Name: Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-06T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Aprenda a síntese combinatória de filmes e nanopartículas de polianidrida biodegradável com detecção de liberação de proteínas em alta vazão. Este método acelera o desenvolvimento de biomateriais para liberação controlada de fármacos.

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Os autores reconhecem o Prêmio ONR MURI-(NN00014-06-1-1176) e os EUA Army Medical Research e de Material Command (Grant No. W81XWH-10-1-0806) de apoio financeiro. Este material é baseado num trabalho apoiado pela National Science Foundation, Grant CEE n º 0552584 e 0851519.

1. Combinatória de Polímeros Síntese Library (Variando em Polymer Química) - veja a Figura 1 para a configuração Robotic <ol><li> Dissolver cada monómero na apropriada (concentração = 25 mg / ml) com solvente e carregar cada para uma seringa de 10 cc de gás apertado. </li><li> Anexar os solventes tubos capilares de bloqueio lure resistentes ao final de cada seringa. </li><li> Coloque as seringas nas bombas de seringa (New Era bombas de seringa Programáveis) e bloquear a posição. </li><li> Definir os actuadores lineares (Zaber) para a posição de partida. </li><li> Usando pinças do suporte do anel, a posição final de ambos os tubos capilares para dentro do frasco de partida / poço de deposição de monómero. </li><li> Inicie o programa de LabVIEW, que bombeia volumes variáveis ​​de cada monómero em cada poço, dependendo da composição do copolímero pretendido. Isto é conseguido no programa, instruindo o actuador do eixo Z para baixar os tubos capilares para dentro do frasco / recipiente e, em seguida, cada bomba para distribuir o volume desejado. Next, o programa instrui o Z-actuador para retornar à sua posição de repouso e os X e Y actuadores para mover para a posição seguinte do frasco / recipiente. Esta é realizada até que cada poço tem o volume desejado de monómero depositado nele. </li><li> Na sequência de deposição de monómero, a biblioteca de monómero multi-poços ou multi-frasco é transferido para um forno a vácuo pré-aquecido e incubou-se sob vácuo, durante a duração da reacção de polimerização de condensação. Para CPH: SA síntese a reacção é realizada a 180 ° C, 0,3 torr, durante 1,5 horas, mas estas condições de reacção irá variar entre os diferentes sistemas de polímeros. </li></ol> 2. Combinatória em branco e Proteína-carregado nanopartículas de polímeros e Fabricação Film Library - veja a Figura 1 para a instalação robótica <ol><li> A seringa na bomba de seringa em primeiro lugar programável é preenchido com um solvente (biblioteca em branco) ou com um solvente de proteínas dispersas nele (proteína-loaded biblioteca), enquanto a seringa na segunda seringabomba é deixada em branco. Tubos para o fabrico de nanopartículas no porta-amostras adjacentes são preenchidos com o não-solvente (proporção de solvente para não-solvente é de 1 a 100). Para a fabricação de uma película placa multi-poços vazios é utilizado em vez dos tubos de amostra no suporte adjacente. </li><li> Utilizando o programa de LabVIEW, o solvente é depositado em todos os frascos de polímero / poços da biblioteca (concentração = 20 mg / ml) e incubou-se durante 1-5 minutos. Um passo opcional sonicação (30 seg a 40 Hz) pode ser introduzido para assegurar a dissolução completa do polímero. </li><li> Em seguida, ao iniciar um programa LabVIEW separado, a amostra é retirada para a seringa vazia, e depositados na sua correspondente tubo de poço não solvente (nanopartículas) ou vazio (filmes) no porta-amostras adjacentes. </li><li> Este processo realiza-se, para cada composição da biblioteca de polímero discretas. </li><li> A nanopartícula ou biblioteca de película é então colocado numa câmara de vácuo para a remoção de solvente e não-solvente (a libra nanopartículary também podem ser recuperados através de filtração por vácuo). </li></ol> 3. Alto rendimento de Lançamento Cinética Proteína <ol><li> Para investigar high-throughput cinéticas de libertação de proteína a partir de uma biblioteca de polímeros, de 96 de profundidade welled (2 ml / poço), a placa de polipropileno é modificado de tal modo que a parte superior de 1/3 a parede do poço, em colunas adjacentes (ex: A e B, C e D, E e F, G e H) é removido para as cavidades adjacentes. Os filmes carregados de proteína devem ser fabricados em ou as nanopartículas transferido