Name: Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a gerar progenitores de interneurônios corticais a partir de células estaminais embrionárias de rato usando método modificado de corpos embrioides. Esta técnica permite estudar determinação de destino celular e aplicações terapêuticas em neurociência.

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Nós estamos gratos ao Qing Xu para desenvolver a linha de mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP repórter dual, bem como Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros para seus primeiros trabalhos em ajudar a desenvolver este protocolo. Agradecemos também o núcleo de citometria de fluxo CHOP para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).

Nota: A linha de mESC dupla repórter descrita neste protocolo está disponível mediante solicitação (sande@mail.med.upenn.edu).
1. preparação de mídia
Nota: Aquecer todos os meios a 37 ° C antes do uso em cultura de células.
<ol><li>
Mídia de fibroblasto embrionário mouse (MEF) (para a preparação de 500 mL)
	<ol>
<li>Adicione 50 mL soro de bovino fetal (FBS) 449 mL de Dulbecco médio (DMEM modificado águia) e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.</li>
		<li>Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazenar a mídia em 4 ° C por até 1 mês ou alíquota e loja a ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
N2 mídia (para a preparação de 500 mL)
	<ol>
<li>Adicionar 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100x) e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) a 489,5 mL DMEM: F-12 mistura de nutrientes (DMEM/F-12) e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.</li>
		<li>Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) e 5 mL de N2 suplemento-B após a filtragem. Armazene a mídia em 4 ° C no escuro por até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Meio de crescimento livre de soro (KSR) (para a preparação de 500 mL)
	<ol>
<li>Adicione 75 mL de suplemento de soro livre médio, 5 mL de L-glutamina (100x), 5 mL MEM aminoácidos não essenciais (MEM-timina) (100x), e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) para não 413,5 mL-glutamina contendo DMEM e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.</li>
		<li>Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazene a mídia em 4 ° C por até 1 mês.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mídia de células-tronco embrionárias de rato (para a preparação de 500 mL)
	<ol>
<li>Adicionar a classe de células-tronco 75ml FBS, 5ml MEM-timina (100x), 5 mL de L-glutamina (100 x), e 500 µ l 2-mercaptoetanol (55 milímetros) para não 413,5 mL-glutamina contendo DMEM e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.</li>
		<li>Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazenar a mídia em 4 ° C no escuro por até 1 mês ou alíquota e loja a ≤-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo mESCs
<ol><li>Placa mitotically MEF alimentador células inativas em mídia MEF em placas de cultura de tecidos tratada em 3-4 x 104 células/cm2. Permitir que pelo menos 12 h para eles a se estabelecer em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 antes do chapeamento do mESCs. Se não usado imediatamente, substitua a mídia MEF a cada 3 dias. Livrou-se de MEFs não utilizados no prazo de 7 dias do chapeamento.</li>
	<li>Adicione mESCs (faixa de densidade de 1-4 x 104 células/cm2) para placas MEF no mESC mídia contendo Mouse fator inibitório de leucemia (mLIF) (1.000 U/mL). Incube a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2células.</li>
	<li>Passagem mESCs usando do trypsin-EDTA (tripsina 0,05%) (1:5-1:10) uma vez que se torna o prato ~ 70-80% confluente ou se as colônias estão começando a tocar. Isto normalmente ocorre a cada 2 dias, mas pode demorar até 4 ou 5 dias, dependendo da densidade inicial do chapeamento.</li>
	<li>Manter os mESCs em uma camada de alimentador MEF médio e mESC manter pluripotência.</li>
	<li>
Antes de iniciar a diferenciação, passagem das células pelo menos uma vez em placas de gelatina revestida sem MEFs para diluir para fora os MEFs.
	<ol>
<li>Preparar as placas de gelatina revestida pela adição de 0,1% gelatina em solução salina tamponada fosfato (PBS) com Ca2 +/ mg2 + para um prato de cultura de tecidos Tratado e deixando a 37 ° C, durante pelo menos 1 h. chapa de 1,5 a 2 x 106 células/10 placa de cm (2.7-3.6 x 104 células/cm2) e permitir que as células expandir por 2 dias antes do início de diferenciação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. diferenciar mESCs em direção a MGE-como progenitores tele-encefálico
<ol><li>
Dia de diferenciação (DD) 0 = "flutuar em células"
	<ol>
<li>Depois os mESCs cresceram placas de gelatina revestida por 2 dias, aspirar a mídia e lavar as células uma vez com PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Adicione o suficiente do trypsin-EDTA (tripsina 0,05%) para cobrir a superfície da placa (normalmente 4 mL do trypsin-EDTA para um prato de cultura de tecido de 10 cm) e colocar as células volta para a incubadora a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 por 4 min.</li>
		<li>Depois de 4 min, saciar o tripsina-EDTA usando 2 vezes o volume com mídia mESC. Transferir as células para um tubo de centrífuga de tamanho adequado e centrifugar as células a 200 x g por 5 min. Depois de 5 min, retire o tubo e aspire a mídia sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet em mídia KSR:N2 (1:1) de 1 mL contendo o inibidor BMP LDN-193189 (250 nM) e o inibidor de Wnt Antônio-939 (10 µM).</li>
		<li>Medir a concentração de células usando um hemocytometer ou contador automatizado de células. Iniciar o crescimento de células como corpos do embryoid (EBs) adicionando 75.000 células/mL em meios KSR:N2 (1:1) contendo LDN-193189 (250 nM) e Antônio-939 (10 µM) em pratos de cultura de tecidos não-aderente. Incube a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na DD1, prepare-se para célula "desembarque" por revestimento pratos de cultura de tecidos tratado com poli-L-lisina (10 µ g/mL em PBS com Ca2 +/ mg2 +) durante a noite (O/N) a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95% ou pelo menos 1 h.</li>
	<li>DD2, Aspire o poli-L-lisina e revestir as placas com laminina (10 µ g/mL em PBS com Ca2 +/ mg2 +) O/N a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95%. Nota: Enquanto O/N é ideal, tão pouco como 2 h pode ser suficiente. Se as placas não são usadas no dia seguinte, Aspire laminina, substituir com PBS sem Ca2 +/ mg2 +e armazenar a 4 ° C por até 2 semanas.</li>
