Name: Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprenda a avaliar a função de granulócitos por citometria de fluxo baseada em imagem, medindo simultaneamente fagocitose e explosão oxidativa. Este método identifica três subconjuntos distintos de granulócitos ativados para pesquisa em imunologia clínica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O presente estudo foi financiado em parte por uma Bolsa de Iniciação à Pesquisa (RIG) da Universidade do Norte do Texas para o Dr. McFarlin. Os autores não receberam financiamento direto para a realização deste estudo e não relatam conflito de interesses.

NOTA: Todos os procedimentos de coleta de sangue descritos neste método foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki e aprovado pelo Comitê de Ética UNT (IRB) para seres humanos. Todos os indivíduos deram consentimento por escrito para a recolha de sangue, o qual foi usado no presente método para garantir que eles eram aparentemente saudáveis, de peso corporal normal, e livre de doença. 1. Reagente Fonte e Planejamento <ol><li> Uso CD66b-APC (clone # G10F5; DF = 1: 50) e CD45-APCeFluor780 (clone 2D1 #; DF = 1: 50) para este ensaio. NOTA: Antes do estudo, os anticorpos CD45 e CD66b foram titulados para determinar a diluição óptima que granulócitos claramente resolvidos (CD45 + / + 66b) a partir de outros leucócitos (CD45 + / 66b-) 11. Após a adição do anticorpo diluído para a coloração da diluição final no tubo foi de 875. </li><li> Compra e descongelar estoque S. aureus biopartículas marcado com corante vermelho pHrodo. Suspender a uma concentração de 1 mg de biopartículas por ml em PBS estéril. Biopartículas diluídas e alíquotas armazenamento congelado a -20 ° C até ser utilizada no ensaio. </li><li> Dissolver dihydroethidium (DHE), a qual é convertida em brometo de etídio fluorescente a presença de radicais livres de oxigénio (isto é, o rebentamento oxidativo), em DMSO a uma concentração final de 10 g / ml. </li><li> Misturar N-etilmaleimida (utilizada para impedir a fagocitose adicional na sequência da duração da incubação ensaio especificado) com PBS estéril em uma diluição em 2 passos de 200 mg / ml e 17,5 mg / ml, respectivamente. No ensaio, usar uma concentração final de 15 mM. Quando o descongelamento N-etilmaleimida, utilizar uma temperatura de 37 ° C bloco de calor, tal como a N-etilmaleimida não permanece em solução. </li><li> Após o passo final da fixação, utilizar 7AAD para corar o ADN nuclear. Antes da adição, diluir estoque 7AAD 1:10 com PBS estéril. </li></ol> 2. Coleta de Amostras de sangue <ol><li> Peça sujeitos a chegar ao laboratório após uma O / N rápido (&gt; 8 h) e abstentino de actividade física (&gt; 12 h). </li><li> Após a limpeza da pele com uma compressa embebida em álcool prep, inserir uma agulha estéril de coleta de sangue em uma veia periférica do braço. </li><li> Recolha de sangue em tubos de vácuo que são comercialmente cheios de heparina sódica. </li><li> Após a coleta, aplicar uma bandagem adesiva para o braço do sujeito. </li><li> Inverta tubos de sangue para misturar 10 vezes e, em seguida, colocar em uma cadeira de balanço até a análise. </li></ol> Técnica 3. A fagocitose Assay <ol><li> Descongelar biopartículas S.aureus (RT), de DHE (RT), e N-etilmaleimida (37 ° C). </li><li> Adicionar 20 L de biopartículas S.aureus 4 individuais 1,2 ml tubos, enquanto trabalhava no capô estéril. </li><li> Adicionar 40 L de DHE a cada tubo contendo as biopartículas. </li><li> Bater levemente os tubos sobre a superfície do banco para recolher os reagentes no fundo do tubo. </li><li> Adicionar 100 L de sangue total misturado a cada tubo, que foi preenchido com biopartículas e DHE. </li><li>Limpe a borda interior dos tubos com um aplicador de algodão cotado para remover qualquer vestígio de sangue contaminando. </li><li> Misturar o sangue e os reagentes com uma pipeta electrónica criada para misturar o sangue e reagentes para três ciclos, após a adição do sangue. </li><li> Coloque tubos de ensaio em um balde de gelo e tampa para proteger da luz. </li><li> Incubar tubos de ensaio durante 10, 20 e 40 min. Comece com o tubo 40 min para assegurar que todos os tubos de ensaio terminar ao mesmo tempo. </li><li> Thaw N-ethylmaleimide em 37 ° C banho de pérola. </li><li> Pipetar 15 L de N-etilmaleimida (descrito acima em 1.4) a cada tubo de ensaio, incubar durante 30 min. </li><li> Pipetar 10 l de CD66b-APC e 10 L de CD45-APCeFluor780 anticorpos diluídos (descritos acima em 1.1), incubar durante 60 min. </li><li> Pipetar 750 L de solução de lise correcção WBC / RBC em cada tubo de ensaio, incubar durante 60 min. </li><li> Centrífuga (10 min a 400 xg) tubos de ensaio para recolher o sedimento celular. </li><li> Vacuum aspirar a solução lise WBC / fix RBC, deixando um residual flvolume de uid (100 L) por cima do sedimento celular. </li><li> Pipetar 10 l de solução diluída 7AAD (descrito acima em 1.5) e 50? L de PBS em cada tubo de ensaio. </li><li> Adicione uma gota de contas de calibração (~ 25 L) para cada tubo de ensaio, coloque materiais em tubos de ensaio, tubos embrulhe em papel alumínio e coloque no frigorífico. </li><li> Coloque o tubo de amostra no fluxo baseado em imagem citômetro e coletar um mínimo de 3.000 eventos de granulócitos usando parâmetros pré-definidos: Autosampler, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers (Figura 1). </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg"> Figura 1. Aquisição Method &amp; Template. As amostras foram adquiridas em um fluxo com base em imagem citômetro (A). Durante a aquisição, gráficos de pontos de Campo brilhante Proporção vs. CD66b-APC foram gerados para granulócitos separados dos grânulos de calibração perfurantes usin100.2.292.0 software g INSPIRE v. (B). Um mínimo de 5.000 granulócitos foram adquiridos para cada amostra utilizando um amostrador automático, azul (488 nm, 60 mW), vermelho (640 nm, 100 mW),, SSC (785 nm; 8,5 mW) lasers. Por favor, note que um número de histogramas estão presentes durante a aquisição para monitorar as configurações de laser e outros aspectos da coleta de dados. Todos esses histogramas são opcionais e só precisava se os procedimentos operacionais padrão de laboratório exige-los como controle de qualidade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 4. Amostra de Aquisição e Análise <ol><li> Use o assistente de compensação software automatizado do software IDEAS para aplicar uma matriz de compensação para arquivos de imagem RAW (RIF) e criar compensar arquivos clonados (CIF). </li><li> Carregar arquivos CIF individuais em software idéias e gerar os seguintes parcelas para identificar os subconjuntos de granulócitos: </li> Estabelecer portões iniciais para identificar as células que foram consideradas em foco usando um histograma para brilhantes RMS gradiente de campo (Figura 2A). