidos de 100 milímetros com oito mililitros de solução de gelatina a 0,1%. Após 30 minutos em temperatura ambiente, descarte o excesso de líquido. Agora dilua um frasco de mitomicina C em PMEF ativado em 40 mililitros de placa de mídia PMEF nas quatro placas e cultive por até uma semana.

Em seguida, descongele um frasco de células MES em banho-maria a 37 graus. Lave as células com cinco mililitros de meio E ES em um tubo de 15 mililitros. Após centrifugação a 800 RPM durante cinco minutos.

Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células MES em 20 mililitros de meio ES com fator inibidor de leucemia recém-adicionado. Prossiga para remover 10 mililitros de meio das culturas PMEF e substitua por 10 mililitros da suspensão de três células ES HBG. Monitore a progressão das células MES ao longo do tempo de pequenas colônias em 24 horas para colônias de aproximadamente 100 micrômetros de diâmetro em 72 horas após o plaqueamento.

Substitua o meio diariamente para manter a proliferação de células para indução de células MES. Diferenciação em neurônios motores. As células estaminais embrionárias de ratinho devem primeiro ser separadas das células alimentadoras de PMEF e depois cultivadas num ambiente de suspensão no dia da indução.

Para cada cultura ES de 100 milímetros, prepare um frasco T one 50 revestido com gelatina 0,1% Após 30 minutos em temperatura ambiente, remova o excesso de gelatina e lave três vezes com PBS. Continue a aspirar cuidadosamente a mídia da cultura ES, certificando-se de não desalojar colônias frouxamente anexadas. Em seguida, lave uma vez com 10 mililitros de PBS.

Agora, para separar as células MES do PMEF, adicione três mililitros de 0,25% de tripsina EDTA e incube por três a cinco minutos. A 37 graus Celsius, verifique se as células-tronco e o PMEF se desprenderam da placa. Em seguida, adicione 15 mililitros de meio ES fresco e interrompa as colônias pipetando.

Transfira a suspensão celular para o frasco T 50 revestido de gelatina preparado incubar por 30 minutos a 37 graus Celsius para que o PFS se prenda à superfície gelatinizada. Agora colha as células MES flutuantes em um tubo de 50 mililitros e pellet por centrificação. Ressuspenda as células em 10 mililitros de diferenciação neural.

Enumerar médio usando um hemocitômetro e, em seguida, colocar em uma placa de cultura em suspensão de 100 milímetros na diferenciação. No primeiro dia, verifique por microscopia se as células MES formaram pequenos agregados flutuantes chamados corpos embrionários. Uma vez que qualquer PMEF de transição ligado à placa, transfira as células de suspensão ES e os meios para um tubo de 15 mililitros e centrifugue a 500 RPM durante três minutos.

Para colher os corpos embrionários, aspire cuidadosamente o meio, adicione 10 mililitros de diferenciação neural fresca, média ao ebs peletizado e, em seguida, coloque as células em uma nova cultura bacteriana por 24 horas na diferenciação. No segundo dia, agite o prato de cultura e transfira a mídia e o EBS para um tubo de 15 mililitros. Deixe o EBS assentar por gravidade, depois aspire o meio com cuidado e ressuspense o EBS e 10 mililitros de diferenciação do neurônio motor.

EBS de cultura média em uma nova placa bacteriana por cinco dias na diferenciação. No sétimo dia, verifique se o EBS tem aproximadamente 150 a 200 micrômetros de diâmetro e expressa fortes sinais de GFP na diferenciação. Dia cinco, dois dias antes de dissociar a EBS, coloque lamínulas redondas de 12 milímetros no fundo de uma placa de 24 poços.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de 100 microgramas por mililitro, poli DL ornitina e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Aspire as placas secas ao ar e lamínulas de poli DL ornitina em uma capa de cultura de tecidos. Enxágue os poços da placa com água bidestilada três vezes.

Deixe secar ao ar para revestir as lamínulas. Faça uma nova diluição de dois microgramas por mililitro de laminina de camundongo em cinco mililitros de um XPBS gelado e frio. Adicione 0,5 mililitros por poço e incube a quatro graus Celsius durante a noite.

Lave duas vezes com PBS na diferenciação. No sétimo dia, colete o EBS em um tubo de 15 mililitros e deixe o EBS assentar por gravidade. Após quatro lavagens com PBS, adicione um mililitro de ACU max ao EBS, misture suavemente e incube por cinco minutos em temperatura ambiente e, em seguida, aspire o excesso de ACU max cobrindo o ebs.

Agora adicione três mililitros de meio MND e dissocie o EBS pipetando aproximadamente 20 vezes usando uma micropipeta einor de um mililitro, depois incube por dois minutos em temperatura ambiente, passe a suspensão celular através de uma tampa de treinamento de células em um tubo de 12 por 75 milímetros. Repetir esta etapa de dissociação com os aglomerados e células remanescentes retidos pelo filtro, de modo a enriquecer o rendimento de células isoladas numa suspensão final de células unicelulares de seis mililitros. Misture suavemente a suspensão de célula única e conte as células usando um hemocitômetro diluído em meio MND completo até uma densidade de duas vezes 10 elevado à quinta célula por mililitro de placa.

Suspensão de células de 0,5 mililitros por poço das placas de 24 poços preparadas contendo lamínulas revestidas com lamina de poli DL ornitina. As células diferenciadas estendem neurites longos após dois dias. Em cultura, HBG três é uma linhagem de células ES derivada de um camundongo transgênico expressando EGFP sob o controle de um promotor específico do neurônio motor HB nine com um protocolo de diferenciação definido.

As células MES podem ser usadas para derivar neurônios motores. As células MES indiferenciadas formam colônias redondas no topo de uma camada alimentadora de fibras. Eles têm expressão fraca de GFP.

Essas células MES foram separadas das camadas alimentadoras e cultivadas em placas de baixa fixação para formar corpos embrionários. As células MES diferenciadas expressaram forte fluorescência GFP após o sétimo dia. Os EBS de diferenciação foram dissociados e plaqueados em placas revestidas com lamina de poli DL ornitina.

As células diferenciadas estendem neuritos longos dos corpos celulares das células plaqueadas após dois dias em cultura, os neurônios motores derivados de células MES podem ser caracterizados por coloração de imunofluorescência. Essas células GFP positivas expressam o neurofilamento marcador neuronal pan e os dois marcadores específicos do neurônio motor. A pálpebra um e a colina acetiltransferase DPI colorem os núcleos juntos.

Nosso protocolo de diferenciação em duas etapas fornece uma maneira eficiente de diferenciar células MES em neurônios motores espinhais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão de como diferenciar eficientemente as células-tronco embrionárias de camundongos em neurônios motores. Em conclusão, lembre-se de que as altas qualidades das células-tronco embrionárias de camundongos são o parâmetro mais crítico para a geração eficiente de neurônios motores.