Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função dos granulócitos como uma abordagem de dois parâmetros. Isso é feito primeiro incubando granulócitos de amostras de sangue de pacientes com biopartículas e reagente para visualizar a explosão oxidativa. Na segunda etapa, a fagocitose pós-incubação é bloqueada e, em seguida, os receptores de superfície celular de interesse são marcados para permitir a identificação positiva dos granulócitos.

Em última análise, os subconjuntos de granulócitos ativados podem ser identificados e isolados por citometria de fluxo baseada em imagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia nutricional ou clínica, como como os hábitos alimentares e as práticas nutricionais contribuem para alterações e função dos granulócitos. Demonstrando este procedimento estará Eric Prado, um estudante de doutorado do meu laboratório.

Ao obter o descongelamento da amostra de sangue periférico, as biopartículas SIUs e DHE à temperatura ambiente e etil malamed em um banho de 37 graus Celsius B, quando os reagentes descongelaram, adicionam 20 microlitros das biopartículas ssus a quatro tubos individuais de 1,2 mililitro dentro de um capuz estéril. Em seguida, adicione 40 microlitros de DHE descongelado a cada tubo que contém as partículas biológicas e bata suavemente nos tubos na bancada para coletar o reagente no fundo dos tubos. Depois de adicionar 100 microlitros de sangue total misturado a cada tubo, remova qualquer sangue contaminante ao longo da borda interna dos tubos com um aplicador com ponta de algodão e misture o sangue e os reagentes com uma pipeta eletrônica por três ciclos.

Após o terceiro ciclo, coloque todos os tubos em um balde de gelo protegido da luz. Em seguida, incube os tubos por 10, 20 ou 40 minutos em um banho de velocidade de 37 graus Celsius, começando com o tubo de 40 minutos para garantir que todas as incubações terminem ao mesmo tempo. No final das incubações, dispensar 15 microlitros de etil malamed em cada um dos tubos.

Após 30 minutos, incube as células com 10 microlitros de cada um dos anticorpos apropriados. Após uma hora, incube as células em 750 microlitros de solução para piolhos de glóbulos brancos. Após mais uma hora, centrifugue as células de incubação e aspire a vácuo o sobrenadante, deixando um volume de fluido residual de 100 microlitros acima do pellet da célula.

Agora adicione 10 microlitros de sete A a d 50 microlitros de PBS e 25 microlitros de esferas de calibração recém-diluídos a cada amostra. Em seguida, tampe os tubos, embrulhe-os em papel alumínio e guarde-os a quatro graus Celsius. Quando o citômetro de fluxo baseado em imagem estiver pronto, execute cada tubo de amostra coletando um mínimo de 3000 eventos do local ULU usando parâmetros predefinidos para analisar as amostras.

Use o assistente de compensação de software automatizado do software IDEA para aplicar uma matriz de compensação aos arquivos de imagem bruta e criar arquivos de imagem compensados. Em seguida, carregue os arquivos CIF individuais no software IDEA e gere os seguintes gráficos para identificar os subconjuntos de granulócitos para cada amostra de paciente. Usando o controle não estimulado como padrão de referência primeiro, use o histograma do quadrado médio da raiz do gradiente de campo claro para estabelecer as portas iniciais e identificar as células que foram consideradas em foco.

Em seguida, para separar as células singlete dos detritos e dos dublês, crie um gráfico de pontos da taxa de proporção do campo claro versus a área do campo claro. Uma vez identificada uma população limpa de células, estabeleça um gráfico de pontos de CD 45 versus CD 66 B.To identifique positivamente os granulócitos CD 45 positivos para CD 66 B. Por fim, crie um gráfico de pontos da intensidade do detalhe brilhante para o áureo versus a intensidade do detalhe brilhante para a explosão oxidativa.

Para identificar os subconjuntos dos granulócitos ativados coletando as imagens de campo claro nos canais um e nove, as biopartículas no canal três, o DHE no canal quatro, os sete a a d no canal cinco, o CD 66 B no canal 11 e o CD 45 no canal 12, uma sobreposição de duas cores também pode ser gerada representando eventos combinados de DHE e biopartículas. Usando citometria de fluxo baseada em imagem, uma população homogênea de granulócitos ativados pode ser separada em três subconjuntos de ativação diferentes. Com esse método, a maneira mais eficaz de resolver os três subconjuntos é traçar a intensidade do detalhe brilhante para a fagocitose versus a explosão oxidativa.

O uso adicional do assistente de colocalização no software IDEAS permite a quantificação da presença simultânea de fagocitose e explosão oxidativa dos granulócitos, um sinal característico de alta ativação. Além disso, neste experimento, o período de incubação de 40 minutos demonstrou a maior porcentagem de granulócitos altamente ativos. Assim, a inclusão de pelo menos três períodos de incubação no protocolo facilita a determinação de como um determinado tratamento clínico pode alterar o estado de ativação temporal dos granulócitos.

Seguindo este procedimento, outros métodos, como ensaios multiplex baseados em contas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, como a produção de quimiocinas GRANULOCYTE no supinato muda após a exposição a biopartículas?