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência. <li> Use parcelas secundárias às células singleto separadas de detritos e dupletos, utilizando um gráfico de pontos de campo brilhante relação de aspecto (relação entre a altura da célula versus largura) x área do campo brilhante (Figura 2B). Fazer essa determinação para cada amostra usando o controle unstimulated como padrão de referência. </li><li> Uma vez que uma população de células limpo havia sido identificado, estabelecer um gráfico de pontos de CD45 vs. CD66b (Figura 2C) para identificar positivamente granulócitos (CD45 + / 66b +). Criar um enredo filha (Figura 3) de intensidade detalhe brilhante para S. aureus (eixo x) vs. detalhe intensidade luminosa para o burst oxidativo (, eixo y-DHE) para identificar subconjuntos de granulócitos activados. Recolha brimagens de campo ight no canal 1 e 9, biopartículas no canal 2, DHE no Channel 4, 7AAD no Canal 5, CD66b no Canal 11 e CD45 no Canal 12. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg"> Figura 2. Modelo de Análise. Este número da série de tramas que foram gerados para identificar as células que estiveram em foco (A), células individuais (B), de granulócitos (C). Parcelas adicionais foram utilizados para identificar os três subconjuntos de granulócitos activados granulócitos vs. inactivos. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<ol><li>Kong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+alpha-fetoprotein+on+the+activation+and+phagocytosis+of+granulocytes+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of alpha-fetoprotein on the activation and phagocytosis of granulocytes and monocytes.</a> Hepatogastroenterology. 59, 2385-2388 (2012).</li>
<li>Prakash, P. S., Caldwell, C. C., Lentsch, A. B., Pritts, T. A., Robinson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microparticles+generated+during+sepsis+in+patients+with+critical+illness+are+neutrophil-derived+and+modulate+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Human microparticles generated during sepsis in patients with critical illness are neutrophil-derived and modulate the immune response.</a> J. Trauma Acute Care Surg. 73, 401-406 (2012).</li>
<li>Salih, H. R., Husfeld, L., Adam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+cytofluorometric+measurement+of+phagocytosis%2C+burst+production+and+killing+of+human+phagocytes+using+Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+as+target+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Simultaneous cytofluorometric measurement of phagocytosis, burst production and killing of human phagocytes using Candida albicans and Staphylococcus aureus as target organisms.</a> Clin. Microbiol. Infect. 6, 251-258 (2000).</li>
<li>Tsuji, S., Iharada, A., Taniuchi, S., Hasui, M., Kaneko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+nitric+oxide+by+phagocytic+stimulated+neutrophils+in+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Hematol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Increased production of nitric oxide by phagocytic stimulated neutrophils in patients with chronic granulomatous disease.</a> J. Pediatr. Hematol. Oncol. 34, 500-502 (2012).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
<li>McFarlin, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-year+school-based+diet%2Fexercise+intervention+improves+non-traditional+disease+biomarkers+in+Mexican-American+children%5BTitle%5D)+AND+%22Matern.+Child+Nutr%22%5BJournal%5D)">A one-year school-based diet/exercise intervention improves non-traditional disease biomarkers in Mexican-American children.</a> Matern. Child Nutr. 9, 524-532 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Johnson, C. A., Moreno, J. P., Foreyt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mexican-American+Children+have+differential+elevation+of+Metabolic+Biomarkers+that+is+proportional+to+Obesity+Status%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Gastroenterol.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Mexican-American Children have differential elevation of Metabolic Biomarkers that is proportional to Obesity Status.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. , (2013).</li>
<li>Strohacker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderate-intensity%2C+premeal+cycling+blunts+postprandial+increases+in+monocyte+cell+surface+CD18+and+CD11a+and+endothelial+microparticles+following+a+high-fat+meal+in+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Physiol.+Nutr.+Metab%22%5BJournal%5D)">Moderate-intensity, premeal cycling blunts postprandial increases in monocyte cell surface CD18 and CD11a and endothelial microparticles following a high-fat meal in young adults.</a> Appl. Physiol. Nutr. Metab. 37, 530-539 (2012).</li>
<li>Carpenter, K. C., Breslin, W. L., Davidson, T., Adams, A., McFarlin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+yeast+beta-glucan+supplementation+increases+monocytes+and+cytokines+post-exercise%3A+implications+for+infection+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Baker's yeast beta-glucan supplementation increases monocytes and cytokines post-exercise: implications for infection risk.</a> Br. J. Nutr. , 1-9 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (1002).</li>
<li>McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+cytometry+reveals+three+distinct+subsets+of+activated+granulocytes+based+on+phagocytosis+and+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst.</a> Cytometry A. 83, 745-751 (2013).</li>
<li>Ichii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+sucrose+impairs+phagocytic+function+and+promotes+apoptosis+in+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes.</a> Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).</li>
<li>Ploppa, A., George, T. C., Unertl, K. E., Nohe, B., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageStream+cytometry+extends+the+analysis+of+phagocytosis+and+oxidative%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">ImageStream cytometry extends the analysis of phagocytosis and oxidative.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 71, 362-369 (2011).</li>
<li>Van Amersfoort, E. S., Van Strijp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+flow+cytometric+fluorescence+quenching+assay+of+phagocytosis+of+sensitized+sheep+erythrocytes+by+polymorphonuclear+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a flow cytometric fluorescence quenching assay of phagocytosis of sensitized sheep erythrocytes by polymorphonuclear leukocytes.</a> Cytometry. 17, 294-301 (1994).</li>
<li>Gullstrand, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+autoantibodies+against+different+histone+proteins+influences+complement-dependent+phagocytosis+of+necrotic+cell+material+by+polymorphonuclear+leukocytes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Combination of autoantibodies against different histone proteins influences complement-dependent phagocytosis of necrotic cell material by polymorphonuclear leukocytes in systemic lupus erythematosus.</a> J. Rheumatol. 39, 1619-1627 (2012).</li>
