Name: Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores com eficiência superior. Este protocolo utiliza fatores de crescimento e ácido retinóico para gerar grandes quantidades de neurônios motores funcionais para pesquisa em doenças neuromusculares.

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Este manuscrito é dedicado à memória do Dr. Wenlan Wang, que faleceu em 26 de maio de 2011. Agradecemos ao Dr. Douglas A. Kerr para generosamente fornecer os HBG3 células MES utilizados neste estudo. Este trabalho foi financiado por Nemours, uma bolsa (2 RR016472-10) no âmbito do programa INBRE do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos (NCRR), e um COBRE Prêmio da NCRR (5 P20 RR020173-05) para apoiar o Centro de Pesquisa Pediátrica do I. Alfred duPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, EUA.

1. Passo 1: Mouse Embryonic Stem Cultura de Células (MES) (Timing: 3 dias) 1. Plating primárias embrionárias fibroblastos de rato (PMEF) <ol><li> Revestimento quatro 100-mm de tecido pratos de cultura com a gelatina, para adesão PMEF. Adicionar 8 ml de 0,1% de solução de gelatina (StemCell Technologies) a cada prato e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Retirar o excesso de gelatina a partir de pratos. Não lave os pratos. </li><li> Diluir um frasco de Mitomicina C-inactivado PMEF (Millipore) que contém aprox. 5 x 10 6 células em 40 ml de PMEF meios (ver receita na Tabela 1) ea placa para quatro 100-mm pratos de cultura de tecidos. O PMEF proporcionar uma camada alimentadora de células MES. </li><li> PMEF deve ser revestida pelo menos um dia antes da adição de culturas de células de MES. PMEF pode ser usada até 1 semana após o plaqueamento. </li></ol> 2. Cultivo de células MES Para monitorizar a eficiência do MES diferenciação celular em neurónios motores, Utilizou-se HBG3, uma linha de células ES derivado de um ratinho transgénico expressando eGFP sob o controlo do promotor de neurónio motor específico Hb9. <ol><li> Degelo 1 frasco de HBG3 células MES (aprox. 1 x 10 7, pelo Dr. Douglas Kerr, da Universidade Johns Hopkins), em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 5 ml de meios ES (ver receita na Tabela 1) em um tubo de 15 ml e girar para baixo células a 800 rpm durante 5 min. </li><li> Aspirar o sobrenadante e Ressuspender as células MES em 20 ml de meio recém-acrescentado ES com factor de Leucemia inibitória (LIF), a uma concentração final de 10 ng / ml. NOTA: LIF deve ser adicionado no dia da utilização e é necessária para manter as células MES em um estado indiferenciado. </li><li> Remover 10 ml de meio PMEF a partir do PMEF em cada prato e adicionar 10 ml da suspensão de células ES HBG3 para cada prato. </li><li> 24 h após o plaqueamento, as células de MES formar colónias pequenas, semelhantes em tamanho para a colónia indicado pela seta na Figura 1B. 72 h após o plaqueamento, Coloniaumento es em tamanho, muitos sendo de aproximadamente 100 um de diâmetro (Figura 1B, indicado pelas setas). Estas células estão prontas para a diferenciação. Os meios devem ser substituídos por dia para manter a proliferação de células. </li></ol> 2. Passo 2: Indução Neural (Timing: 2 dias) Para induzir a diferenciação de células de MES em neurónios motores, as células de MES precisam de ser separado do PMEF e cultivado em um ambiente de suspensão. Gelatina frascos revestidos são utilizados para separar PMEF a partir de células de MES. <ol><li> Quando as colónias MES estão prontos para a indução neural (definido como o dia diferenciação 0), o revestimento 2 T150 frascos com 0,1% de gelatina (18 ml / balão) durante 30 min à temperatura ambiente e depois remover o excesso de gelatina e lavar com PBS 1X três vezes. NOTA: Cada cultura prato de 100 mm vai precisar de um balão T150-gelatina revestido para separar PMEF. </li><li> Cuidadosamente remova a mídia por aspiração, tomando cuidado para não desalojar colônias frouxamente conectados. Adicionar 10 ml breve PBSly e remova por aspiração para concluir a etapa de lavagem. </li><li> Para separar as células de MES a partir de PMEF, adicionar 0,25% de tripsina / EDTA (3 ml / prato, StemCell Technologies) e incubar durante 3-5 min a 37 ° C até que as células-tronco e PMEF destacar a partir da placa. Adicionar 15 ml de meio ES frescos sem LIF e células de pipeta para cima e para baixo para quebrar colônias (cerca de 15-20 vezes). Em seguida, adicionar a uma 0,1% de gelatina revestido T150 balão e incubar durante 30 min a 37 ° C. Após a incubação, PMEF deve anexar à superfície gelatinizada, enquanto as células-tronco embrionárias devem estar flutuando. Recolher as células flutuantes MES para um tubo de 50 ml. </li><li> Girar para baixo a 800 rpm e Ressuspender as células em 10 ml de Meio de Diferenciação Neural (ver receita na Tabela 1). </li><li> Contar as células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, placa aproximadamente 2 x 10 6 células MES para um prato de cultura de 100 mm bacteriana ou suspensão. Estas placas de permitir o crescimento de culturas em suspensão e promover a formação de corpos embrióides (EBS). </li><li> Em diferenciaçãoção dia 1, as células de MES formar pequenos agregados flutuantes (EBS) que são visíveis sob um microscópio de luz. Qualquer PMEF transição anexar ao prato. Transferir as células em suspensão e meios de comunicação para um tubo de 15 ml e centrifugar a baixa velocidade (500 rpm) durante 3 min. Aspirar meios cuidadosamente, adicionar 10 ml de Meio fresco Diferenciação Neural ao EBS peletizadas e, em seguida células da placa em um prato de novo bacteriana. Além disso para reabastecer os meios de comunicação, este passo remove qualquer PMEF que carregam a partir do passo anterior. </li><li> No dia 2 diferenciação, EBs está pronto para ser induzido em neurónios motores. </li></ol> 3. Passo 3: Motor Neuron Especificação (Cronograma: 5 dias) <ol><li> No dia 2 de diferenciação, redemoinho da placa de cultura e transferir os meios de comunicação e EBS em um tubo de 15 ml. Deixe EBs resolver por gravidade (~ 10 min) ou por centrifugação a baixa velocidade (500 rpm) durante 3 min. </li><li> Aspirar cuidadosamente médio e ressuspender EBs em 10 ml de Motor Neuron Diferenciação (MND), média (ver receita em <strong&gt; Tabela 1). Placa EBs em um prato de novo bacteriana e alterar os meios de comunicação por dia durante 5 dias. </li><li> No dia 7 diferenciação, EBS deve ser de aproximadamente 150 a 200 um de diâmetro e deve expressar sinais fortes GFP (Figura 1C). Estes EBs está pronto para ser dissociada e banhado em poly-DL-ornithine/laminin pratos revestidos ou lamelas. </li></ol> 4. Etapa 4: Preparação de Poly-DL-ornithine/laminin Lamelas revestidos (Timing: 2 dias) Dois dias antes dissociar EBs (ou seja, no dia diferenciação 5), preparar as lamínulas poly-DL-ornithine/laminin-coated. <ol><li> Lamelas lugar 12-mm de diâmetro (Warner Instruments) no fundo de uma placa de 24 cavidades. Dissolve-se 25 mg de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) em 25 ml estéril, água bidestilada (d 2 H2O) para se obter uma solução-mãe 10X (1 mg / ml). Quando pronto para usar, fazer uma diluição 1/10 de poli-DL-ornitina com d 2 H2O para se obter concentração de 100 ug / ml. Adicionar 0,5 ml a cada poço da placa de 24 poços e incubar a 4 ° C durante a noite. </li><li> No dia