para esta placa para realizar estudos de alto rendimento de libertação cinética. As amostras de proteína-carregado de nanopartículas ou película tem de ser colocado apenas em um poço das colunas adjacentes (ex: A, C, E e G). Veja a Figura 4 para detalhes. </li><li> Após a transferência das nanopartículas de libertação da placa de fundo 96-welled, as partículas são deixadas assentar. Tampão PBS (0,1 mM, pH 7,4) é lentamente adicionada a cada poço de amostra (colunas A, C, E e G) e, em seguida, a cada poço vizinho (colunas B, D, F e H), até que os poços são cheios e o tampão é de fluxo livre entre os poços adjacentes. Para as nanopartículas, este processo necessita de ser efectuado com cuidado extra para assegurar que as partículas permaneçam no fundo do poço de amostra (colunas A, C, E e G) e não transferido para a libertação contígua bem (colunas B, D, F , e H). Em alguns casos, a centrifugação é necessária para localizar as amostras de nanopartículas na parte inferior do poço de amostra (colunas A, C, E e G). </li><li> Em seguida, a placa de libertação é fechado com uma tampa e colocada à temperatura desejada (isto é, 37 ° C), sob agitação, durante a duração da experiência. </li><li> Em pontos de tempo incremental (ie 0,04, 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 19, 24, e 30 dias) a quantidade de proteína liberada conjugado com fluorocromo é quantificado utilizando um scanner plano Typhoon 9400 Fluorescente ( GE Healthcare). O prato de liberação é colocada sobre a superfície do scanner, digitalizados utilizando o laser de excitação e emissão adequados filters, e a intensidade de fluorescência da proteína libertada nas cavidades de libertação (colunas B, D, F e H) é quantificado (Quant Imagem). Sugere-se que os padrões de concentrações conhecidas de proteína ser incluídos na placa de poço para calcular a quantidade de proteína e de contabilidade para a têmpera fluorocromo. </li></ol> 4. Resultados representativos Após o fabrico da biblioteca de polímeros, caracterização foi efectuada com 1 H RMN, GPC, e FTIR para validar este método combinatorial 1,7,8,11. Gama de pesos moleculares de 10,000-20,000 g / mol, índice varia polidispersão 1,5-3,0, e composição química tem sido mostrado para ser preciso e de acordo com métodos convencionais de síntese de polianidrido 12-15. Do mesmo modo, as imagens de SEM das bibliotecas de nanopartículas apresentaram morfologia superficial similar, tamanho e distribuição de tamanho como a de nanopartículas convencionalmente fabricadas 2. Proteína de liberação kinetics a partir de nanopartículas de polianidrido ou películas é levada a cabo numa placa modificada bem como descrito anteriormente 1. Os resultados revelaram uma libertação de ordem aproximada de zero, com ou sem uma explosão depende da carga de proteína e da química do polímero (Figuras 2 e 3) 1,12,14,16. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig1.jpg" /> Figura 1. Combinatorial película de polímero e o aparelho de fabricação de nanopartículas. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig2.jpg" /> Figura 2 High-throughput libertação de Texas Red albumina de soro bovino (TRBSA) a partir de um CPH:. SA biblioteca de nanopartículas de polímero. SA químicos ricos polímero encapsulado TRBSA libertar o mais rapidamente, ao passo que produtos químicos CPH-ricos polímero libertar o mais lento. As barras de erro representam desvio padrãoção e n = 4. Reproduzido com a permissão de Petersen et. al. 1. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig3.jpg" /> Figura 3 High-throughput libertação de Texas Red albumina de soro bovino (TRBSA) a partir de um CPTEG:. CPH biblioteca película de polímero. Químicas CPTEG ricos polímero encapsulado TRBSA libertar o mais rapidamente, ao passo que produtos químicos CPH-ricos polímero libertar o mais lento. As barras de erro representam o desvio padrão e n = 3. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3882/3882fig4.jpg" /> Figura 4. Imagem mostrando dois poços vizinhos &quot;antes&quot; e modificação &quot;depois&quot; na placa de polipropileno de 96 profundidade de poços. A modificação da imagem &quot;depois&quot; da direita, também descreve a adição de uma película de polímero (parte inferior do lado esquerdo poço) com uma molécula fluorescente encapsuladoser libertado entre os dois poços numa solução tampão. A molécula fluorescente libertado é então detectada no muito bem.