<li>Fierro, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+phenotypical+impairment+of+polymorphonuclear+cells+in+atopic+dermatitis%3A+an+additional+cause+for+the+known+susceptibility+to+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Functional and phenotypical impairment of polymorphonuclear cells in atopic dermatitis: an additional cause for the known susceptibility to infections.</a> Dermatology. 224, 323-330 (2012).</li>
<li>Gruger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+impact+of+linezolid+on+human+neutrophil+functions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro.</a> Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).</li>
<li>McFarlin, B. K., Venable, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Low+Concentration+Human+Serum+Cytokines+using+a+Millipore+High-Sensitivity+Milliplex+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measurement of Low Concentration Human Serum Cytokines using a Millipore High-Sensitivity Milliplex Assay.</a> J. Vis. Exp. , (2014).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Davidson, T., McFarlin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baker%27s+Yeast+Beta+Glucan+Supplementation+Increases+Salivary+IgA+and+Decreases+Cold%2FFlu+Symptomatic+Days+After+Intense+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diet.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Baker's Yeast Beta Glucan Supplementation Increases Salivary IgA and Decreases Cold/Flu Symptomatic Days After Intense Exercise.</a> J. Diet. Suppl. 10, 171-183 (2013).</li>
<li>McFarlin, B. K., Carpenter, K. C., Strohacker, K., Breslin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+blood+monocytes+and+adipose+tissue+macrophages+in+a+mouse+model+diet-induced+weight+gain%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparison of blood monocytes and adipose tissue macrophages in a mouse model diet-induced weight gain.</a> Comp. Med. 62, 462-465 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O presente método representa um refinamento dos métodos existentes para a avaliação da função de granulócitos utilizando citometria de fluxo 1,3,4,12-14. Os passos críticos deste ensaio tendem a ser relacionada com uma mistura apropriada da amostra de sangue com as biopartículas e DHE. A mistura incompleta irá resultar em resultados imprecisos. Enquanto a mistura completa é crítico, o método de mistura deve ser de natureza suave. Sugere-se que a mistura ser realizada utilizando uma pipeta electrónica com uma função de mistura, em vez de um misturador de vórtice. Outro passo crítico no ensaio é para assegurar sempre que não há contaminação do sangue da metade superior do tubo de ensaio. Este sangue residual pode ser removido usando um aplicador com ponta de algodão estéril. A remoção completa é importante porque não fazer isso pode contaminar a preparação final do ensaio com hemácias lisadas-un. Antes de usar este método controles de compensação apropriados devem ser adicionados para controlar spectral sobreposição entre os reagentes utilizados para identificar os vários aspectos da função de granulócitos. Por este método, os controles de compensação envolvem colher amostras de sangue que foram sugeridos no ensaio de incubação de 40 min e, em seguida, a rotulagem com um único marcador (por exemplo, E. coli, a DHE, etc). Após a marcação, eventos positivos individuais são recolhidos e uma matriz de compensação é gerado utilizando um assistente automatizado no software de análise de idéias. É fundamental que se este ensaio é utilizado, os controles de compensação apropriados sejam concluídas para garantir o desempenho adequado do ensaio. A análise é realizada usando o recurso de localizar e co-localização assistentes para identificar esse brilhante intensidade detalhe é a melhor variável para separar as populações e também identificar como existe muita sobreposição entre burst oxidativo e sinais de fagocitose. Especificamente, a utilização de citometria de imagem baseada em fornecida a capacidade de segregar granulócitos activados em três subconjuntos. Tseu colapso subconjunto foi determinada utilizando intensidade detalhe brilhante de fagocitose vs. burst oxidativo. Além de examinar estas funções celulares singulares, foram identificadas as células que exibiram dois eventos ao mesmo tempo no mesmo local anatómico (co-localização). Granulócitos que caíram no subconjunto &quot;high-ativo&quot; foram o único fenótipo que demonstrou co-localização consistente entre fagocitose e burst oxidativo. Esta identificação de subconjuntos de granulócitos ativados é a maior área em que é necessária solução de problemas. É muito importante para um novo usuário a tomar tempo para entender o fluxo de trabalho processo de amostra em idéias e entender a mecânica de modular os populações de células usando o componente de imagem. Outras modificações que um usuário pode procuram fazer incluem a seleção de vezes ensaio de incubação alternativas ou adicionais. O actual método sugere a utilização de durações de 10-40 min; No entanto, dependendo do modelo experimental em que este método épara ser utilizado, pode ser necessário seleccionar as durações mais ensaio. Tal modificação teria de ser avaliado numa base individual. Além disso, foi determinado que a duração do ensaio de incubação tem um efeito significativo sobre a aparência dos três subconjuntos activados. A abordagem descrita neste relatório representa uma extensão do que a informação poderia ser obtido previamente sobre a função de granulócitos 3,4,13,15. Outros laboratórios têm demonstrado a importância de avaliar as alterações na função de granulócitos como parte de uma avaliação abrangente da imunidade e doenças 15-17. Apesar do potencial de este ensaio não é sem limitações. Uma das limitações principais é o custo e tempo de demanda associadas com o processamento elevado de amostras. Quando um desenho de estudo requer um grande número de amostras num determinado dia, estes podem ser difíceis de processar. Processing é simplificada pela utilização de pipetas eletrônicos e dispensadores,mas estes tendem a ser caros e não estão necessariamente disponíveis em cada laboratório. Nossa área de pesquisa concentra-se em um estudo de como o exercício e hábitos alimentares influenciam a saúde do sistema imunológico e funcionar 6,8-10,18-20. Estes objectivos têm implicações práticas importantes para uma variedade de áreas da saúde humana. Além do estudo dos efeitos do exercício e nutricionais o método fagocitose demonstrado neste manuscrito poderia ser útil em outras áreas da imunologia clínica onde a monitorização da função de fagocitose é fundamental para os resultados do tratamento. O presente ensaio é o primeiro de muitos ensaios imunológicos, que, com o potencial de ser re-inventado ao tirar vantagem da informação de imagem única que pode ser possível a partir de um fluxo com base em imagem citómetro.