	<li>
DD3 ("células de terra")
	<ol>
<li>Antes de iniciar a dissociação do EB, aspirar a laminina e deixe as chapas completamente seco em uma capa de cultura de tecidos. Não utilize placas que aparecem brilhantes ou visivelmente molhado. Transferi o EBs com mídia em um tubo de 15 mL e centrifugar para 3-4 min em 15 x g, ou até que a EBs ter peletizado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspire a mídia e adicionar 3 mL de solução de desprendimento de células contendo DNase (2 U/mL) e incubar a 37 ° C, com umidade relativa ≥ 95% e 5% de CO2 por 15 min. flick suavemente o tubo a cada 3 min para auxiliar na dissociação de EB.</li>
	<li>Uma vez que a EBs não são mais visíveis ou decorridos 15 min, adicione 6 mL KSR:N2 (1:1) contendo DNase (1 U/mL) e centrifugar durante 5 min à x 200g.</li>
	<li>As células KSR:N2 (1:1) contendo LDN-193189 da placa (250 nM), Antônio-939 (10 µM) e o inibidor ROCK Y-27632 (10 µM) em 4,5-5 x 104 células/cm2.</li>
</ol>4. SST-enriquecendo o protocolo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (continuação da etapa 3.7)
<ol><li>Na DD5, mudar de mídia com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e SSH (50 ng/mL).</li>
	<li>Preparar as placas de cultura de tecido para re-chapeamento no dia 8 (etapa 4.4) usando as instruções descritas em etapas 3.2-3.3.</li>
	<li>Na DD7, mudar de mídia com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e o SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Na DD8, re-placa as células. Nota: Embora este passo não é essencial, re-chapeamento as células pode reduzir tipos de células diferenciadas precoce, indesejada. Re-chapeamento também rompe-se bolas de células que dificultam análises imuno-histoquímica a jusante e aumenta a eficiência da FACS nos pontos de tempo mais tarde.<ol>
<li>A re-placa células, separar as células da placa com tripsina-EDTA (tripsina 0,05%) por 5 min a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2. Saciar o tripsina-EDTA usando 2 vezes o volume com KSR:N2 e centrifugar 200 x g por 5 min. filtrar as células através de um tubo de filtro de 40 µm para remover qualquer touceiras. Re-placa as células em 250.000 células/cm2 na N2/KSR (1:1), contendo o FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) e Y-27632 (10 µM) com SHH (50 ng/mL). Nota: Se em vez disso, a decisão é feita para não re-placa as células na DD8, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 contendo SHH (50 ng/mL) em 2 dias de DD7 para DD12 e continuar a adicionar o IGF-1 (20 ng/mL) e FGF-2 (10 ng/mL) até DD9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na DD10, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 contendo SHH (50 ng/mL).</li>
	<li>
Na DD12, para obter as células que são enriquecidas por subtipos de SST, use FACS para isolar Lhx6::GFP-expressando apenas células.
	<ol>
<li>Para desprender as células, use um reagente de célula-dissociação contendo tripsina não ao invés do trypsin-EDTA. Lave as células uma vez com PBS sem Ca2 +/ mg2 +. Adicionar previamente aquecido não-tripsina contendo células-dissociação reagente contendo DNase (2 U/mL) para as células. Colocá-los na incubadora a 37 ° C com ≥ 95% de umidade relativa e 5% CO2 por 10-30 min ou até que as células têm destacado. Bata levemente as placas cada 5min para auxiliar a dissociação. Nota: Para culturas DD11-12, apenas 10-15 min pode ser necessário. Para culturas de DD15-16, 30 min ou mais podem ser exigida para dissociação completa.</li>
		<li>Uma vez que as células têm levantado completamente no prato, proceder ao isolamento de FACS usando protocolos padrão ou usar as células em outras análises a jusante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. PV-enriquecendo o protocolo: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (continuação da etapa 3.7)
<ol><li>Na DD5, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Prepare-se para re-chapeamento no DD8 placas de cultura de tecidos (etapa 4.4) usando as instruções descritas em etapas 3.2-3.3.</li>
	<li>Na DD7, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>Na DD8, re-placa as células conforme descrito na etapa 4.4 com as seguintes exceções: quando re-chapeamento das células, substitua SHH smoothened agonista (SAG; 30 nM) e adicionar inibidor PKC atípica (aPKCi; 2 µM). Tomados em conjunto, a mídia re-chapeamento é agora N2/KSR (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM) e aPKCi (2 µM).</li>
	<li>Na DD10, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM).</li>
	<li>
DD11 Nota: neste momento, as células Nkx2.1::mCherry+ são enriquecidas para se tornar PV cinsa.<ol>
<li>Separe as células da placa para FACS usando o mesmo protocolo descrito na etapa 4.6. Se a decisão é feita para coletar células Nkx2.1::mCherry+ em um dia mais tarde de diferenciação, ignore esta etapa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na DD12, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD14, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD16, mude os meios de comunicação com KSR:N2 contendo aPKCi (2 µM). Na DD17, recolha as células de Nkx2.1::mCherry+ usando o mesmo protocolo descrito na etapa 4.6.</li>
</ol>6. PV-enriquecendo o protocolo: "DD17 mCherry Low SHH" (continuação da etapa 3.7)
<ol><li>Na DD5, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL). Na DD7, mudar os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1) contendo FGF-2 (10 ng/mL) e IGF-1 (20 ng/mL).</li>
	<li>
Na DD9, mude os meios de comunicação com KSR:N2 (1:1). Deste ponto em diante, sem fatores de crescimento adicionais são necessárias.
	<ol>
<li>Continue a mudar os meios de comunicação a cada 2 dias até a colheita das células na DD17.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Enquanto este método é altamente eficaz na padronização J1-derivado de mESCs (SCRC-1010), nós experimentamos sucesso variável com outras linhas de mESC e isolados clonais. Por exemplo, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivado; Danjo et al 13) responder mal para este protocolo e indução de Foxg1 por DD12 é tipicamente na ordem de 1-2%. Por razões que não entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP outro repórter dual clone (denominado JQ59) foi isolado simultaneamente como a linha descrita neste protoco...