<ol><li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+high-throughput+method+to+study+in+vitro+protein+release+from+polymer+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel, high-throughput method to study in vitro protein release from polymer nanospheres.</a> J. Comb. Chem. 12, 51-56 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Vogel, B. M., Cabral, J. T., Eidelman, N., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+synthesis+and+high-throughput+dissolution+testing+of+biodegradable+polyanhydride+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Parallel synthesis and high-throughput dissolution testing of biodegradable polyanhydride copolymers.</a> J. Comb. Chem. 7, 921-928 (2005).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+evaluation+of+in+vivo+biodistribution+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">High-throughput evaluation of in vivo biodistribution of polyanhydride nanoparticles.</a> Adv. Healthcare Mater. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+design+of+biomaterials+for+drug+delivery%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Combinatorial design of biomaterials for drug delivery: opportunities and challenges.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 5, 837-846 (2008).</li>
<li>Petersen, L. K., Oh, J., Sakaguchi, D. S., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydride+films+promote+neural+stem+cell+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydride films promote neural stem cell adhesion and differentiation.</a> Tissue Eng. 17, 2533-2541 (2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Thorstenson, J. B., Petersen, L. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial%2Fhigh-throughput+methods+for+the+determination+of+polyanhydride+phase+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Combinatorial/high-throughput methods for the determination of polyanhydride phase behavior.</a> J. Comb. Chem. 11, 820-828 (2009).</li>
<li>Xue, L., Petersen, L., Broderick, S., Narasimhan, B., Rajan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+factors+controlling+protein+release+from+combinatorial+biomaterial+libraries+via+hybrid+data+mining+methods%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb.+Sci%22%5BJournal%5D)">Identifying factors controlling protein release from combinatorial biomaterial libraries via hybrid data mining methods.</a> ACS Comb. Sci. 13, 50-58 (2011).</li>
<li>Adler, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell-based+screening+of+biodegradable+polyanhydride+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Through.+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell-based screening of biodegradable polyanhydride libraries.</a> Comb. Chem. High Through. Screen. 12, 634-645 (2009).</li>
<li>Determan, A. S., Trewyn, B. G., Lin, V. S., Nilsen-Hamilton, M., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation%2C+stabilization%2C+and+release+of+BSA-FITC+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Encapsulation, stabilization, and release of BSA-FITC from polyanhydride microspheres.</a> J. Control. Release. 100, 97-109 (2004).</li>
<li>Determan, A. S., Wilson, J. H., Kipper, M. J., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+stability+in+the+presence+of+polymer+degradation+products%3A+consequences+for+controlled+release+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Protein stability in the presence of polymer degradation products: consequences for controlled release formulations.</a> Biomaterials. 27, 3312-3320 (2006).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Carrillo-Conde, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+into+amphiphilic+polyanhydride+microparticles+stabilizes+Yersinia+pestis+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Encapsulation into amphiphilic polyanhydride microparticles stabilizes Yersinia pestis antigens.</a> Acta Biomater. 