Granulócitos representam um componente de sistema imune inata do corpo, o que proporciona a primeira linha de defesa contra antigénios invasores. Os métodos anteriores para avaliar a função de granulócitos focado em capacidade de fagocitose ou burst oxidativo utilizando métodos diferentes, o que torna difícil determinar coletivamente como granulócitos mudaram 1-4. Os avanços no campo da citometria de fluxo ter resultado na produção de instrumentos de bancada capazes de alta-resolução, de imagens multi-cor das células de uma forma de alto rendimento 5. A capacidade de combinar imagens com o fluxo tradicional representa citometria de um avanço que fornece a plataforma tecnológica necessária para inovar dentro de citometria de fluxo existente métodos e extrair novas informações sobre o sistema imunológico. Ao longo dos últimos dez anos, o nosso laboratório, entre outros, tem sido intensamente focada sobre o efeito de vários tratamentos patte nutricional e exercíciorns sobre a função imunológica inata 6-9. O método demonstrado neste manuscrito tem implicações práticas no campo da imunologia clínica. O presente método aproveita o poder da citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose de partículas bacterianas e burst oxidativo. Usando essa abordagem, um é capaz de separar os granulócitos ativados utilizando variáveis ​​fornecidas pela parte baseada na imagem da análise. Estes subconjuntos eram identificáveis ​​apenas depois de avaliar as imagens celulares nos granulócitos individuais. Além disso o tempo de incubação do ensaio afectada a transição entre as três subconjuntos de activação 10. Assim, é plausível que o uso de múltiplos tempos de incubação pode permitir um método para testar a mudança na função de granulócitos na sequência de um tratamento experimental específica. O objetivo deste artigo foi demonstrar um método de avaliação da função de granulócitos usando citometria de fluxo baseado em imagem para medir simultaneamente a fagocitose com oxidative estourar.

