Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisador assistente no laboratório de George Chen no Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E nos próximos dois dias vou mostrar como preparar TCGF, que significa fator de crescimento de células T.

Portanto, para nossa cultura de células cotidiana, quando não precisamos de um conhecimento preciso da composição das citocinas no meio de cultura, o que usamos é o fator de crescimento de células T, que é o sobrenadante S da cultura spl CY que contém as citocinas necessárias para ajudar as células T a se expandirem. Então, a maneira como preparamos o TCGF é quando matamos ratos Louis saudáveis, pegamos seus baços, preparamos a suspensão de células únicas, nos livramos dos glóbulos vermelhos por meio deles e, em seguida, as células mononucleares que vamos estimular com con carnaval em um, que vai induzir as células T a produzir todas as citocinas necessárias para seu crescimento. Para gerar o TCGF, precisamos ativar as células.

Então, a maneira como fazemos isso é adicionar lectina conval em uma abreviatura como corona A à nossa cultura de células. Então, quando adicionamos o conc em a à nossa cultura de células, ele vai se ligar ao complexo receptor de células T glicosiladas e se ligar a vários complexos ao mesmo tempo, ele vai fazer o que chamamos de capeamento. Então, ele vai agregar, fazer um aglomerado de todos os receptores na superfície da célula e isso vai induzir um sinal de ativação nos linfócitos T.

Então, depois que as células forem ativadas, elas vão explodir. Então eles vão aumentar e então vão começar a secretar citocinas. Então, originalmente, pensávamos que o TCGF era principalmente a interleucina dois, mas agora sabemos que não é realmente o caso.

Ele também contém interferon gama, TNF alfa e provavelmente também citocinas em quantidades muito pequenas que são necessárias apenas para manter as células vivas após 48 horas Em cultura, as células produziram todas as citocinas de que precisamos. Então, vamos remover as células e quando removermos as células e tivermos apenas o sobrenadante, ainda teremos algum conal livre em um no snat. E isso vai ser um problema porque realmente queremos usar nosso fator de crescimento de células T para manter as linhas de células T crescendo.

E se deixarmos o conval livre lá, ele ativará as células quando não quisermos que elas sejam ativadas. Então, para contornar esse problema, vamos adicionar um excesso de açúcar que vai se ligar a todo o conc livre em a, no com. Portanto, ele será completamente inativado e não se ligará a outros receptores glicosilados nas células quando adicionarmos o TCGF à cultura.

Então vamos começar. O primeiro passo para este experimento é retirar o baço do rato logo após a eutanásia. Então é isso que vou fazer imediatamente usando instrumentos estéreis.

E assim que eu tiver os baços para fora, vou colocá-los em PBS suplementado com antibióticos e como antibióticos eu uso penicilina e estreptomicina. Então vamos começar. Então eu pulverizo o rato com 70% de etanol para garantir que não tenha nenhuma contaminação alta da minha cultura.

E então, usando meus instrumentos, vou fazer um pequeno corte na pele aqui. Então eu removo a camada de músculo e o baço aparece aqui. Então eu pego outra pinça, puxo suavemente o baço sem danificá-lo.

Eu removo o tecido conjuntivo conectado assim. Então agora eu tenho um baço. Claro, tenho muito cuidado para não danificar mais nada dentro da cavidade abdominal, porque qualquer dano ao intestino levará à contaminação imediata do meu baço.

E então vou transferir meu baço para um tubo contendo PBS mais antibióticos. E este tubo eu mantenho no gelo. Então agora eu colhi o baço de três ratos.

Portanto, estamos prontos para preparar uma suspensão de célula única a partir desses baços. Então, agora que tenho meus baços, eu os levei para uma cultura de tecidos para preparar uma suspensão de célula única usando treinadores de células de 70 mícrons. Então, vou precisar de várias coisas para fazer a suspensão de célula única dos baços.