6, 3110-3119 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O conhecimento das condições de síntese necessários e as temperaturas de transição vítrea (T g s) dos polímeros a ser sintetizados são essenciais para o fabrico de biblioteca. Se o T g s estão abaixo da temperatura ambiente, o passo de fabrico de nanopartículas podem ter de ser realizado num ambiente com temperatura controlada abaixo da Tg dos polímeros. Além disso, o cuidado deve ser tomado para assegurar que todo o equipamento que entra em contato com altas temperaturas e os solventes ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Estágio motorizado XYZ: 3x T-LSM050A, 50 mm de curso por eixo </td><td> Zaber Technologies </td><td> T-XYZ-LSM050A-KT04 </td></tr><tr><td> NE-1000 bomba de seringa única </td><td> Sistemas com bombas de Época </td><td> NE-1000 </td></tr><tr><td> Pyrex * Vista * Rimless tubos de cultura de vidro reutilizáveis </td><td> Corning </td><td> 07-250-125 </td></tr><tr><td> Cubetas de vidro </td><td> Estratégias científicos </td><td> G102 </td></tr><tr><td> LabVIEW </td><td> National Instruments </td><td> 776671-35 </td></tr><tr><td> Seringas SGE gás apertado, Luer Loc </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 509507 </td></tr><tr><td> U96 Deepwell Plates 1,3 ml e 2,0 ml </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 278743 </td></tr><tr><td> Bem esteiras cap </td><td> Thermo Scientific: Nunc </td><td> 276000 </td></tr><tr><td> Tufão 9400 </td><td> GE Healthcare </td><td> 63-0055-79 </td></tr><tr><td> Whatman Grade 50 Círculos 90 milímetros </td><td> Whatman </td><td> 1450-090 </td></tr></tbody></table>

síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de cinema e bibliotecas nanopartículas

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polianidridos são uma classe de biomateriais com excelente biocompatibilidade e capacidade de entrega de drogas. Embora tenham sido estudados extensivamente com convencional de um exemplo de-a-um-tempo técnicas de síntese, uma abordagem mais recente de alto rendimento tem sido desenvolvido permitindo a síntese e teste de grandes bibliotecas de polianidridos 1. Isto irá facilitar a optimização mais eficiente e processo de concepção desses biomateriais para aplicações de entrega de drogas e vacinas. O método, neste trabalho descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas. Neste método roboticamente operado (Figura 1), os actuadores lineares e bombas de seringa são controlados por LabVIEW, que permite que um protocolo de mãos-livres automatizado, eliminando o erro do utilizador. Além disso, este método permite a fabricação rápida de bibliotecas de micro-escala de polímero, vermelhoucing o tamanho do lote, enquanto que resulta na criação de sistemas de multivariante polímero. Esta abordagem combinatória para a síntese do polímero facilita a síntese de até 15 diferentes polímeros em uma quantidade equivalente de tempo que seria necessário para sintetizar um polímero convencional. Além disso, a biblioteca combinatória de polímero pode ser fabricada em geometrias em branco ou proteína-carregado incluindo filmes ou nanopartículas mediante dissolução da biblioteca de polímero em um solvente e precipitação num não-solvente (por nanopartículas), ou por secagem sob vácuo (para filmes). Durante o carregamento de uma proteína conjugados com fluorocromos para as bibliotecas de polímeros, a cinética de libertação de proteína podem ser avaliadas em alto rendimento, utilizando um método de detecção de fluorescência de base (Figuras 2 e 3), conforme descrito anteriormente 1. Esta plataforma combinatória foi validado com métodos convencionais de 2 e a película de polianidrido e bibliotecas de nanopartículas foram caracterizadas com <sup&gt; 1 H NMR e FTIR. As bibliotecas foram pesquisadas quanto a cinética de libertação da proteína, estabilidade e antigenicidade; in vitro de toxicidade celular, citocinas, produção superfície marcador de expressão, adesão, proliferação e diferenciação, e na biodistribuição in vivo e mucoadesão 1-11. O método desenvolvido aqui combinatória permite alto rendimento de síntese de polímeros e fabrico de proteína-carregado de nanopartículas e bibliotecas de película, a qual pode, por sua vez, ser rastreadas in vitro e in vivo para a optimização do desempenho do biomaterial.

O método descreve a síntese combinatória de película de polianidrido biodegradáveis ​​e bibliotecas de nanopartículas e de detecção de elevado débito de libertação de proteínas a partir destas bibliotecas.

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polianidridos são uma classe de biomateriais com excelente biocompatibilidade e capacidades de entrega de fármacos. Embora tenham sido extensamente estudados com...