Em ambos os ratos e os seres humanos, aproximadamente metade dos interneurônios inibitórios tudo corticais (Cristo) se originam dentro de uma estrutura subcortical transitória, conhecida como a medial Eminência ganglionar (MGE), onde os progenitores neuroepithelial de cinsa e outros neuronal e glial subgrupos expressam o fator de transcrição Nkx2.11,2. Subgrupos de CIn ou subtipos são definidos pela interseção morfológica, neuroquímica, eletrofisiológicos e conectividade características3,4. O MGE-derivado de Cristo pode ser agrupados em subgrupos principalmente não-sobreposição com base em sua expressão de PV ou de SST, a expressão da qual correlaciona-se com particular eletrofisiológicos e conectividade tendências5. Disfunção dos interneurônios, especialmente aqueles no subgrupo PV, tem sido implicada em vários neuropsiquiátricas distúrbios e doenças6,7. O objectivo geral deste método é para produzir células-tronco derivadas de progenitores mitóticas e migratórias precursores enriquecidos para PV ou SST CIn destino para estudar Biologia interneurônio cortical e para uso em terapias baseadas em células.
Nós desenvolvemos um método altamente eficiente, escalável para a derivação de progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de mESCs. Usando uma Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dupla repórter mESC linha8, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolados através de FACS e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Ao manipular um número de vias de sinalização, duração da cultura e modo de neurogênese, podemos obter milhões de precursores interneurônio fluorescente etiquetadas apropriados para uma série de aplicações a jusante.
Apesar de vários outros métodos existem para gerar MGE-como progenitores de mESCs9,10,11,12,13,14, nosso método, que depende o Wnt antagonista Antônio-939, é particularmente eficiente na geração de co expressando progenitores tele-encefálico Foxg1/Nkx2.1. Além disso, a capacidade de selecionar para progenitores interneurônio ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando através do nosso sistema de dupla repórter, aumenta muito a capacidade de gerar distintas progenitores e seus descendentes.