<table><tbody><tr><td>Ciências</td><td></td> da vida do BD de <td>Vacutainers</td><td>usadas para a coleção de sangue</td></tr><tr><td>Fixador de WBC/solução da lise de RBC</td> tecnologias A10010 da vida do clone G10F5 <td></td><td></td> CD45-APCeFluor780 do eBioscience do eBioscience da coleção de sangue 00-5333-57 <td></td></tr><tr><td>CD66b-APC</td><td>eBioscience</td><td></td> clone 2D1S. aureus<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dihidroetídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmalemida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>EMD Analisador de hematologia Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mindray</td><td>BC-3200</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 96 canais</td><td>Integra Biosciences</td><td>ViaFlo</td><td></td></tr><tr><td>Bead Bath Incubadora</td><td>LabArmour</td><td>Citômetro</td> de fluxo de imagem BeadBath <td></td></tr><tr><td></td><td>EMD Millipore</td><td>Amnis FlowSight</td><td></td></tr><tr><td>Software EMD</td><td>Millipore</td><td>Amnis Software INSPIRE</td> Software EMD Millipore Amnis IDEAS <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Seladora</td></tr> de <tr><td>placas Piercable X-Pierce</td><td>Excel Scientific, Inc.</td><td>X-Pierce</td><td></td></tr><tr><td>Dell Precision</td><td>Workstation Dell Computadores</td><td>Vários</td><td>Usados para análise IDEAS</td></tr></tbody></table>

