Name: Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 29 min 41 s
Description: Aprenda a realizar análise de expressão gênica usando microarrays com marcação indireta e hibridização fluorescente. Este método permite comparar amostras mutantes e selvagens com precisão e minimizar vieses experimentais.

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Reação reversa Transcriptase Vire bloco de aquecimento a 70-80 ° C e 42 ° C. Banhos de água também pode ser usado nesta etapa. Se estiver usando blocos de aquecimento, coloque um pouco de água para que o calor é uniforme. <ol><li> Reação priming <ol><li> Tome 3 mg de RNA </li><li> Ajustar o volume para 13 mL com água livre de RNase </li><li> Adicionar 2,5 mL de aleatório hexâmero primers (2mg/ml) </li></ol></li><li> Misturar bem e incubar a 70-80 ° C por 8 minutos. Em seguida, coloque, em gelo por 5 min. </li><li> Prepare RT cocktail (14,5 mL / rxn): <table border="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Tampão 5X First Strand </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> 0,1 M DTT </td><td> 3 mL </td></tr><tr><td> Mix dNTP aminoallyl-25X </td><td> 1,2 mL </td></tr><tr><td> SuperScript II RT (200U/μl) </td><td> 2,3 mL </td></tr><tr><td> Água </td><td> 2,0 mL </td></tr></tbody></table> * Para as reacções n, prepare Mix Master de n 0,5 alíquotas de cocktail para garantir que você não vai acabar. </li><li> Adicionar 14,5 mL de reações resfriado. </li><li> Mix (não vortex) e incubar a 42 ° C por 3-4 horas </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol> Hidrolisar RNA <ol><li> Para cada amostra, adicionar 3 mL de NaOH 1 N e 0,6 mL de 0,5 M EDTA. (Final conc.s = NaOH 100mM, EDTA 10mM) </li><li> Misturar e incubar a 65 ° C por 10 minutos. </li><li> Neutralize adicionando 33,6 mL HEPES 1M, pH = 7,0 (final conc .= 500mM HEPES) </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol> Purificação de reação: Remoção de unincorporated aa-dUTP e aminas livres Nota: Este protocolo de purificação é modificado a partir da PCRpurification QIAquick Qiagen protocolo kit. A lavagem de fosfato e buffers de eluição são substituídos pela Qiagen buffers fornecidos porque os buffers Qiagen contêm aminas livres que competem com a reação de acoplamento Cy corante. As colunas do kit de mini-prep também pode ser usado. <ol><li> Mistura de reacção cDNA com 300 ml (ou volume de reação 5X = mL 336) tampão PB (Qiagen fornecido) e transferir para a coluna QIAquick. </li><li> Coloque a coluna em um tubo de coleta de 2 ml (Qiagen fornecido) e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. Tubo de coleta vazio. </li><li> Para lavar, adicionar 750 mL de fosfato tampão de lavagem (não Qiagen) para a coluna e centrifugar a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Esvaziar o tubo de coleta e repetir a lavagem 750 mL e etapa de centrifugação. </li><li> Esvaziar o tubo de coleta e centrifugar a coluna um adicional de 1 minuto na velocidade máxima. </li><li> Transferência da coluna para um novo microtubo de 1,5 mL e com cuidado, 30 mL de fosfato tampão de eluição. (Ver secção preparação da solução) </li><li> Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Eluir uma segunda vez (com outra mL 30 de tampão de eluição fosfato) no mesmo tubo, repetindo as etapas 6-8. O volume de eluição final deve ser ~ 60 mL. </li><li> A quantidade de cDNA podem ser quantificados nesta fase: ng cDNA = (fator de diluição) (OD260) (37) (volume total eluído da coluna) </li><li> Amostra seca em uma velocidade vac a 45 ° C. </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C, se necessário. </li></ol> Acoplamento