<table><tbody><tr><td>Sistema de filtro a vácuo de topo de garrafa</td> Tubo <td>de ensaio de CLS430769</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>com tampa de pressão de filtro de células</td><td>ThermoFisher</td><td>Corning 352235</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos embrionários de camundongo (CF-1 MEF IRR 7M)</td><td>MTI-Globalstem</td><td>GSC-6101G</td><td>1 frasco de 7M MEFs é suficiente para quatro placas TC de 10 cm. Referências: 29,35</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150H</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>Ant-pm-2</td><td>Também conhecido como agente antimicrobiano. Não filtre com mídia base -- adicione após a filtragem. Referências: 9,11,36,37</td></tr><tr><td>N2 suplemento-B</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7156</td><td>Não filtre com mídia base -- adicione após a filtração</td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td>Também conhecido como L-alanina-L-glutamina. Referências: 9,11,38,39</td></tr><tr><td>KnockOut Reposição de Soro (KSR)</td><td>ThermoFisher</td><td>10828028</td><td>Também conhecido como suplemento médio sem soro. Referências: 9,11</td></tr><tr><td>L-glutamina (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>ThermoFisher</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td>Também conhecido como DMEM não contendo glutamina. Referências: 9,11</td></tr><tr><td>Hyclone FBS</td><td>VWR</td><td>82013-578</td><td>Também conhecido como FBS de grau de células estaminais. Referências: 9,11</td></tr><tr><td>Placa tratada para cultura de tecidos (10 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri estéril não aderente (10 cm)</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>Fator inibidor da leucemia (mLIF)</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Não congele, armazene a 4'C. Referências: 9,11</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Solução de gelatina a 0,1%</td><td>ATCC ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td>Também conhecido como reagente de dissociação celular sem tripsina. Referências: 9,11</td></tr><tr><td>RQ1 DNase livre de RNase</td><td>Promega</td><td>M610A</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074</td><td>Ressuspender em DMSO e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>XAV939</td><td>Stemgent</td><td>04-0046</td><td>Ressuspender em DMSO e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>rhFGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Ressuspende em PBS com 0,1% BSA e armazena a -80'C em alíquotas de uso</td></tr><tr><td>único rhIGF-2</td><td>R& D Systems</td><td>291-G1</td><td>Ressuspenda em PBS com 0,1% BSA e armazene a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>Inibidor de ROCK (Y-27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>Ressuspenda em DMSO e armazene a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>Agonista suavizado (SAG)</td><td>Millipore</td><td>566660-1MG</td><td>Ressuspenda em H20 e armazene a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>rm Sonic Hedgehog/SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-025</td><td>Ressuspenda em PBS com 0,1% BSA e armazene a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr><tr><td>PKC&zeta; Inibidor de pseudosubstrato, Miristoilado</td><td>EMD Millipore</td><td>539624</td><td>ressuspender em H20 e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único</td></tr></tbody></table>

diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em cortical interneurônio precursores