seguinte (dia diferenciação 6), aspirado poli-DL-ornitina e deixar as placas e de ar de tampa desliza seco em uma capa de cultura de tecidos. Lavar os poços da placa com d 2 H2O três vezes. Deixar o ar seco durante mais uma hora. </li><li> Dissolve-se 1 mg rato laminina (Millipore) em 5 ml de gelado a frio 1X PBS para fazer a solução de estoque de 100x (200 ug / ml). Quando pronto para usar, fazer 1/100 de diluição em gelada-fria PBS 1X (2 ug laminina / ml). Adicionar 0,5 ml / poço numa placa de 24 poços e incubar em 4 ° C durante a noite. Antes de células de semeadura, laminina excesso deve ser removido e os poços lavados com PBS 1X duas vezes. Lamelas podem ser armazenados em MND médio (0,5 ml / poço). </li></ol> 5. Passo 5: Alongamento Axon (Timing: 2 dias) <ol><li> No dia 7 diferenciação, recolher EBs para um tubo de 15 ml e permitir EBS para resolver (aproximadamente 3 min). Aspirado meios de comunicação e re-suspend EBs em PBS. Permitir EBs para resolver e, em seguida, aspirar PBS. Repetir este passo 3 vezes. Adicionar 1 ml de Accumax (Millipore) para o EBS, suavemente misturar e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, aspirar Accumax excesso cobrindo o EBS. </li><li> Para dissociar EBs, adicionar 3 ml de meio de MND. Pipeta cima e para baixo 20 vezes usando uma micropipeta Eppendorf 1 ml (azul ponta) para romper EBs. Incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente. Transferir suspensão de células para um tubo de milímetro 12x75 com célula de coador tampa (BD Falcon) para se obter uma suspensão de células individuais. Repetir este passo de dissociação com tufos restantes e células retidas pelo filtro, de modo a enriquecer o rendimento de células individuais. A suspensão celular final única será 6 ml. </li><li> Misturar cuidadosamente esta suspensão de células individuais e contar as células utilizando um hemocitómetro. Diluir as células em meio de MND (suplementado com 10 ng / ml de cada BDNF, GDNF, CNTF, e NT-3) a uma densidade de 2x10 células por 5 ml. Adicionar a suspensão de células (0,5 ml / poço) para placas de 24 poços contendo polamelas ly-DL-ornithine/laminin revestidos (previamente preparado como descrito acima). As células diferenciadas estender neurites longas após 2 dias em cultura (Figura 1D). </li></ol> 6. Os resultados representativos A Figura 1A mostra um esboço do protocolo. No passo 1, as células são cultivadas em MES PMEF e suplementado com LIF para impedir a diferenciação espontânea. Em geral, as colônias indiferenciadas MES são redondos e compactos, e definiram claramente bordas. As colónias não estão em contacto um com o outro. Tipicamente, as células de MES deve ser dividida em uma razão de 1:4 a cada 2 ~ 3 dias. No entanto, cada linha de células indivíduo vai crescer a uma taxa diferente e da razão de separação devem ser determinadas empiricamente. As setas na Figura 1B indicar a aparência típica de células MES após a cultura em uma camada de alimentador PMEF durante 3 dias. Estas colônias são grandes (50-100 m de diâmetro), mas ainda manter a ponta redonda e definidoss. Nesta fase as colónias estão prontos para a diferenciação ou subcultura. Uma ponta da flecha na Figura 1B mostra uma colônia MES pequena que você costuma encontrar 24 h após o plaqueamento. Quatro dias após o plaqueamento, as células tornam-se MES overgrown. Eles mostram uma aparência achatada e perda dos limites definidos, indicando que eles estão começando a diferenciar. Essas células não são ideais para diferenciação em células neuronais. Para diferenciar células MES em neurónios motores, as células de MES precisam ser cultivados em condições de suspensão para permitir a formação EB. No passo 2, as células ES são transferidos para uma superfície de cultura sem uma camada alimentadora para promover a formação de EB. Neste passo, são incubadas em meio suplementado com Diferenciação Neural Noggin, bFGF, e FGF-8 durante 2 dias para as células directos para uma linhagem neuronal. Pequeno EBS pode ser observado ao microscópio no dia 1 de diferenciação. Eles devem estar flutuando no meio. Esta transição PMEF também pode ser encontrada em dia 1de diferenciação e deve ser removido. Estas células aderir aos pratos bacterianas modo são eliminados quando EBS são passadas para um prato de novo bacteriana. Assim, por dia 2 de diferenciação, PMEF poucos ou não deve ser vista no prato de cultura. No passo 3, continuou transferência de EBS para novos pratos deve assegurar a remoção de qualquer PMEF restante. EBS são cultivadas em Motor Neuron de Diferenciação (MND) meios suplementados com AR e SAG durante 5 dias para diferenciar as células em neurónios motores. Durante a cultura, as EBs continuar a crescer em tamanho e pode ser visto a olho nu no dia diferenciação 3 ~ 4. Figura 1C mostra a aparência microscópica de EBS em dia diferenciação 7. Ao contrário das células indiferenciadas, EBs mostram forte fluorescência devido à expressão da GFP. Estes EBs são perfeitamente diferenciados e estão prontos para a dissociação. A citometria de fluxo demonstrou que 51% ± 0,8% das células a partir da EBs dissociado tinha diferenciadas em células que expressam GFP 5. No passo 5, a cultura de thneurónios ese motor na presença de GDNF, CNTF, BDNF, NT3 e resulta em extensão de longos projecções axonal. A Figura 1D mostra o aparecimento de células diferenciadas 2 dias após o plaqueamento da EBS dissociados. Observação neurites longas que se estendem a partir dos corpos celulares das células chapeados. Coloração imunofluorescente mostra que a GFP + de células expressam o marcador pan-neuronal (neurofilamento de cadeia média), e dois marcadores neuronais específicas a motor, (Islet-1 e de colina-acetiltransferase, a Figura 2). <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Figura 1. Diferenciação das células MES em neurónios motores (figura modificado a partir do Wu et al. 5). A) Esquema do protocolo de diferenciação das células MES para os neurônios motores. B) As células indiferenciadas MES formar colónias redondas sobre o topo de uma camada alimentadora de fibroblastos. Eles têm fraca expressão da GFP. C) As células foram separadas do MES camadas alimentadoras e blovermelha em baixo de fixação pratos para formar EBs. Durante os primeiros dois dias do processo de diferenciação, as células foram expostas a 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, e 20 ng / ml FGF-8. Posteriormente, foram induzidas a diferenciar com um ácido retinóico iM e 1 uM sónica SAG agonista hedgehog durante 5 dias. As células diferenciadas MES expressa de fluorescência da GFP forte. D) Depois de 7 dias de diferenciação, as EBs foram dissociados e plaqueados em placas revestidas poly-DL-ornithine/laminin. As células diferenciadas alargado longos processos neuronais após 2 dias em cultura. Barra de escala = 200 mM. MN = neurônio motor. B, C e D são imagens de campo claro e B &#39;, C&#39; e D &#39;são correspondentes imagens de fluorescência. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Figura 2. Caracterização de neurónios MES células derivadas do motor. Técnica de imunofluorescência para a cadeia de neurofilamentos médio (NF-M, vermelho), Chat (vermelho), e Ilhota-1 (vermelho) foi coincidente com GFP (verde) expression. DAPI (azul) foi usado para identificar os núcleos. Barra de escala = 50 mM.