aa-cDNA para Cy Ester Dye <ol><li> Ressuspender aminoallyl marcado cDNA com 10 ml 50 mM bicarbonato de sódio, pH = 9,0, se necessário. (Esta reserva deve ser feita nova a cada duas semanas) </li><li> Trabalhando em um lugar escuro, adicione a sonda a um tubo do corante Cy apropriado. Pipeta para cima e para baixo várias vezes para voltar a suspender o corante. </li><li> Incubar a reação de uma hora no escuro à temperatura ambiente. (Incubação pode ir até duas horas) </li></ol> Purificação reação II: Remoção de corante desacoplado <ol><li> À reação 35 mL adicionar 100 mM pH 5,2 NaOAc. Misture bem. </li><li> Adicionar 250 mL (ou volume de reação 5X = 225 mL) Buffer PB (Qiagen fornecido) para cada amostra e misture pipetando para cima e para baixo. </li><li> Coloque a coluna QIAquick em um tubo de coleta de 2 mL (Qiagen fornecido), aplicam-se a amostra para a coluna, e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto. Tubo de coleta vazio. </li><li> Para lavar, adicionar 0,75 mL de tampão PE (Qiagen fornecido) para a coluna e centrifugar a ~ 13.000 para 1 minuto. </li><li> Repita o passo 4. </li><li> Tubo de coleta vazio e coluna centrífuga para um 1 minuto adicional na velocidade máxima. </li><li> Coloque em uma coluna limpa microtubo de 1,5 mL e adicionar 30 mL cuidadosamente tampão EB (Qiagen fornecido) para o centro da membrana da coluna. </li><li> Incubar por 1 minuto à temperatura ambiente. </li><li> Eluir por centrifugação a 13.000 rpm ~ por 1 minuto. </li><li> Eluir pela segunda vez no mesmo tubo, repetindopassos 7-9. O volume final deve ser eluída ~ mL 60. </li></ol> Análise da reação de Rotulagem A quantidade de cDNA e etiqueta pode ser quantificado nesta fase: <ul><li> Medida OD 260, 550 e 650 (em branco é a água.) Use o programa microarray nanodrop. </li><li> Calcular o pmol de corantes incorporação e DNA pmol e nuc / corante relação com as equações abaixo: nucleotídeos pmol = [OD260 * volume (mL) * 37 ng / mL * 1000 pg / ng] / 324,5 pg / pmol </li></ul> Nota: 1 OD260 = 37 ng / mL para cDNA; 324,5 pg / pmol peso molecular médio de um dNTP) pmol Cy3 OD550 = volume * (mL) / 0,15 pmol Cy5 = OD650 * volume (mL) / 0,25 nucleotídeos / relação dye = cDNA pmol / pmol Cy dye Se você estiver usando nanodrop, já dá pmol / mL para cada corante. Você só precisa multiplicar esse número por volume para obter a incorporação de corantes totais pmol. Nota:&gt; 150-200 pmol de incorporação de corante por amostra e uma proporção de menos de 20 nucleotídeos / moléculas de corante é ideal para hibridizações. <ul><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C no escuro. <ul><li> Combine sondas a ser hibridizado juntos e seco no speedvac a 42 ° C. </li><li> Amostras podem ser armazenadas a -20 ° C até estar pronto para hyb. </li></ul></li></ul> Pré-hyb slides <ol><li> Slides lugar rosto para baixo sobre RT 100 mL de água em um suporte de lâmina limpa vermelha por 3-5 minutos </li><li> Encaixe a lâmina seca, colocando a face para cima em um bloco de aquecimento 100 ° C por alguns segundos - relógio para a condensação de desaparecer </li><li> UV ligação transversal a lâmina de 250 mJoules (Digite 2500 para o reticulador UV) </li><li> Slides hidratar por imersão em pré-aquecido a água 42 C °. Spin-5 min a 700 RPM na RT. </li><li> Slides incubar em jarra de Coplin 50ml contendo pré-aquecido pré-hyb (5XSSC, BSA 1%, 0,1% SDS) para pelo menos 45 minutos @ 42 ° C, e de incubação pode ir mais longe, se necessário. 