baseada em imagem técnica de citometria de fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos in vitro

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Os granulócitos desempenham um papel fundamental na resposta imune inata do corpo a infecções bacterianas e virais. Embora existam métodos para medir a função dos granulócitos, em geral eles são limitados em termos das informações que podem fornecer. Por exemplo, a maioria dos ensaios existentes fornece apenas uma porcentagem de quantos granulócitos são ativados após uma única incubação de comprimento fixo. Para complicar as coisas, a maioria dos ensaios se concentra em apenas um aspecto da função devido a limitações na tecnologia de detecção. Este relato demonstra uma técnica para medição simultânea de fagocitose de granulócitos de bactérias e explosão oxidativa. Ao medir essas duas funções ao mesmo tempo, três fenótipos únicos de granulócitos ativados foram identificados: 1) Baixa Ativação (fagocitose mínima, sem explosão oxidativa), 2) Ativação Moderada (fagocitose moderada, alguma explosão oxidativa, mas sem co-localização dos dois eventos funcionais) e 3) Alta Ativação (alta fagocitose, alta explosão oxidativa, co-localização de fagocitose e explosão oxidativa). Uma quarta população que consistia em granulócitos inativados também foi identificada. Usando incubações de ensaio de 10, 20 e 40 minutos, o efeito da duração da incubação do ensaio na redistribuição dos fenótipos de granulócitos ativados foi avaliado. Uma quarta incubação foi concluída no gelo como controle. Usando incubações em tempo serial, o ensaio pode ser capaz de detectar como um tratamento afeta espacialmente a função dos granulócitos. Todas as amostras foram medidas usando um citômetro de fluxo baseado em imagem equipado com uma opção de imagem quantitativa (QI), amostrador automático e vários lasers (488, 642 e 785 nm).

