Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

O objetivo geral deste procedimento é gerar progenitores de interneurônios corticais em precursores de interneurônios pós-mitóticos para células-tronco embrionárias de camundongos usando um corpo embrióide modificado para o método de monocamada. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os subtipos de interneurônios corticais alcançam seus destinos individuais durante o desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração eficiente de progenitores interneurônios que expressam Nkx2.1, bem como métodos para enriquecer os subgrupos de interneurônios de parvalbumina ou somatostatina.

Para iniciar este procedimento, coloque células alimentadoras de MEF mitoticamente inativas em meio MEF em placas tratadas com cultura de tecidos. Aguarde pelo menos 12 horas para que eles se acomodem em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius antes de plaquear os mESCs. Se não for usado imediatamente, substitua a mídia MEF a cada três dias.

Em seguida, adicione mESCs contendo fator inibidor de leucemia de camundongo às placas MEF. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Passe mESCs usando tripsina-EDTA quando o prato se tornar 70 a 80% confluente e mantenha os mESCs em uma camada alimentadora de MEF em meio mESC para manter a pluripotência.

Antes de iniciar a diferenciação, passe as células pelo menos uma vez em placas revestidas de gelatina sem MEFs para diluí-las. Para fazer isso, prepare placas revestidas de gelatina adicionando 0,1% de gelatina e PBS com cálcio e magnésio a uma placa tratada com cultura de tecidos e incube a 37 graus Celsius por pelo menos 1 hora. Coloque 1,5 a duas vezes 10 elevado à sexta célula em cada placa de dez centímetros e deixe-as expandir por dois dias antes de iniciar a diferenciação.

No DD0, após as mESCs terem crescido nas placas revestidas de gelatina por dois dias, aspire o meio e lave as células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione tripsina-EDTA suficiente para cobrir a superfície das placas. E coloque as células de volta na incubadora a 37 graus Celsius por quatro minutos.

Após quatro minutos, extinguir a tripsina-EDTA usando duas vezes o volume de meio mESC. Transferir as células para um tubo de centrifugação de tamanho adequado e centrifugar as células a 200 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, remova o tubo e aspire o meio sem perturbar o pellet.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio KSR-N2. Posteriormente, meça a concentração celular usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado. Comece a cultivar as células como corpos embrióides adicionando 75.000 células por mililitro em meio KSR-N2 nas placas de cultura de tecidos não aderentes.

E incubá-los a 37 graus Celsius. No DD1, prepare-se para o pouso celular revestindo as placas tratadas com cultura de tecidos com poli-L-lisina por pelo menos uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius. Em DD2, aspire a poli-L-lisina e cubra as placas com laminina durante a noite a 37 graus Celsius.

No DD3, antes de iniciar a dissociação da EB, aspire a laminina e deixe as placas secarem completamente em uma capa de cultura de tecidos. Em seguida, transfira os EBs com o meio para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por três a quatro minutos a 15 vezes g ou até que os EBs estejam peletizados. Aspire o meio e adicione três mililitros de solução de descolamento celular contendo DNase.

Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos. Agite suavemente o tubo a cada três minutos para ajudar na dissociação EB. Quando os EBs não estiverem mais visíveis ou tiverem decorrido 15 minutos, adicione seis mililitros de KSR-N2 contendo DNase e centrifugue por cinco minutos a 200 vezes g.

Em seguida, coloque as células em KSR-N2 contendo LDN193189, XAV939, e o inibidor ROCK, Y27632, em 4,5 a cinco vezes dez elevado ao quarto centímetro quadrado. No DD5, troque a mídia com KSR-N2 contendo FGF2, IGF1 e SSH. Em seguida, prepare as placas de cultura de tecidos para replaqueamento no dia 8, usando as instruções descritas nos procedimentos em DD1 e DD2.

No DD7, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2, IGF1 e SHH. No DD8, recoloque as células recolocando-as das placas com tripsina-EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius. Extinguir tripsina-EDTA usando duas vezes seu volume com KSR-N2.

E centrifugue a 200 vezes g por cinco minutos. Filtre as células através de um tubo de filtro de 40 mícrons para remover quaisquer grumos. Em seguida, replaquear as células a 250.000 células por centímetro quadrado em N2-KSR contendo FGF2, IGF1 e Y27632 com SHH.

No DD10, troque a mídia por KSR-N2 contendo SHH. Lave as células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio e adicione reagente de dissociação celular pré-aquecido e sem tripsina, contendo DNase às células. Coloque-os na incubadora a 37 graus Celsius por 10 a 30 minutos ou até que as células se desprendam.

Em seguida, bata suavemente nas placas a cada cinco minutos para ajudar na dissociação. No DD5, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2 e IGF1. Em seguida, prepare as placas de cultura de tecidos para replaqueamento em DD8.

No DD7, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2 e IGF1. No DD8, replaquear as células com agonista suavizado e adicionar inibidor de PKC atípico. No DD10, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi.

No DD11, desconecte as células das placas para FACS. Se as células não foram destacadas para FACS em DD11, troque de mídia em DD12 por KSR-N2 contendo aPKCi. No DD14, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi.

E no DD16, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi. Em seguida, no DD17, colete as células positivas Nkx-2.1:mCherry. Aqui são mostradas as imagens representativas de imunocoloração para Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry e Lhx6:GFP de uma cultura de diferenciação no dia 12.

Observe que essas imagens são canais sobrepostos do mesmo campo de visão. Este gráfico mostra a quantificação da porcentagem média de núcleos positivos para DAPI que expressam Nkx2,1 em DD12 em cultura. E este é um gráfico FACS representativo, demonstrando as quatro populações de células diferentes que podem ser isoladas usando nossa linha mESC repórter dupla.

Observe que mCherry está no eixo x e GFP está no eixo y. Assim, a caixa superior direita representa as células que são duplamente positivas para mCherry-GFP. Aqui está o curso de tempo da indução de Nkx2.1: mCherry e Lhx6: GFP de DD6 a 16, expresso como a porcentagem de células em cultura que são apenas expressas em mCherry, apenas expressas em GFP ou co-expressas em mCherry-GFP.

Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em 17 dias do início ao fim, se executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre começar com células-tronco pleuripotentes, indiferenciadas e de aparência saudável. Após este procedimento, outros métodos, como transplante em neocórtex de camundongo neonatal ou adulto, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a determinação do destino do interneurônio ou o efeito do transplante de interneurônios na função do circuito e no comportamento animal.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência do desenvolvimento explorarem os fatores que impulsionam a determinação do destino dos interneurônios em camundongos e, por extensão, em pacientes afetados por distúrbios relacionados aos interneurônios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como derivar progenitores que expressam Nkx2.1 e sua progênie pós-mitótica a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.