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

Gabaérgica interneurônios corticais são uma população heterogênea de células que desempenham um papel crítico em regular a saída de excitatórios neurônios piramidais, bem como sincronizar as saídas dos conjuntos de neurônio piramidal. Déficits na função interneurônio têm sido implicados em uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e epilepsia. A derivação de interneurônios corticais de células-tronco embrionárias não só permite o estudo de seu desenvolvimento e função, mas fornece insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese de distúrbios relacionados com interneurônio corticais. Interneurônios também tem a notável capacidade de sobreviver, migrar e integrar acolhimento circuitos corticais pós-transplante, tornando-os candidatos ideais para uso em terapias baseadas em células. Aqui, apresentamos um escalável, altamente eficiente e modificado do embryoid corpo-a-monocamada método para a determinação dos progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Usando uma linha de mESC de repórter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolado através de fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Nós também fornecemos métodos para enriquecer para parvalbumin (PV) ou somatostatina subgrupos de interneurônio (SST), que pode ser útil para estudar os aspectos de determinação de destino ou para uso em aplicações terapêuticas que se beneficiariam de interneurônio subgrupo enriquecido transplantes.

O protocolo descrito neste documento é uma versão modificada de nossos protocolos publicados15,16,17 e foi otimizado para uso com nossa linha de dual-repórter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Adicionando o inibidor de Wnt Antônio-939 de DD0-5, combinado com o re-chapeamento no DD8, alcançaremos a indução de Nkx2.1 robusta, onde mais de 50% de todos os núcleos DAPI + na cultura são também Nkx2.1 ex...