Usando citometria de fluxo baseado em imagem permitiu separar uma população homogênea de granulócitos ativados em três subgrupos de ativação diferentes (Figura 3). Neste método, a forma mais eficaz de resolver as três subconjuntos de activação é brilhante através da representação gráfica da intensidade detalhe para a fagocitose (S. aureus) versus o burst oxidativo (DHE) (Figura 3; Figura 4). Além disso, o uso do assistente de co-localização de software ideias irão permitir a quantificação da presença simultânea de fagocitose e burst oxidativo, que é um sinal típico de granulócitos altamente activadas. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg"> Figura 3. Identificação da Contato granulócitos Subconjuntos. Após a identificação dos granulócitos utilizando marcadores de superfície celular (CD45 + / 66b +), um enredo filha foi gerado com brilhante detalhe intensidade para a fagocitose vs. intensidade detalhe brilhante para burst oxidativo. Usando essa abordagem, o percentual de inativos (roxo), low-ativo (vermelho, A), moderado-ativo (azul, B) e (C) amarelo, granulócitos altos-ativo foi determinada. Esta técnica de propagação também foi usada para avaliar o efeito do tempo de incubação do ensaio sobre a abundância relativa dos diferentes subconjuntos de granulócitos activados. O maior percentual de granulócitos "high-ativo" estava presente após a 40 min de incubação. Toda a análise de arquivos de imagem adquiridos foi completada com software IDEAS v.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Além de demonstrar a presença de três subconjuntos distintos de granulócitos activados, demonstrou-se que o tempo de incubação do ensaio influenciaram a abundância relativa de cada subconjunto granulócitos activados. Especificamente, a 40 min incubation resultou no maior percentual de granulócitos "high-activa". Com a inclusão de, pelo menos, três períodos de incubação do ensaio que pode ser possível determinar a forma como um determinado tratamento clínico altera o estado de activação temporal dos granulócitos. Este é o primeiro método publicado pela citometria de fluxo com base em imagem para identificar diferentes subconjuntos de granulócitos activados como uma função de medições simultâneas de fagocitose e burst oxidativo. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg"> Figura 4. Imagens representativos de marcadores celulares. Uma galeria de imagens de células classificados como de alto-ativa (A), moderado-ativa (B), e de baixo ativo (C) é apresentado nesta figura. Biopartículas S.aureus estão em CH03 , burst oxidativo está em CH04, 7AAD para o núcleo está em CH05, dispersão lateral está em CH06, CD66b está emCH11 e CH12 em CD45 é. Além disso, uma imagem de fusão co-localizada de fagocitose (CH03) vs. burst oxidativo (CH04) é exibido. Áreas de amarelo na imagem merge denotar que a fagocitose e oxidativa explosão estão ocorrendo no mesmo espaço anatômico ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Este método demonstra uma técnica para avaliar a função dos granulócitos medindo simultaneamente a fagocitose de bactérias e a explosão oxidativa. A citometria de fluxo baseada em imagem permitiu a identificação de três subconjuntos distintos de granulócitos ativados que diferiam em sua capacidade funcional relativa.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função dos granulócitos como uma abordagem de dois parâmetros. Isso é feito primeiro incubando granulócitos de amostras de sangue de pacientes com biopartículas e reagente para visualizar a explosão oxidativa. Na segunda etapa, a fagocitose pós-incubação é bloqueada e, em seguida, os receptores de superfície celular de interesse são marcados para permitir a identificação positiva dos granulócitos.Em última análise, os subconjuntos de granulócitos ativados podem ser identificados e isolados por citometria de fluxo baseada em imagem. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da imunologia nutricional ou clínica, como como os hábitos alimentares e as práticas nutricionais contribuem para alterações e função dos granulócitos. Demonstrando este procedimento estará Eric Prado, um estudante de doutorado do meu laboratório.Ao obter o descongelamento da amostra de sangue periférico, as biopartículas SIUs e DHE à temperatura ambiente e etil malamed em um banho de 37 graus Celsius B, quando os reagentes descongelaram, adicionam 20 microlitros das biopartículas ssus a quatro tubos individuais de 1,2 mililitro dentro de um capuz estéril. Em seguida, adicione 40 microlitros de DHE descongelado a cada tubo que contém as partículas biológicas e bata suavemente nos tubos na bancada para coletar o reagente no fundo dos tubos. Depois de adicionar 100 microlitros de sangue total misturado a cada tubo, remova qualquer sangue contaminante ao longo da borda interna dos tubos com um aplicador com ponta de algodão e misture o sangue e os reagentes com uma pipeta eletrônica por três ciclos.Após o terceiro ciclo, coloque todos os tubos em um balde de gelo protegido da luz. Em seguida, incube os tubos por 10, 20 ou 40 minutos em um banho de velocidade de 37 graus Celsius, começando com o tubo de 40 minutos para garantir que todas as incubações terminem ao mesmo tempo. No final das incubações, dispensar 15 microlitros de etil malamed em cada um dos tubos.Após 30 minutos, incube as células com 10 microlitros de cada um dos anticorpos apropriados. Após uma hora, incube as células em 750 microlitros de solução para piolhos de glóbulos brancos. Após mais uma hora, centrifugue as células de incubação e aspire a vácuo o sobrenadante, deixando um volume de fluido residual de 100 microlitros acima do pellet da célula.Agora adicione 10 microlitros de sete A a d 50 microlitros de PBS e 25 microlitros de esferas de calibração recém-diluídos a cada amostra. Em seguida, tampe os tubos, embrulhe-os em papel alumínio e guarde-os a quatro graus Celsius. Quando o citômetro de fluxo baseado em imagem estiver pronto, execute cada tubo de amostra coletando um mínimo de 3000 eventos do local ULU usando parâmetros predefinidos para analisar as amostras.Use o assistente de compensação de software automatizado do software IDEA para aplicar uma matriz de compensação aos arquivos de imagem bruta e criar arquivos de imagem compensados. Em seguida, carregue os arquivos CIF individuais no software IDEA e gere os seguintes gráficos para identificar os subconjuntos de granulócitos para cada amostra de paciente. Usando o controle não estimulado como padrão de referência primeiro, use o histograma do quadrado médio da raiz do gradiente de campo claro para estabelecer as portas iniciais e identificar as células que foram consideradas em foco.Em seguida, para separar as células singlete dos detritos e dos dublês, crie um gráfico de pontos da taxa de proporção do campo claro versus a área do campo claro. Uma vez identificada uma população limpa de células, estabeleça um gráfico de pontos de CD 45 versus CD 66 B.To identifique positivamente os granulócitos CD 45 positivos para CD 66 B. Por fim, crie um gráfico de pontos da intensidade do detalhe brilhante para o áureo versus a intensidade do detalhe brilhante para a explosão oxidativa.Para identificar os subconjuntos dos granulócitos ativados coletando as imagens de campo claro nos canais um e nove, as biopartículas no canal três, o DHE no canal quatro, os sete a a d no canal cinco, o CD 66 B no canal 11 e o CD 45 no canal 12, uma sobreposição de duas cores também pode ser gerada representando eventos combinados de DHE e biopartículas. Usando citometria de fluxo baseada em imagem, uma população homogênea de granulócitos ativados pode ser separada em três subconjuntos de ativação diferentes. Com esse método, a maneira mais eficaz de resolver os três subconjuntos é traçar a intensidade do detalhe brilhante para a fagocitose versus a explosão oxidativa.O uso adicional do assistente de colocalização no software IDEAS permite a quantificação da presença simultânea de fagocitose e explosão oxidativa dos granulócitos, um sinal característico de alta ativação. Além disso, neste experimento, o período de incubação de 40 minutos demonstrou a maior porcentagem de granulócitos altamente ativos. Assim, a inclusão de pelo menos três períodos de incubação no protocolo facilita a determinação de como um determinado tratamento clínico pode alterar o estado de ativação temporal dos granulócitos.Seguindo este procedimento, outros métodos, como ensaios multiplex baseados em contas, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Por exemplo, como a produção de quimiocinas GRANULOCYTE no supinato muda após a exposição a biopartículas?

