Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Neste artigo em vídeo, descrevemos um novo protocolo hidro put para a síntese automatizada da fase de solução de oligossacarídeos e a funcionalização de nanopartículas de poli anhy. Com esses agentes direcionados à base de carboidratos, as primeiras moléculas de carboidratos são sintetizadas usando um sistema automatizado que utiliza síntese de fase de solução em vez de sintetizadores de fase sólida. Em seguida, os intermediários oligossacarídeos são purificados por florista, extração em fase sólida ou FSPE.

As moléculas de carboidratos produzidas são caracterizadas por RMN e, em seguida, são ligadas às nanopartículas de polianidrido por conjugação de carbo IDE. Finalmente, as nanopartículas funcionalizadas com carboidratos são caracterizadas por espectroscopia de fotoelétrons de raios-x e um ensaio de ácido hidro putt fenil sulfúrico. Em última análise, utilizando a metodologia hidro put descrita aqui, foram obtidas as condições de reação para otimizar a morfologia das nanopartículas e a densidade de carboidratos na superfície da partícula.

A principal vantagem deste método sobre os existentes, como a síntese de oligossacarídeos de face sólida, é que neste método usamos uma quantidade substancialmente menor de blocos de construção Neste método, normalmente usamos dois a três equivalentes em vez de 10 a 20 equivalentes. Temos a ideia para este método pela primeira vez quando demonstramos a eficácia dos efeitos de superfície, funcionalização de nanopartículas poli-hidro, usando carboidratos para direcionar os receptores ceep em células antidenting. Em seguida, queríamos projetar um sistema de alto rendimento que nos permitisse filtrar os vários parâmetros envolvidos na fabricação e aplicação desses novos transportadores.

A demonstração visual deste método é crítica porque o desenvolvimento de plataformas automatizadas para a síntese de oligossacarídeos de alto rendimento e sua ligação a partículas de polímero é uma nova área de investigação sem muita documentação disponível antes da síntese automatizada de dianoácido. Um doador de açúcar adequadamente protegido, normalmente tri cloro acetamida um aceitante principalmente em Alcon, o álcool fluorado é sintetizado na bancada e preparado em cloro metano também prepara trimetil silo, tri fluoro metano sulfonato em cloro metano, 80% de metanol e 100% de metanol. Certifique-se de que a umidade relativa na sala seja de 30% ou menos na câmara de automação.

A alta umidade é prejudicial para as reações de glicosilação. As etapas a seguir são feitas usando uma plataforma de automação. A primeira glicosilação é realizada com o doador e o álcool florista.

Uma vez feito, a molécula de açúcar resultante da etiqueta do florista é purificada pelo FSPE. O grupo de proteção temporário é então removido por sódio, óxido de metanfetamina e metanol e, mais uma vez, o produto é purificado por FSPE. Depois disso, o açúcar da etiqueta do florista é usado como aceptor e acoplado ao mesmo doador para obter o dissacarídeo, o dissacarídeo é purificado pelo FSPE para começar.

Coloque reagentes, incluindo o promotor aceitador do doador, 80% de água de metanol, 100% de metanol, óxido de metanfetamina de sódio na plataforma robótica e inicie o programa. O braço robótico retirará o doador e depois o aceitador dos frascos e os transferirá para um frasco de reação. Em seguida, a mistura de doador e aceitador é agitada por 30 minutos.

Após 30 minutos. O braço robótico transfere trimetilsilo catalítico, tri fluoro, sulfonato de metano para a mistura. A solução é então agitada por mais 30 minutos Após a agitação estar completa, o programa é pausado.

Remover uma alíquota de 10 microlitros para verificar se a reacção está completa por cromatografia em camada fina. Se a reação estiver completa, a molécula aceptora não será vista. Se a reação não estiver completa, o aceitador no TLC ainda estará visível.

Se for esse o caso, pare o programa, redefina o tempo de glicosilação em torno de 30 minutos e adicione um excesso do promotor trimetil silo, tri fluoro, sulfonato de metano. Quando a reação estiver concluída, continue com a próxima etapa. Uma vez concluída a reação, o robô transfere a mistura de reação para cartuchos FSPE contendo gel de sílica modificado C nine F 17 para purificação.

Em seguida, os cartuchos são lavados com oito mililitros de metanol a 80%, seguidos por oito mililitros de metanol a 100%. Para eliminar a fração não floris, o fluxo é coletado em um frasco para obter o produto marcado com florista desejado. Se for necessária purificação adicional, pause o robô e remova os produtos de reação apropriados.