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar progenitores de interneurônios corticais em precursores de interneurônios pós-mitóticos para células-tronco embrionárias de camundongos usando um corpo embrióide modificado para o método de monocamada. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como como os subtipos de interneurônios corticais alcançam seus destinos individuais durante o desenvolvimento. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração eficiente de progenitores interneurônios que expressam Nkx2.1, bem como métodos para enriquecer os subgrupos de interneurônios de parvalbumina ou somatostatina.Para iniciar este procedimento, coloque células alimentadoras de MEF mitoticamente inativas em meio MEF em placas tratadas com cultura de tecidos. Aguarde pelo menos 12 horas para que eles se acomodem em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius antes de plaquear os mESCs. Se não for usado imediatamente, substitua a mídia MEF a cada três dias.Em seguida, adicione mESCs contendo fator inibidor de leucemia de camundongo às placas MEF. Incube as células a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Passe mESCs usando tripsina-EDTA quando o prato se tornar 70 a 80% confluente e mantenha os mESCs em uma camada alimentadora de MEF em meio mESC para manter a pluripotência.Antes de iniciar a diferenciação, passe as células pelo menos uma vez em placas revestidas de gelatina sem MEFs para diluí-las. Para fazer isso, prepare placas revestidas de gelatina adicionando 0,1% de gelatina e PBS com cálcio e magnésio a uma placa tratada com cultura de tecidos e incube a 37 graus Celsius por pelo menos 1 hora. Coloque 1,5 a duas vezes 10 elevado à sexta célula em cada placa de dez centímetros e deixe-as expandir por dois dias antes de iniciar a diferenciação.No DD0, após as mESCs terem crescido nas placas revestidas de gelatina por dois dias, aspire o meio e lave as células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione tripsina-EDTA suficiente para cobrir a superfície das placas. E coloque as células de volta na incubadora a 37 graus Celsius por quatro minutos.Após quatro minutos, extinguir a tripsina-EDTA usando duas vezes o volume de meio mESC. Transferir as células para um tubo de centrifugação de tamanho adequado e centrifugar as células a 200 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, remova o tubo e aspire o meio sem perturbar o pellet.Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio KSR-N2. Posteriormente, meça a concentração celular usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado. Comece a cultivar as células como corpos embrióides adicionando 75.000 células por mililitro em meio KSR-N2 nas placas de cultura de tecidos não aderentes.E incubá-los a 37 graus Celsius. No DD1, prepare-se para o pouso celular revestindo as placas tratadas com cultura de tecidos com poli-L-lisina por pelo menos uma hora ou durante a noite a 37 graus Celsius. Em DD2, aspire a poli-L-lisina e cubra as placas com laminina durante a noite a 37 graus Celsius.No DD3, antes de iniciar a dissociação da EB, aspire a laminina e deixe as placas secarem completamente em uma capa de cultura de tecidos. Em seguida, transfira os EBs com o meio para um tubo de 15 mililitros e centrifugue por três a quatro minutos a 15 vezes g ou até que os EBs estejam peletizados. Aspire o meio e adicione três mililitros de solução de descolamento celular contendo DNase.Em seguida, incube a amostra a 37 graus Celsius por 15 minutos. Agite suavemente o tubo a cada três minutos para ajudar na dissociação EB. Quando os EBs não estiverem mais visíveis ou tiverem decorrido 15 minutos, adicione seis mililitros de KSR-N2 contendo DNase e centrifugue por cinco minutos a 200 vezes g.Em seguida, coloque as células em KSR-N2 contendo LDN193189, XAV939, e o inibidor ROCK, Y27632, em 4,5 a cinco vezes dez elevado ao quarto centímetro quadrado. No DD5, troque a mídia com KSR-N2 contendo FGF2, IGF1 e SSH. Em seguida, prepare as placas de cultura de tecidos para replaqueamento no dia 8, usando as instruções descritas nos procedimentos em DD1 e DD2.No DD7, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2, IGF1 e SHH. No DD8, recoloque as células recolocando-as das placas com tripsina-EDTA por cinco minutos a 37 graus Celsius. Extinguir tripsina-EDTA usando duas vezes seu volume com KSR-N2.E centrifugue a 200 vezes g por cinco minutos. Filtre as células através de um tubo de filtro de 40 mícrons para remover quaisquer grumos. Em seguida, replaquear as células a 250.000 células por centímetro quadrado em N2-KSR contendo FGF2, IGF1 e Y27632 com SHH.No DD10, troque a mídia por KSR-N2 contendo SHH. Lave as células uma vez com PBS sem cálcio e magnésio e adicione reagente de dissociação celular pré-aquecido e sem tripsina, contendo DNase às células. Coloque-os na incubadora a 37 graus Celsius por 10 a 30 minutos ou até que as células se desprendam.Em seguida, bata suavemente nas placas a cada cinco minutos para ajudar na dissociação. No DD5, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2 e IGF1. Em seguida, prepare as placas de cultura de tecidos para replaqueamento em DD8.No DD7, troque a mídia por KSR-N2 contendo FGF2 e IGF1. No DD8, replaquear as células com agonista suavizado e adicionar inibidor de PKC atípico. No DD10, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi.No DD11, desconecte as células das placas para FACS. Se as células não foram destacadas para FACS em DD11, troque de mídia em DD12 por KSR-N2 contendo aPKCi. No DD14, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi.E no DD16, troque a mídia por KSR-N2 contendo aPKCi. Em seguida, no DD17, colete as células positivas Nkx-2.1:mCherry. Aqui são mostradas as imagens representativas de imunocoloração para Nkx2.1, Nkx2.1:mCherry e Lhx6:GFP de uma cultura de diferenciação no dia 12.Observe que essas imagens são canais sobrepostos do mesmo campo de visão. Este gráfico mostra a quantificação da porcentagem média de núcleos positivos para DAPI que expressam Nkx2,1 em DD12 em cultura. E este é um gráfico FACS representativo, demonstrando as quatro populações de células diferentes que podem ser isoladas usando nossa linha mESC repórter dupla.Observe que mCherry está no eixo x e GFP está no eixo y. Assim, a caixa superior direita representa as células que são duplamente positivas para mCherry-GFP. Aqui está o curso de tempo da indução de Nkx2.1: mCherry e Lhx6: GFP de DD6 a 16, expresso como a porcentagem de células em cultura que são apenas expressas em mCherry, apenas expressas em GFP ou co-expressas em mCherry-GFP.Uma vez dominado, este protocolo pode ser concluído em 17 dias do início ao fim, se executado corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de sempre começar com células-tronco pleuripotentes, indiferenciadas e de aparência saudável. Após este procedimento, outros métodos, como transplante em neocórtex de camundongo neonatal ou adulto, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a determinação do destino do interneurônio ou o efeito do transplante de interneurônios na função do circuito e no comportamento animal.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência do desenvolvimento explorarem os fatores que impulsionam a determinação do destino dos interneurônios em camundongos e, por extensão, em pacientes afetados por distúrbios relacionados aos interneurônios. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como derivar progenitores que expressam Nkx2.1 e sua progênie pós-mitótica a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-cortical-interneuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este vídeo descreve o método utilizado para o isolamento de neuroprecursors desenvolvimento do córtex de ratos embrionárias. O procedimento para a remoção de embriões do útero, dissecando o tecido cortical, e digerindo o córtex cerebral isolado é mostrado.