Preciso de instrumentos estéreis, um par de pinças e uma tesoura. Então eu tenho o êmbolo de uma seringa estéril de um mil na placa de Petri. Vou colocar meus baços em PBS mais antibióticos.

E em outra placa de Petri coloquei um filtro de células de 70 mícrons em 10 mililitros de PBS mais antibióticos. Portanto, o primeiro passo é certificar-se de que os baços estão limpos porque, como você pode ver aqui, ainda há pequenos pedaços de tecido conjuntivo e vou removê-los porque eles vão entupir o filtro celular muito rápido. Então, para isso, simplesmente corto o que não quero e descarto na tampa da placa de Petri.

Então, agora meus baços estão quase limpos, então vou pegar os baços um por um, colocá-los no treinador de células e cortá-los em pedaços pequenos E eu misturo os três ples. O próximo passo é fazer uma suspensão de célula única. Então, é claro, como eu quero tudo ster, eu não toco no treinador de células e uso o êmbolo de uma seringa estéril de um mil para pressionar meus pedaços de baço através do treinador de células.

E como você pode ver do lado de fora do treinador de células, tenho uma suspensão de célula única sendo feita. Então, na primeira vez, ainda tenho alguns pequenos pedaços de baço, mas já vou tirar a suspensão de célula única. Já transferi para um tubo de 50 mil que armazenei no gelo.

E vou reabastecer meu filtro de células com mais 10 mils de PBS e antibióticos. Então eu tomo mais 10 mils do meu PBS com antibióticos aproximadamente, não precisa ser muito precisamente 10 minutos, estamos apenas lavando. Eu coloco no filtro de células e depois uso o mesmo procedimento.

Volto para o êmbolo da seringa e pressiono um pouco mais o ocídio. Então, é claro que você nunca vai conseguir passar tudo porque há tecido conjuntivo e pequenos pedaços de gordura que não consegui remover e que permanecerão no filtro de células. Mas você deve obter a maior parte do seu baço para o filtro celular.

E então repito exatamente o que fiz antes. Vou colher minha suspensão de célula única e adicioná-la ao mesmo dente. Até agora, não há quase nada da tela deixada no rastreador de células e o PBS que sai é muito mais claro E eu vou simplesmente lavar mais uma vez e devemos ter a maioria das células removidas agora.

Então agora eu tenho minha suspensão de célula única de citos PLE e vou girá-los simplesmente para paletá-los. Portanto, girar por oito a 10 minutos será suficiente. Então, agora nós giramos para baixo nossos cytes PLE e temos uma paleta agradável.

Então, o que vou fazer é me livrar do sobrenadante e depois vou mentir para os glóbulos vermelhos. Então, vou suspender os miócitos e vou usar cloreto de amônio. Portanto, é um SU, uma solução de cloreto de amônio molar de 15 molares e vou usar cinco mililitros por baço.

Então, como eu tinha três baços, vou usar 15 mililitros de cloreto de amônio e vou fazer isso no gelo. Então, para os eritrócitos, vou canalizá-los suavemente para cima e para baixo por três minutos. Ok, usaremos essa tomada com a exposição mais alta aqui.

Então agora eu analisei os eletrócitos por três minutos. Vou encher meu tubo com PBS ou você pode usar o meio também. Isso é para trazer a osmolaridade da solução de volta à faixa normal para as células.

E vou girar as células como fiz anteriormente por oito a 10 minutos para pelletá-las. E então eu vou lavá-los duas vezes usando o mesmo PBS com antibióticos. Então, agora nós abrangemos as células depois de dimensionar os eletrócitos e não se preocupe, nunca obtemos uma liberação de cem por cento dos eletrócitos.

Portanto, o palete ainda estará vermelho, mas o sobrenadante ficará mais claro. E agora vou esvaziar o sobrenadante, quebrar o palete, adicionar um pouco de PBS de até 50 mil, girar para baixo e repetir essa etapa mais uma vez para que eu tenha duas lavagens E então eu poderei me contar. Lavei os miócitos duas vezes e depois os suspendi em meio de cultura e os contei usando seu citômetro.