Este vídeo descreve a síntese combinatória de bibliotecas de filmes e nanopartículas de polianidrido biodegradável e a detecção de alto rendimento da liberação de proteínas a partir dessas bibliotecas. Primeiro, um aparelho automatizado de deposição de alto rendimento é usado para depositar uma matriz com diversidade composicional de monômeros em cubetas de vidro. Uma reação de policondensação é realizada a 180 graus Celsius e 0,3 torr por 1,5 hora.Essas condições de reação são específicas para a síntese do polímero anidrido poli C-P-H-S-A. Utilizando o aparelho de deposição automatizado, o solvente e quaisquer componentes para encapsulação são depositados nas cubetas contendo a biblioteca de polímeros. Pode-se aplicar sonicação para garantir a dissolução completa do polímero e a dispersão uniforme dos componentes adicionais.Em seguida, o polímero dissolvido é transferido para um tubo contendo um antissolvente para fabricar a biblioteca de nanopartículas por nanoprecipitação. As nanopartículas são recuperadas por secagem a vácuo ou filtração e, em seguida, transferidas para uma placa modificada de 96 poços com liberação controlada. Por fim, a biblioteca carregada com proteína é incubada em condições fisiológicas e a cinética de liberação da proteína é avaliada utilizando um método de detecção fluorescente por espaçamento.No final, podem ser obtidos resultados que mostram a cinética de liberação de proteínas em função das propriedades do polímero ou das condições do ambiente de liberação. A principal vantagem dessa abordagem em relação a outras técnicas convencionais de análise de uma amostra por vez é que somos capazes de sintetizar múltiplas amostras simultaneamente. Essas amostras podem então ser triadas em alto rendimento quanto às interações proteína-polímero, célula-polímero ou polímero-hospedeiro.Isso então acelera o projeto e desenvolvimento racionais desses biomateriais para liberação de fármacos e engenharia de tecidos. A demonstração do procedimento será feita por La Tricia Peterson, uma pós-operatória do meu laboratório. Nesta seção do vídeo, um aparelho de deposição de alto rendimento Hyatt é utilizado para depositar uma biblioteca de monômeros com variação composicional após a síntese do polímero.Este aparelho é utilizado para fabricar uma biblioteca combinatória de filmes poliméricos ou nanopartículas vazios ou carregados com proteínas. A plataforma automatizada consiste em duas bombas de seringa programáveis e três atuadores lineares conectados em série a um computador. O software LabVIEW é usado para enviar comandos às bombas de seringa e aos atuadores.Seringas gast tight de 10 cc são carregadas nas bombas de seringa com tubos capilares de metal conectados por encaixes tipo lure lock, que dispensam as soluções poliméricas em cubetas de vidro. Nesta demonstração, ácido seícico ou SA será usado com um seis Biss para oxi heano ou CPH para produzir uma biblioteca de nanopartículas encapsulando albumina sérica de bovino marcada com Texas Red. As instruções deste vídeo e dos documentos complementares podem ser adaptadas para fabricar e testar uma ampla variedade de bibliotecas de filmes poliméricos e nanopartículas.Para sintetizar as bibliotecas, comece dissolvendo cada monômero e clorofórmio em uma concentração final de 25 miligramas por mililitro em um frasco de vidro. Em seguida, carregue cada solução em uma seringa gastight de 10 cc aspirando a solução pela extremidade com trava do tipo lure lock da seringa. Remova todas as bolhas de ar.Em seguida, acople o tubo capilar de aço inoxidável com trava resistente ao solvente à extremidade da seringa. Prenda os tubos capilares em grampos e fixe-os a um suporte com haste. Em seguida, posicione as extremidades de ambos os tubos capilares dentro do vete inicial.Para a deposição do monômero. Coloque as seringas nas bombas de seringa programáveis e fixe-as na posição no software de visualização do laboratório. Defina os atuadores lineares na posição inicial no software.Inicie a deposição automatizada dos monômeros de SA e CPH em cubetas de vidro ao longo dos eixos x, y e Z. Atuadores posicionarão corretamente os tubos capilares em cada Q, e bombas injetarão volumes programados de cada monômero, criando uma biblioteca de monômeros com composição variável. Após a deposição dos monômeros.Transfira a biblioteca de monômeros para uma estufa a vácuo pré-aquecida e incube a 180 graus Celsius e 0,3 torr por 1,5 hora para permitir a polimerização por condensação. Após a incubação, a fabricação da biblioteca de polímeros é concluída. Em seguida, são geradas nanopartículas poliméricas carregadas com proteína.Consulte o protocolo complementar para a fabricação de uma biblioteca de filmes poliméricos carregados com proteína para a produção de uma biblioteca de nanopartículas carregadas com proteína. Adicione a proteína, neste caso, albúmina sérica bovina marcada com Texas red, ao solvente apropriado, que deve ser capaz de dissolver a biblioteca polimérica. Neste caso, utiliza-se diclorometano numa concentração de dois miligramas por