Cultura de rato precursores das células-tronco neurais

Descrevemos uma molécula baseada em pequenas protocolo para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos em células precursoras de oligodendrócitos (OPCs). Este protocolo gera Olig2 + + NG2 OPCs com alta eficiência por 30 dias de diferenciação. Nós também descrevem um método para gerar "spiking" OPCs que pode disparar potenciais de ação.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Este vídeo demonstra a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, diretamente em células progenitoras neurais sem o uso de células alimentadoras ou quaisquer etapas intermediárias. A inibição seletiva das vias de sinalização da proteína morfogenética óssea ou BMP e do fator de crescimento transformador beta, ou TGF-β, leva à diferenciação de hESCs em células progenitoras neurais, ou NPCs.

Diferenciando células-tronco embrionárias humanas em progenitores neurais

Este vídeo apresenta um método para gerar precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos. O protocolo envolve a cultura das células-tronco em meios contendo inibidores específicos de pequenas moléculas, que facilitam a proliferação e agregação de células-tronco em corpos embrióides (EBs). Posteriormente, os EBs são dissociados com enzimas e plaqueados em poços de placa de cultura revestidos com proteínas de adesão para promover sua diferenciação...

Geração de precursores de interneurônios corticais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

Este vídeo demonstra um método para a geração in vitro de células progenitoras neurais (NPCs) a partir de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs). As mESCs são cultivadas em suspensão para formar corpos embrióides (EBs), que são então guiados para se diferenciar em NPCs por meio de tratamento com ácido retinóico em uma cultura aderente.

Uma técnica para gerar células progenitoras neurais a partir de células-tronco embrionárias de camundongos

O vídeo mostrou um método de cultura de células para diferenciar células progenitoras neurais em neurônios. Ao incubar células em um meio rico em nutrientes suplementado com fatores de crescimento, as células progenitoras amadureceram em neurônios com axônios e dendritos desenvolvidos. Um agente estabilizador garantiu a viabilidade celular e protegeu contra danos oxidativos durante todo o processo de diferenciação.

Diferenciação de células progenitoras neurais em neurônios

Este vídeo demonstra uma técnica para diferenciação de células-tronco embrionárias em uma população em rede de neurônios com sinapses funcionais. Ele descreve as etapas envolvidas na diferenciação de células-tronco embrionárias em neurônios, indução da formação de redes neuronais e enriquecimento da cultura com neurônios em rede.

Diferenciando células-tronco embrionárias de camundongos em uma população de neurônios em rede

Este protocolo descreve em detalhes o método para gerar progenitores neurais a partir de células-tronco embrionárias usando um método de monocamada sem soro. Esses progenitores podem ser usados para derivar tipos de células neurais maduras ou para estudar o processo de especificação neural e são passíveis de escalonamento de formato multipoço para triagem de compostos.

Diferenciação Neural of Mouse Células-Tronco Embrionárias em soro livre de cultura em monocamada

Aqui, estabelecemos um método de baixo custo e fácil de operar que direciona a diferenciação rápida e eficiente das células-tronco embrionárias para os neurônios. Este método é adequado para popularização entre laboratórios e pode ser uma ferramenta útil para a pesquisa neurológica.

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.

Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato

Aprenda a gerar progenitores de interneurônios corticais a partir de células estaminais embrionárias de rato usando método modificado de corpos embrioides. Esta técnica permite estudar determinação de destino celular e aplicações terapêuticas em neurociência.

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

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