Dependendo da estrutura, os doadores podem ser extremamente não reativos e alguma molécula aceitadora de florista será deixada mesmo após a adição de promotor suficiente. Se for esse o caso, o FSPE não será eficiente o suficiente para purificação e purificação adicional via cromatografia em coluna de sílica gel pode ser realizada após a purificação, o braço robótico dispensa óxido de metanfetamina de sódio no frasco de reação. A reação é então agitada por duas horas na plataforma robótica, se não estiver completa conforme determinado pelo TLC, estender o período de incubação em aproximadamente uma hora.

Após a conclusão da reação, o produto é purificado por FSPE como antes. Em seguida, remova o produto da reação do robô e na bancada submetido à dissolução em tolueno anidro, seguido de evaporação para remover a água residual. Quando uma amostra estiver seca, coloque-a de volta no robô no mesmo ciclo, incluindo a purificação por glicosilação por FSPE.

A proteção profunda do grupo protetor temporário seguida de glicosilação é repetida até que o comprimento de cadeia desejado seja obtido para a molécula alvo para desproteger o produto protegido obtido da automação, remova o frasco do robô. As etapas finais do procedimento utilizam gás hidrogênio explosivo e devem ser realizadas fora da plataforma de automação. Na onça de bancada, ocorre a lise da ligação dupla na etiqueta do florista e é seguida pela oxidação do aldeído produzido em ácido carboxílico.

Purificar o produto resultante por cromatografia em coluna de sílica-gel numa bancada utilizando uma mistura de 30% de metanol em diclorometano. Finalmente, para proteger os grupos éter benzo por hidrogenação catalisada por paládio, passe o produto através de uma almofada de satélite para se livrar do paládio, para obter o produto final puro. Caracterize totalmente o produto usando ressonância magnética nuclear ou espectroscopia de RMN.

A síntese de polímeros de alto lançamento e a fabricação de nanopartículas são realizadas seguindo o protocolo descrito por Peterson et al. Conforme referenciado no documento anexo, o aparelho de deposição automatizado utilizado para a funcionalização de partículas consiste em três bombas ne 1000, um estágio robótico integrado por dois atuadores, um para movimento na direção X e outro para movimento na direção Y e um segundo estágio robótico com dois racks adjacentes consistindo em três atuadores, um para cada direção em que as bombas e um total de cinco atuadores estão conectados. Em série, os atuadores e bombas são operados por um computador usando o software de visualização de laboratório.

Os sistemas de copolímeros usados para a fabricação de partículas são baseados em ácido SEBA ou SA e um seis bis, paraic carboxy, oxil heane ou CPH e um oito BIS para carboxi fenoxi três seis dioxano ou CP Teeg. Após o local de fabricação das nanopartículas, um rack contendo os tubos de centrifugação de 1,7 mililitro com uma biblioteca de nanopartículas para o estágio do atuador linear para a fixação de carboidratos à superfície de partículas poli-anquentes e uma reação média de acoplamento de ácido carboxílico consistindo em duas reações consecutivas é realizada para a primeira reação. Encha uma seringa em uma bomba de seringa programável com uma solução aquosa de EDC e etilenodiamina a uma concentração de dois miligramas por miligrama de nanopartículas e 0,6 miligramas por miligramas de nanopartículas, respectivamente.

Encha uma segunda seringa em uma bomba de seringa programável com 2,5 miligramas por miligrama de partículas de NHSA total de 12 equivalentes por amostra de nanopartículas, uma solução aquosa. Em seguida, usando o programa de visualização de laboratório, instrua o robô a depositar suspensões de reagentes na biblioteca de nanopartículas. Os atuadores do robô então moveriam o suporte do tubo para a posição correta na plataforma para dispensação de soluções, EDC e NHS.

Ative os grupos de ácido carboxílico na superfície das nanopartículas de polianidrido e permita um acoplamento médio. Em seguida, mergulhe uma sonda de sonicação em cada tubo e sonice cada amostra por 30 segundos a 40 hertz. Antes de passar para a próxima amostra, limpe a sonda com acetona.

Uma vez que todas as amostras são saciadas, o suporte do tubo é separado da plataforma robótica. Incube as suspensões de nanopartículas por nove horas com rotação constante a quatro graus Celsius. Os tempos de reação para a primeira e segunda reações podem ser alterados para ajustar a concentração final de sacarídeo.

Após a reacção estar completa, centrifugar os tubos a 12 000 vezes G durante cinco minutos. Em um ambiente frio, retorne à estação robótica. Recoloque o suporte do tubo no braço robótico e encha a segunda seringa na plataforma robótica.