mililitro.Encha a seringa de 10 cc com o solvente contendo BSA marcado com Texas Red e coloque-a na primeira bomba de seringa. Em seguida, coloque uma seringa limpa e vazia de dois cc na segunda bomba de seringa e posicione os tubos contendo 15 mililitros de um não solvente, neste caso pentano, no suporte de tubos adjacente à plataforma de frascos. A seguir, no laboratório, no software, inicie o processo automatizado de deposição de solvente selecionando o programa.Após o início do programa, o solvente é depositado nas cubetas contendo a biblioteca de polímeros, resultando em uma concentração de polímero de 20 miligramas por mililitro. Quando todo o solvente tiver sido depositado, deixe-o dissolver o polímero por um a cinco minutos. Em seguida, realize uma etapa opcional de homogeneização para garantir a completa dissolução do polímero e uma dispersão uniforme da proteína.Em seguida, inicie o programa de transferência de amostra no LabVIEW. Cada amostra de polímero dissolvido na biblioteca é então aspirada para dentro da seringa vazia e dispensada no tubo correspondente contendo o não solvente no porta-amostras. Após a transferência de cada amostra, recupere as nanopartículas carregadas com proteína colocando a biblioteca de nanopartículas em uma câmara de vácuo a 10 milímetros de mercúrio de vácuo, ou utilizando filtração a vácuo até a remoção do solvente.Para investigar a liberação da BSA encapsulada, comece com uma placa de polipropileno de 96 poços profundos que tenha sido modificada pela remoção da metade superior de cada parede do poço em cada coluna adjacente alternada na placa. A remoção da parte superior de cada poço entre as colunas A e B, C e D, E e F, G e H permite o fluxo de líquido entre cada par de poços adjacentes quando preenchidos até o volume total de transferência. Adicione padrões de BSA marcada com Texas Red variando de 1000 a 10 microgramas por mililitro na placa de 96 poços profundos.Estes serão utilizados para calcular a quantidade de proteína e também levarão em consideração o quenching do fluorocromo. Reconstitua a massa desejada de nanopartículas em tampão PBS, em seguida sonique para dispersar uniformemente as partículas. Em seguida, transfira a biblioteca de nanopartículas para a placa de 96 poços profunda e aguarde até que as amostras sedimentem no fundo da placa. Depois, utilizando uma pipeta, encha lentamente todos os poços adjacentes com tampão PBS até um quarto de polegada da borda superior do poço.Deve haver quantidade suficiente de tampão nos poços adjacentes para que ele flua livremente entre os poços. Em seguida, feche a placa de liberação com a tampa e coloque-a a 37 graus Celsius sob agitação. Durante todo o experimento, em intervalos de tempo progressivos, utilize um scanner fluorescente plano Typhoon 9.400 para escanear a placa usando os filtros apropriados de excitação, laser e emissão.Após a leitura, utilize um software de quantificação de imagem para quantificar a quantidade de proteína conjugada ao fluorocromo liberada em cada tempo. Neste caso, a BSA marcada com Texas Red foi encapsulada em uma biblioteca de nanopartículas poliméricas sintetizadas a partir dos monômeros SA e CPH, conforme descrito neste vídeo, para determinar a cinética de liberação da proteína em função da química do polímero. As nanopartículas carregadas com proteína foram incubadas a 37 graus Celsius durante um mês, período no qual foram obtidas leituras fluorescentes em pontos temporais incrementais para quantificação da liberação da proteína.Como mostrado aqui, este método de alto rendimento foi utilizado para determinar a cinética de liberação da BSA marcada com Texas Red a partir de uma biblioteca de nanopartículas de polianidrido A-C-P-H-S-A. Foram observadas tendências dependentes da composição química, com aumento nas taxas de liberação a partir das químicas de filme de Sarich. Resultados semelhantes foram obtidos ao utilizar ensaios padrão de quantificação de proteínas.Em um experimento separado, a liberação da BSA marcada com Texas Red a partir de bibliotecas de filmes de polianidrido CPH-CPT foi avaliada, conforme mostrado aqui, sendo observadas cinéticas de liberação próximas à ordem zero, com os filmes ricos em cpeg liberando a proteína mais rapidamente, apresentando potenciais aplicações no campo médico como dispositivos biodegradáveis de liberação de fármacos. Esses resultados indicam que o perfil de liberação desejado de um fármaco terapêutico ou antígeno vacinal pode ser controlado pela alteração da química do polímero. Após este procedimento, outros métodos combinatórios foram desenvolvidos para investigar áreas como estabilidade proteica, toxicidade celular, ativação celular e biodistribuição InVivo.Esses aspectos são importantes para o projeto racional de biomateriais para liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Não se esqueça de usar EPIs adequados e praticar procedimentos laboratoriais seguros durante todo este protocolo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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