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
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<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A qualidade de células MES é o parâmetro mais crítico para a geração eficiente de neurónios motores. células de MES deve ser cultivado em PMEF para impedir a diferenciação espontânea. A adição de LIF ajuda a manter as células MES em um estado indiferenciado. Como as células de MES dividir cada h 12-15, o meio de cultura se torna empobrecido rapidamente e deve ser substituído por dia. Activação eficiente da via Shh é um parâmetro crítico necessário para induzir a motor especificação neurónio....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração final </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF médio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES médio </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-Qualificado FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Non-aminoácidos essenciais </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucleosídeos </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Meio de diferenciação neural </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Non-aminoácidos essenciais </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-tio glicerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Caneca pequena </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND médio (diferenciação) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES Cult-Médio-A Basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Substituição Knockout soro </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Seu suplemento B- </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% em d 2 H2O </td></tr><tr><td> A fibronectina </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml em d 2 H2O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Ácido Retinóico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> Merck Química </td><td> 566660 </td><td> 1 uM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND médio (Motor Neuron cultura) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES Cult-Médio-A Basal </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Substituição Knockout soro </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Seu suplemento B- </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Ácido ascórbico </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> A penicilina / estreptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Glutamax-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% em d 2 H2O </td></tr><tr><td> A fibronectina </td><td> StemCTecnologias ell </td><td> 07159 </td><td> 5 ug / ml </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml em d 2 H2O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = não-aplicável. Tabela 1. PMEF e Mídia para MES cultura de células ou de diferenciação. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;&gt; Nome forte do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> 0,1% de gelatina </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poli-DL-ornitina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml em d 2 H2O </td></tr><tr><td> Rato laminina </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 ug / ml em PBS </td></tr><tr><td> 0,25% de tripsina / EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = não-aplicável. Tabela 2. Reagentes para revestimento e dissociação.

diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Diferenciação direta de células tronco embrionárias (ES), as células em neurônios funcionais motoras representa um recurso promissor para estudar mecanismos da doença, para filtrar compostos de drogas novas, e para desenvolver novas terapias para doenças do neurônio motor, tais como atrofia muscular espinhal (AME) e esclerose lateral amiotrófica ( ALS). Muitos protocolos actuais usar uma combinação de ácido retinóico (RA) e hedgehog sónica (Shh) para diferenciar estaminais embrionárias de rato (MES) em células do motor neurónios 1-4. No entanto, a eficiência de diferenciação de células de MES em neurónios do motor tem apenas um sucesso moderado. Nós desenvolvemos um protocolo de diferenciação de dois passos 5, que melhora significativamente a eficiência de diferenciação em comparação com os protocolos actualmente estabelecidas. O primeiro passo é melhorar o processo de neuralization por adição de noggin e factores de crescimento de fibroblastos (FGFs). Noggin é uma proteína morfogenética do osso antagonista (BMP) e está implicado na indução neural umae acordo com o modelo padrão de neurogênese e resulta na formação de padrão neural anterior 6. FGF sinalização age sinergicamente com Noggin na indução de formação de tecido neural através da promoção de uma identidade posterior neural 7-9. Neste passo, as células foram condicionadas com MES Noggin, bFGF, e FGF-8 durante dois dias para promover a diferenciação para linhagens neurais. O segundo passo é o de induzir a motor especificação neurónio. Noggin / FGFs expostas células foram incubadas com MES RA e um agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), durante mais 5 dias a fim de facilitar a motor geração neurónio. Para monitorizar a diferenciação de neurónios motores em MES, utilizou-se uma linha de células ES derivado de um ratinho transgénico eGFP expressando sob o controlo do promotor de neurónio motor específico Hb9 1. Usando este protocolo robusto, obtivemos 51 ± 0,8% de eficiência diferenciação (n = 3, p &lt;0,01, teste t de Student) 5. Os resultados de imunofluorescênciacoloração revelou que as células GFP + de expressar os marcadores neuronais específicas, a motor Islet-1 e de colina-acetiltransferase (ChAT). Nosso protocolo de diferenciação em duas fases fornece uma forma eficiente de diferenciar as células MES em neurônios motores da coluna vertebral.

Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

A diferenciação direta de células-tronco embrionárias (ES) em neurônios motores funcionais representa um recurso promissor para estudar mecanismos de doenças, realizar a triagem...

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores. Primeiro, cultive células-tronco embrionárias de camundongo em fibroblastos embrionários de camundongo primários e suplemente com fator inibidor de leucemia. Em seguida, potencialize o processo de indução adicionando noggin, FGF-B e FGF-8, induza a especificação de neurônios motores pela incubação com ácido retinóico e agonista de smoothened, seguida por alongamento do axônio e maturação dos neurônios motores.Por fim, utilize microscopia de imunofluorescência para examinar células MES diferenciadas que expressam forte fluorescência GFP. A geração de grandes quantidades de neurônios motores facilitou a pesquisa em doenças dos neurônios motores em comparação com os protocolos atualmente existentes. Esta abordagem de diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores é mais eficiente. Este método pode fornecer insights sobre a atrofia muscular espinhal.Ele também pode ser aplicado a outras doenças dos neurônios motores, como a esclerose lateral amiotrófica. Para semear fibroblastos primários de camundongo embrionário, revestir quatro placas de

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Este vídeo mostra um método para diferenciar células progenitoras neurais da medula espinhal (NPCs) em neurônios motores. Ele detalha o processo de cultura dos NPCs em uma placa de cultura revestida usando meios especializados enriquecidos com inibidores específicos destinados a facilitar a diferenciação de NPCs em neurônios motores maduros.

Diferenciação de células progenitoras neurais da medula espinhal em neurônios motores

Este vídeo demonstra uma técnica para diferenciação de células-tronco embrionárias em uma população em rede de neurônios com sinapses funcionais. Ele descreve as etapas envolvidas na diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios, indução da formação de redes neuronais e enriquecimento da cultura com neurônios em rede.

Diferenciando células-tronco embrionárias de camundongos em uma população de neurônios em rede

Este vídeo mostra o processo de diferenciação de iPSCs humanas em neurônios motores. A lógica envolve a utilização de iPSCs que foram geneticamente modificadas para expressar fatores de transcrição específicos. Quando cultivado em um meio contendo doxiciclina, esse antibiótico desencadeia a expressão de fatores de transcrição, promovendo assim a diferenciação de iPSC em progenitores do neurônio motor. Em última análise, os progenitores são cultivados em um meio neuronal para produzir neurônios...

Diferenciando células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em neurônios motores funcionais

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Este protocolo permite a conversão rápida e eficiente de pilhas de haste pluripotentes induzidas em neurônios de motor com uma identidade espinal ou craniana, pela expressão ectópica de fatores da transcrição dos vetores induzível de piggybac.

Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

Apresentado aqui é um protocolo para a geração de uma cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas e sua diferenciação subseqüente em células progenitoras neurais. O protocolo é simples, robusto, escalável e adequado para rastreamento de medicamentos e aplicações de medicina regenerativa.

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Aprenda a diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores com eficiência superior. Este protocolo utiliza fatores de crescimento e ácido retinóico para gerar grandes quantidades de neurônios motores funcionais para pesquisa em doenças neuromusculares.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

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