Como esperado. De três baços, obtive cerca de 600 milhões de células, o que é esperado, já que um baço normalmente nos dá de 200 a 250 milhões de células. Então, o que vou fazer agora é semear minhas células a 2 milhões por moinho em meu meio que foi suplementado com soro de cal fetal a 10%.

E a esse meio vou adicionar dois microgramas por moinho de conc A para estimular as células. E depois disso, vou simplesmente colocar as células na incubadora por 48 horas. As células já estão na incubadora há 48 horas e, como mostrarei, elas cresceram muito bem.

O meio ficou laranja. Portanto, agora estamos prontos para terminar nossa preparação para o TCGF. Como você se lembra, eu adicionei con carnaval em uma suspensão na minha cela para ativar as células.

Portanto, o con carnaval em um é lectina. Ele vai ligar os açúcares em todos os receptores da célula T e vai ativar artificialmente todas essas células. O problema que temos agora é que ainda temos um pouco do con carnaval em a, na célula S sobrenadante.

E como vamos usar um snat em outras culturas de células T para expandir as células, não queremos o con carnaval presente nessas culturas de células. Então, para me livrar dele, o que vou fazer é adicionar um excesso de açúcar ao qual o con naval em um se liga, e esse é o metil alfa D citado mostrado aqui. E vou adicionar um excesso desse açúcar para dissolvê-lo completamente.

E uma vez feito isso, vou filtrar esterilizado meus sobrenadantes celulares e congelar líquidos Ali para uso nas próximas semanas ou meses. Então, vamos começar para esta última etapa. Então, estou adicionando meu sobrenadante de cultura de células a tubos de 50 mil para poder girá-los para me livrar das células.

Então eu simplesmente encho quantos tubos forem necessários e não faço isso na capa de cultura, eu poderia, mas como preciso de alguma maneira de filtrar minha solução no final porque estou adicionando o açúcar, que não é estéril, eu simplesmente faço isso na bancada. É mais fácil. Agora derramei todas as minhas células e sobrenadante em meus tubos de falcão de 50 mil.

Então, vou trazê-los para a centrífuga e girá-los por cerca de 10 minutos. E a única razão para girá-los é peletar as células para que eu tenha sobrenadantes claros. As células agora foram reduzidas, então o sobrenadante está claro e é isso que eu queria coletar.

Então, vou coletar todo o sobrenadante em um frasco limpo de 150 centímetros quadrados. E a este frasco vou adicionar o açúcar. Então, enquanto as células estavam girando, pesei açúcar suficiente para adicionar 15 miligramas por ml de sobrenadante.

Vou deixar completamente, deixá-lo dissolver, e depois disso vou filtrar estéril meu sobrenadante. Então, agora vou adicionar o açúcar 15 miligramas por ml de sobrenadante. Coloquei a tampa de volta e, como não estou trabalhando em condições estéreis, não importa se o comeu vai para a tampa, então misturo até que todo o açúcar se dissolva.

Isso deve ser bem rápido. Sim, todo o açúcar está dissolvido agora. Então, tudo o que tenho que fazer é que o filtro estéril seja sobrenadante e depois vou alíquota

Então, normalmente eu faço alíquotas de 10 a 15 mil que armazeno a menos 20 graus. Alíquotas como essa podem ser armazenadas por vários meses. Você também pode armazenar seu TCGF na geladeira, mas eu o usaria nos próximos 10 a 15 dias.

Nos últimos dois dias, mostrei como preparar o fator de crescimento de células T, e este sobrenadante é muito simples de fazer e é muito barato de preparar. Portanto, usamos com muita frequência no laboratório para manter nossas linhagens de células T em cultura sem ter que comprar coquetéis caros de citocinas. Então, boa sorte com seus experimentos.