50 buffer de pré-hyb mL: 12,5 mL 20x SSC, 10 ml BSA 5%, 0,5 ml SDS 10%, 27 mL de água </li><li> Dip slides na pré-aquecido a água (42 ° C) e agitar um par de minutos para remover o pré-hyb buffer. </li><li> Enxágüe em isopropanol e spin 5 min a 700 rpm, temperatura ambiente, para secar. </li></ol> Amostras preparando para a hibridização <ol><li> Ressuspender sonda em água (volumes são apresentados abaixo) <table border="0"><tbody><tr><td> Para vol total. = 30μl </td><td> Para vol total. = 35μl </td><td> Para o total vol .= 40μl </td><td></td></tr><tr><td> 19,8 mL de água </td><td> 23,55 mL de água </td><td> 27,2 mL de água </td><td> </td></tr><tr><td> 1,5 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 1,5 mL </td><td> 10 mg / ml de DNA de esperma de salmão (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1,2 mL </td><td> 1,2 mL </td><td> 1,2 mL </td><td> 12,5 mg / ml tRNA </td></tr><tr><td> 4,5 mL </td><td> 5,25 mL </td><td> 6 mL </td><td> 20XSSC (final 3x) </td></tr><tr><td> 3 mL </td><td> 3,5 mL </td><td> 4 mL </td><td> 1% SDS </td></tr></tbody></table> Nota: A ordem de adição dos reagentes são importantes. Não preparar mix master. </li><li> Ferva por 5 minutos, depois de spin 5 minutos a 14.000 rpm. Esfriar por 2 min à temperatura ambiente. </li></ol> Hibridização <ol><li> Adicionar 10-12 mL de 3X SSC aos poços da câmara de hibridação em cada ponta e no meio. </li><li> Adicionar um deslizamento levantador limpa para a área apropriada da lâmina e gentilmente carga em solução de hibridização (30 mL -40). Deve haver em cada amostra adicional borda da lamínula. </li><li> Coloque o slide na câmara. Aperte os parafusos e colocar em banho-maria a 65 ° C durante a noite. Não coloque a câmara diretamente sobre o fundo do banho-maria. Coloque um bloco no topo da câmara superior para manter tudo no lugar. Mantenha a tampa do banho de água para proteger as amostras sensíveis à luz. </li></ol> Hyb Lava <ol><li> Preparar os buffers seguinte: <ul><li> SSC 1X, SDS 0,05% </li><li> 0,06 X SSC </li></ul></li><li> Depois de a câmara de incubação de hibridação unseal. Remove o slide da câmara, tomando cuidado para não perturbar a lamela. </li><li> Para remover lamelas, lâminas de submergir em um prato quente contendo 1X SSC, 0,05% SDS lamela tampão de lavagem de frente para o fundo do prato. A lamela cairá movendo o lado deslize para o lado. </li><li> Após a lamínula é retirada, coloque o slide em um rack de um banho quente fresco com 1XSSCm SDS 0,05%. Agitar por alguns minutos </li><li> Transferência de slides mais rack para um banho de 0,06 X SSC. </li><li> Transferência de slides para outro baª de 0,06 X SSC contendo um rack novo, apagando o slide sobre um papel toalha para remover o máximo tampão contendo SDS-quanto possível antes de colocar no banho fresco. </li><li> Agitar slides para um par de minutos. </li><li> Girar imediatamente à temperatura ambiente por 5 min @ 700 rpm, em seguida, slides estão prontos para fazer a varredura. Loja no escuro até digitalizada. </li></ol>

<ol><li>Hasseman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Aminoallyl+Labeling+of+RNA+for%5BTitle%5D)+AND+%22Microarrays+%26+TIGR+Microarray+Labeled+Probe+Hybridization%22%5BJournal%5D)">TIGR Aminoallyl Labeling of RNA for.</a> Microarrays & TIGR Microarray Labeled Probe Hybridization. , Forthcoming.</li>