Com água fria, a primeira seringa deve permanecer vazia. Ligue o robô. O sobrenadante em cada tubo é retirado para a seringa vazia e a segunda bomba deposita água fria nos tubos.

Esta etapa é realizada para remover quaisquer reagentes não reativos das suspensões de nanopartículas. Em seguida, homogeneizar a suspensão de nanopartículas por sonicação, conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, centrifugue os tubos a 12.000 vezes G por cinco minutos.

Realize uma segunda lavagem com água fria utilizando o aparelho robótico para a segunda reação: carregue 12 equivalentes por amostra de nanopartícula de EDC na primeira bomba e 12 equivalentes por amostra de nanopartícula de NHS na segunda bomba. Inicie a plataforma robótica para dispensar volumes adequados nos tubos contendo nanopartículas. A presença de EDC e NHS permitirá a formação de uma ligação amida entre os grupos amina a partir do dito de etileno já ligado à superfície da nanopartícula e o grupo ácido carboxílico do açúcar protegido profundamente.

Quando a deposição estiver concluída, carregue 10 equivalentes de um sacarídeo específico. Neste caso, foi utilizada lactose e o controle do ácido glicólico nas duas bombas disponíveis. Cada sacarídeo é depositado em tubos de ensaio dependendo da funcionalização desejada a ser alcançada em cada tubo, que é previamente programada no programa de visualização de laboratório, utilizado para operar os atuadores e funções de bomba para a reação específica empregada Neste estudo para a fixação de carboidratos, o ácido glicólico é usado como um controle de ligante, uma vez que os sacarídeos profundamente protegidos já possuem essa molécula ligada covalentemente, o que permite uma maior fixação à superfície da nanopartícula.

As suspensões de nanopartículas são homogeneizadas por sonicação como antes e depois incubadas por nove horas com rotação constante a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave as suspensões de nanopartículas centrifugando removendo o sobrenadante, depois suspenda o pellet em água fria e coloque os tubos, que agora contêm a biblioteca de nanopartículas funcionalizada em uma câmara de vácuo para secar por pelo menos duas horas. As nanopartículas funcionalizadas são caracterizadas por espalhamento dinâmico de luz e outros métodos para avaliar a composição da superfície, concentração, tamanho de partícula, distribuição de tamanho e carga superficial.

O lado diano totalmente protegido mostrado aqui foi sintetizado usando a plataforma de automação. O composto sintetizado foi caracterizado por RMN de prótons em um espectrômetro VXR de 400 megahertz. Usando CDC 13 como solvente, a formação do produto pode ser confirmada a partir da presença de alguns picos característicos.

No diagrama de RMN de prótons, os quatro prótons de 1,79 a 2,21 e dois prótons a 3,38 são da etiqueta florista. O pico singleto em 2,16 corresponde aos picos de pico de acetato em 4,94 e 5,11 são os prótons anoméricos para avaliar o efeito do tempo de reação na morfologia final das nanopartículas e o grau de fixação de açúcar alcançado. As nanopartículas foram funcionalizadas com o aumento dos tempos de reação como mostrado aqui, a concentração de diano na superfície de 50 50 nanopartículas de CPT CPH aumentou com o tempo total de reação e atingiu um máximo após 18 horas.

Nanopartículas funcionalizadas com um tempo de reação total de 24 horas foram então usadas para avaliar sua capacidade de direcionar CLRs em células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos usando citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. Aumento da expressão do sinal DC e do receptor mano para receptores de lectina tipo C foi observado após estimulação com nanopartículas não funcionalizadas, bem como lactose e dano funcionalizadas. Isso indica uma segmentação eficaz.

No entanto, as partículas funcionalizadas de Diano apresentaram um maior nível de expressão, indicando uma especificidade desse ligante para os receptores estudados. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a síntese automatizada de oligossacarídeos de alto rendimento, bem como a funcionalização de nanopartículas poli. Usando estes carboidrato à base em agentes de direcionamento, Uma vez dominada a síntese do açúcar protegido pelo doador aceitador, bem como a montagem do aparelho pode ser feita em 24 a 48 horas.

Obviamente, a duração do tempo depende do tamanho da biblioteca, bem como do tempo de funcionalização. Ao participar deste método, é importante lembrar que você pode otimizar as condições de reação da funcionalização de partículas poli-hidro biodegradáveis dependendo da química da nanopartícula. Seguindo este procedimento, várias estruturas de carboidratos podem ser sintetizadas para atingir diferentes receptores celulares para influenciar o resultado imunológico.