Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Este vídeo descreve a síntese combinatória de filmes de polianidrido biodegradáveis e bibliotecas de nanopartículas, e a detecção de alto rendimento da liberação de proteínas dessas bibliotecas. Primeiro, um aparelho de deposição automatizado de alto rendimento usado para depositar uma matriz composicionalmente diversa de monômeros em cubetas de vidro. Uma reação de policondensação é realizada a 180 graus Celsius e 0,3 tor por 1,5 horas.

Essas condições de reação são específicas para a síntese de polímeros de polianidrido C-P-H-S-A. Usando o aparelho de deposição automatizado, o solvente e quaisquer componentes para encapsulamento são depositados nas cubetas contendo a biblioteca de polímeros. A sonicação pode ser administrada para garantir a dissolução completa do polímero e a dispersão uniforme dos componentes adicionais.

Em seguida, o polímero dissolvido é transferido para um tubo de solvente não ss para fabricar a biblioteca de nanopartículas por nano precipitação. As nanopartículas são recuperadas por secagem a vácuo ou filtração e, em seguida, transferidas para uma placa modificada de 96 bem liberada. Finalmente, a biblioteca carregada de proteínas é incubada em condições fisiológicas e a cinética de liberação de proteínas é avaliada usando um método de detecção de espaço fluorescente.

Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a cinética de liberação de proteínas em função das propriedades do polímero ou das condições do ambiente de liberação. A principal vantagem dessa abordagem sobre outras técnicas convencionais de uma amostra por vez é que somos capazes de sintetizar várias amostras simultaneamente. Essas amostras podem então ser rastreadas em alto rendimento para interações de polímero de proteína, polímero celular ou polímero hospedeiro.

Isso acelera o projeto racional e o desenvolvimento desses biomateriais para administração de medicamentos e engenharia de tecidos. Demonstrando o procedimento estará La Tricia Peterson, uma pós-operatória do meu laboratório. Nesta seção do vídeo, um aparelho de deposição de rendimento Hyatt é usado para depositar uma biblioteca de monômeros variante de composição após a síntese do polímero.

Este aparelho é utilizado para fabricar uma biblioteca combinatória de filmes ou nanopartículas poliméricas em branco ou carregadas com proteínas. A plataforma automatizada consiste em duas bombas de seringa programáveis e três atuadores lineares conectados em série a um computador no computador. O software LabVIEW é usado para direcionar comandos para as bombas de seringa e atuadores.

Seringas estanques de 10 cc são carregadas nas bombas de seringa com tubos capilares de metal conectados por meio de conexões de trava de isca, que dispensam as soluções de polímero em cubetas de vidro. Nesta demonstração, o ácido séico ou SA será usado com seis Biss para oxi heano ou CPH para fazer uma biblioteca de nanopartículas encapsulando a albumina sérica do Texas Red Boan. As instruções neste vídeo e os documentos que o acompanham podem ser adaptados para fabricar e testar uma ampla gama de filmes de polímeros e bibliotecas de nanopartículas.

Para sintetizar as bibliotecas, comece dissolvendo cada monômero e clorofórmio em uma concentração final de 25 miligramas por mililitro em um frasco de vidro. Em seguida, carregue cada solução em uma seringa estanque de 10 cc gast, aspirando a solução através da extremidade da trava de isca da seringa. Remova todas as bolhas de ar.

Em seguida, conecte o tubo capilar de aço inoxidável com trava de isca resistente a solventes na extremidade da seringa. Prenda os tubos capilares em clamps, fixe em um suporte de anel. Em seguida, posicione a extremidade de ambos os tubos capilares no vete inicial.

Para deposição de monômeros. Coloque as seringas nas bombas de seringa programáveis e trave-as na posição no laboratório view software. Coloque os atuadores lineares na posição inicial no software.

Inicie a deposição automatizada dos monômeros SA e CPH nas cubetas de vidro nos eixos x, y e Z. Os atuadores posicionarão adequadamente os tubos capilares em cada Q, vetarão e bombearão volumes programados de cada monômero neles, criando uma biblioteca de monômeros variante de composição. Após a deposição de monômeros.

Transfira a biblioteca de monômeros para um forno a vácuo pré-aquecido e incube a 180 graus Celsius e 0,3 tour por 1,5 horas para permitir a polimerização por condensação. Após a incubação, a fabricação da biblioteca de polímeros é concluída. Em seguida, nanopartículas de polímero carregadas de proteína são geradas.

Consulte o protocolo que acompanha a fabricação de bibliotecas de filmes de polímeros carregados com proteínas para fabricar uma biblioteca de nanopartículas carregadas com proteínas. Adicione a proteína, neste caso, albumina de soro bovino vermelho do Texas ao solvente apropriado, que deve ser capaz de dissolver a biblioteca de polímeros. Aqui, o cloreto de metileno é usado na concentração de dois miligramas por mililitro.