<li>Gilbert,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIGR+Microbial+RNA+Aminoallyl+Labeling+for+Microarrays+%26+Hybridization+of+probed+labels%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">TIGR Microbial RNA Aminoallyl Labeling for Microarrays & Hybridization of probed labels.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Hedge,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concise+guide+to+cDNA+Microarray+analysis-II%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">A concise guide to cDNA Microarray analysis-II.</a> , Forthcoming.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AA-dUTP</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0410</td><td>5-(3-aminoalil)-2&amp;rsquo;desoxiuridina-5&amp;rsquo;trifosfato</td></tr><tr><td>dNTP</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2035-01</td><td>Conjunto de dNTP 100 mM, grau PCR</td></tr><tr><td>Primeres hexaméricos aleatórios</td><td></td><td>Amersham</td><td>27-2166-01</td><td>3 mg/mL</td></tr><tr><td>SuperScript III RT</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>80800444</td><td>200 U/&amp;#x03BC;L</td></tr><tr><td>CyDye&amp;#8482;</td><td></td><td>Amersham</td><td>RPN5661</td><td>Pacote de corante reativo pós-marcação</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td></td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Kit de purificação de PCR</td></tr><tr><td>1 M K2HPO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M KPO4</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Para preparar um tampão fosfato 1 M (KPO4, pH 8,5–8,7), misture: 9,5 mL de K2HPO4 1 M e 0,5 mL de KH2PO4 1 M</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem fosfato</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Para 100 mL de tampão de lavagem fosfato (5 mM KPO4, pH 8,0, 80% EtOH), misture: 0,5 mL de KPO4 1 M, pH 8,5 + 15,25 mL de água MilliQ + 84,25 mL de etanol a 95%. O tampão de lavagem ficará levemente turvo. **IMPORTANTE: o tampão de lavagem fosfato deve ser preparado diariamente.</td></tr><tr><td>Tampão de eluição fosfato</td><td>Tampão</td><td></td><td></td><td>Diluir o KPO4 1 M, pH 8,5 até 4 mM com água estéril</td></tr><tr><td>Tampão de carbonato de sódio</td><td></td><td></td><td></td><td>(Na2CO3): 0,5 M, pH 9,0. Dissolva 4,2 g de NaHCO3 em 80 mL de água estéril e ajuste o pH para 9,0 com NaOH 10 N; complete o volume para 100 mL com água estéril. Para preparar uma solução 50 mM para a reação de acoplamento do corante, dilua 1:10 com água. Observação: o tampão de carbonato altera sua composição ao longo do tempo; prepare-o fresco a cada duas semanas ou mês.</td></tr></tbody></table>

análise de expressão gênica utilizando bacteriana microarrays

Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Olá, meu nome é Ena e rotineiramente realizamos perfis de expressão gênica no laboratório. Utilizamos esta técnica para monitorar genes diferencialmente regulados entre metilação e tipo selvagem. Hoje, tenho amostras de RNA de tipo selvagem e metilado, e vamos fazer primeiro a etapa de C.Utilizamos métodos de marcação indireta e a vantagem dessa técnica é evitar o viés visual que pode ocorrer na marcação direta. Para isso, temos amostras de RNA e optamos por obter três microgramas de RNA em um volume total de 13 microlitros. Em seguida, adicionamos 2,5 microlitros de hexâmeros aleatórios em nossas amostras.E vamos incubar a amostra a 75 graus para desnaturar o RNA por oito minutos. Agora, vamos adicionar o coquetel de transcrição reversa que contém mistura contínua de AM L-D-L-D-U-T-P, tampão da transcriptase reversa e também ET TT Big, e incubar a amostra a 42 graus por quatro horas. Após quatro horas, basta retirar as amostras.E agora no tubo temos uma mistura de cDNA e RNA. O que queremos fazer é hidrolisar o RNA adicionando hidróxido de sódio e EDTA, sendo que a concentração final de hidróxido de sódio deve ser cem molar. E a concentração final de EDTA deve ser cinco molar.E ag

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