image-based-flow-cytometry-technique-to-evaluate-changes-granulocyte

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra a citometria de fluxo para medir a captação microglial de biopartículas fluorescentes após a entrega intravítrea em um olho de camundongo. A citometria de fluxo detecta células vivas que expressam CD11b e distingue células da microglia fagocítica exibindo fluorescência verde de outras células mieloides, incluindo monócitos que expressam Ly6C e neutrófilos que expressam Ly6G.

Medindo a captação microglial de partículas fluorescentes entregues por via intravítrea usando citometria de fluxo

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

Um ensaio de citometria de fluxo para identificar subconjuntos de células imunes em células mononucleares do sangue periférico

Este vídeo demonstra um ensaio in vitro para explorar a influência imunomoduladora das células-tronco mesenquimais (MSCs) na proliferação de células T efetoras. O ensaio inclui a co-cultura de MSCs com PBMCs para induzir a população de monócitos a adquirir um fenótipo imunomodulador, levando à secreção de interleucina-10 (IL-10). Após a incubação com células T CD4+ ativadas, os monócitos induzidos suprimem efetivamente a proliferação de células T.

Um ensaio in vitro para avaliar o impacto imunomodulador dos monócitos na proliferação de leucócitos

O presente protocolo descreve um novo método para a identificação de uma população de enuclear eritroblastos ortocromaticos pelo fluxo de imagem multi-espectral citometria, proporcionando uma visualização do processo de enucleação dos eritroblastos.

Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Os monócitos são componentes integrais do sistema imunológico inato humano que dependem do metabolismo glicolítico quando ativados. Descrevemos um protocolo de citometria de fluxo para medir a expressão do transportador de glicose e a captação de glicose por monócitos totais e subpopulações de monócitos em sangue total fresco.

A Fluxo Simples Citometria método para medir glicose Captação e expressão de transportadores de glicose para monócitos subpopulações em sangue total

O objetivo deste manuscrito é apresentar um método para medir a fagocitose de monócitos e granulócitos e a atividade de explosão oxidativa em amostras de sangue humano.

Medição de granulócitos e monócitos fagocitose e oxidativo Atividade Burst no Sangue

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

fagocitose microglial é crítica para a manutenção da homeostase do tecido e da função fagocítica inadequada tem sido implicada na patologia. No entanto, a avaliação da função microglia in vivo é tecnicamente desafiador. Nós desenvolvemos uma técnica simples, mas robusta para monitorar com precisão e quantificar o potencial fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico.

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho completo para a análise qualitativa e quantitativa das sinapses imunes entre primárias células T humanas e células apresentadoras de antígeno. O método baseia-se na imagem citometria de fluxo, que permite a aquisição e a avaliação de várias imagens de milhares de células dentro de um período relativamente curto de tempo.

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Aprenda a avaliar a função de granulócitos por citometria de fluxo baseada em imagem, medindo simultaneamente fagocitose e explosão oxidativa. Este método identifica três subconjuntos distintos de granulócitos ativados para pesquisa em imunologia clínica.

Baseada em imagem Técnica de Citometria de Fluxo para avaliar as mudanças na função de granulócitos In Vitro

Explorar mais vídeos