Encha a seringa de 10 cc com solvente contendo Texas Red BSA e coloque-a na primeira bomba de seringa. Em seguida, coloque uma seringa limpa e vazia de dois cc na segunda seringa e coloque os tubos contendo 15 mililitros de um solvente nons, neste caso, pentano no suporte do tubo adjacente à plataforma do frasco. Em seguida, no laboratório, o software de visualização inicia o processo automatizado de deposição de solvente selecionando o programa.

Após o início do programa, o solvente é depositado nas cubetas que contêm a biblioteca de polímeros, resultando em uma concentração de polímero de 20 miligramas por mililitro. Quando todo o solvente tiver sido depositado, deixe-o dissolver o polímero por um a cinco minutos. Siga isso com uma distribuição opcional para garantir uma dissolução completa do polímero e dispersão uniforme de proteínas.

Em seguida, inicie o programa de transferência de amostras na visualização de laboratório. Cada amostra de polímero dissolvido na biblioteca é então retirada para a seringa vazia e dispensada em seu tubo correspondente de não solvente no porta-amostras. Uma vez que cada amostra tenha sido transferida, recupere as nanopartículas carregadas de proteínas colocando a biblioteca de nanopartículas em uma câmara de vácuo a 10 milímetros de vácuo de mercúrio ou usando filtração a vácuo até que o solvente seja removido.

Para investigar a liberação de BSA encapsulada, comece com uma placa de polipropileno de solda 96 profunda que foi modificada removendo a meia polegada superior de cada parede de poço de todas as outras colunas adjacentes na placa. A remoção do topo de cada poço entre as colunas A e B, C e DENF e GNH permite o fluxo de líquido entre cada par de poços adjacentes quando preenchidos até a transferência de volume total. Padrões BSA vermelhos do Texas variando de 1000 a 10 microgramas por mililitro na placa de 96 poços profundos.

Estes serão usados para calcular a quantidade de proteína e também serão responsáveis pela têmpera do fluorocromo, reconstituir a massa desejada de nanopartículas no tampão PBS e, em seguida, sonicar para dispersar uniformemente as partículas. Em seguida, transfira a biblioteca de nanopartículas para a placa de 96 poços profundos e espere até que as amostras se assentem no fundo da placa do poço. Em seguida, usando um pipetador, encha lentamente todos os poços adjacentes com tampão PBS até um quarto de polegada do topo do poço.

Deve haver buffer suficiente nos poços adjacentes para que flua livremente entre os poços. Em seguida, feche a placa de liberação com a tampa e coloque-a a 37 graus Celsius sob agitação. Durante o experimento em pontos de tempo incrementais, use um scanner fluorescente de mesa 9.400 Typhoon para escanear a placa usando os filtros de excitação, laser e emissão apropriados.

Após a digitalização, use o software image quant para quantificar a quantidade de proteína conjugada com fluorocromo liberada em cada liberação. Bem, o Texas Red BSA foi encapsulado em uma biblioteca de nanopartículas de polímero sintetizada a partir de monômeros SA e CPH, conforme descrito neste vídeo, para determinar a cinética de liberação de proteínas em função da química do polímero. As nanopartículas carregadas de proteínas foram incubadas a 37 graus Celsius por um mês, durante o qual foram obtidas varreduras fluorescentes em pontos de tempo incrementais para quantificação da liberação de proteínas.

Como mostrado aqui, este método de hidro rendimento foi utilizado para determinar a cinética de liberação de Texas Red BSA da biblioteca de nanopartículas de polianidrido ACPHSA. Tendências dependentes da química foram observadas com o aumento das taxas de liberação dos produtos químicos do filme Sarich. Resultados semelhantes foram obtidos ao usar ensaios de quantificação de proteínas padrão.

Em um experimento separado, a liberação de BSA do Texas Red das bibliotecas de filmes de polianidrido CPT CPH foi avaliada conforme mostrado aqui, a cinética de liberação de ordem quase zero foi observada com filmes ricos em cpeg liberando a proteína mais rapidamente com aplicações potenciais na área médica como dispositivos de administração de medicamentos biodegradáveis. Esses resultados indicam que o perfil de liberação desejado de um medicamento terapêutico ou antígeno vacinal pode ser controlado alterando a química do polímero. Após esse procedimento, outros métodos combinatórios foram desenvolvidos para investigar áreas como estabilidade proteica, toxicidade celular, ativação celular e biodistribuição InVivo.

Esses aspectos são importantes para o projeto racional de biomateriais para liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Não se esqueça de usar EPI adequado e praticar procedimentos laboratoriais seguros durante todo este protocolo.