Análise de Expressão Gênica Utilizando bacteriana Microarrays

Olá, meu nome é Ena e rotineiramente fazemos perfis de expressão gênica no laboratório. E usamos essa técnica para monitorar genes regulados diferenciais entre metanfetamina e tipo selvagem. E hoje eu tenho um tipo selvagem e amostras de RNA de metanfetamina e todos nós fazemos C primeiro.

Usamos métodos de rotulagem indireta e a vantagem dessa técnica é evitar o viés ocular que pode ocorrer na rotulagem direta. E para fazer isso, temos amostras de RNA e optamos por obter três microgramas de RNA em 13 microlitros do volume total. E adicionamos 2,5 micro de he aleatório em nossos parques.

E vamos incubar a amostra a sete e cinco graus para ter a natureza do RNA por oito minutos. E agora vamos adicionar o, vamos adicionar coquetel de transcrição reversa que contém AM L-D-L-D-U-T-P mistura contínua, tampão de transcriptase reversa e também ET TT Big it down E incubar a amostra a 42 graus por quatro horas. Então, depois de quatro horas, apenas retiramos as amostras.

E agora no tubo temos CDNA e RNA misturados. E o que queremos fazer é fazer RNA hidroxilado adicionando hidróxido de sódio e EDTA e a concentração final para hidróxido de sódio deve ser de cem molares. E a concentração final para e BT deve ser de cinco molares.

E agora vamos incubar amostras em banho-maria de 65 graus por 10 minutos. Portanto, a incubação é feita e utilizaremos amostras adicionando pH sete montes de água à concentração final de 500 molar. Neste ponto, você pode armazenar as amostras em menos 20 ou pode continuar com a limpeza.

Para limpeza do CDNA, usamos o kit de purificação KaiGen PCR. No entanto, como o buffer Bush e o buffer ion contêm liberação, nós não, preparamos nosso próprio buffer de arbusto de destino e buffer de íons de destino e você adicionará 300 litros de PPI e canalizaremos essa lagoa lentamente para você transferir a mistura para colunas E você girará por um minuto na velocidade mais alta E você assistirá ao, o buffer que preparamos. Tampão de lavagem de fosfato, você adicionará 750 microlitros e assim por diante, e adicionará outro Para um novamente.

Então, vamos girar novamente apenas para ter certeza de que temos todas as camas. E vamos transferir esses tubos para tubos vazios do infrator. E vou adicionar 30 marcadores de tampão fosfato E pho, que são quatro quatro molares de fosfato de potássio em pH 8,5.

E aqui você só precisa ter certeza de adicionar tudo no centro da coluna e incubar em temperatura ambiente por um minuto. Então, ele vai girar por um minuto novamente e eu vou adicionar outro buffer de 30 micro zero que eu incubar ou dormir. Então eu removo a coluna e temos um volume total de 60 micros ou CDA.

Depois de limparmos o CDNA, você pode, você pode armazená-lo a menos 20 graus e também podemos secá-lo e depois armazená-lo para que possamos secar o CDNA em feedback. Então, agora no tubo, temos CDA seco, que foi modificado. E o que faremos é suspender a amostra seca.

Vou suspender a amostra em 10 turas de bicarbonato 15 LAR em pH nove. E eu vou fazer isso subindo e descendo nesta etapa, é muito importante reusar o cDNA. Bem, para comprar a reação da corporação para funcionar, essa reação deve ocorrer na sala escura porque os rótulos fluorescentes são sensíveis à morte.

No entanto, optando por essas ciências da vida e elas são, elas vieram em pacotes individuais. S cinco tem boné roxo e o lado três tem boné laranja e também S cinco aparece Sion quando está sendo suspenso e Cary aparece magenta. Então, o que vou fazer na sala escura é transferir essas amostras para tubos de corante, suspender novamente o corante e transferi-los de volta para o tubo que tenho.

E então eu vou incubar no escuro por duas horas após duas horas de incubação, essas paradas de reação adicionando 35 re de cem acetato de sódio milimolar a pH 5,2. E depois disso, limpamos com o procedimento de limpeza semelhante. No entanto, desta vez usamos o tampão de lavagem e o tampão de eluição fornecidos pela Cajun.

Você pode descrever os locais em que colocou a amostra e que devem limpar o instrumento. Então você pode sua amostra ou sua mistura agora mesmo I To, então esta é minha amostra rotulada de ficção científica e aqui o que vemos é OD dois 60, que mostra o conteúdo de CDA e OD seis 50, que mostra a incorporação D para ficção científica. E aqui está minha amostra de rótulo do lado três.

Mais uma vez, torça seis concentração e cinco 50 medidas local três incorporação. Como minha corporação D funciona com eficiência, vou combinar amostras agora, Sra. Miss brevemente. E agora vamos escrever um exemplo novamente usando comentários.

Ok, então, para a ização do slide, vamos reidratar colocando universalmente o slide em cima da água e isso tornará os pontos maiores. E então, para proteger isso, vamos secar a cem graus Celsius e, em seguida, hibridizar UV ou cruzar UV os pontos na lâmina e, em seguida, incubaremos no buffer pré-alto que temos. Então eu coloco o escorregador virado para baixo, mas ele ainda não toca na água.

E vamos esperar assim por cinco minutos. Eu, então esta caixa parece maior, eles devem ser mais brilhantes do que antes de você colocar, e você vai secar colocando o slide em cem graus e você observará a condensação. E vamos cruzar o link com você.

Então, para hidratação, vou mergulhar o escorregador na água pré-guerra. E isso deve ser muito rápido porque o objetivo aqui é que você queira se livrar de todas as manchas ou de todos os oligos no local que não estão ligados. E se você for devagar nesse processo, obterá apenas combinações em seus pontos.

Então, certifique-se de que você está realmente fazendo isso rápido e certifique-se de não pegar seu vôo para fora da água e fazer essas coisas por 30 segundos e apenas fut imediatamente em temperatura ambiente por cinco minutos e 700 ar pm Pegue isso, encaixamos este slide no buffer da estação de tubos pré-guerra que tínhamos E empurrando lentamente o slide para dentro do frasco e vamos incubá-lo a 42 graus por pelo menos pelo menos 45 minutos. Então, aqui temos nossa amostra seca para ser hibridizada. Então, primeiro suspenderemos Resus na água.

Nesta etapa, apenas suspendemos novamente acontecendo para cima e para baixo e possível não expor a amostra muito branca, branca. E então você adicionará o DNA do esperma de alguém 1,5 e a concentração é de 10 miligramas por mil. E você adicionará 1.2 profissional de marketing de TRNA.

A concentração é de 12,5 miligramas por, adicionamos tRNA e DNA de esperma para bloquear hidro inespecífico. E adicionamos 5,35 marcador zero três XSSC, o que dá a concentração final de três x. E, finalmente, adicionamos 3,5 microlitros de 1% SDS.

Agora vamos ferver a mistura por cinco minutos e girar na velocidade mais alta por cinco minutos e ela estará pronta para isso. Já se passou uma hora desde que incubamos nosso slide e agora tenho água e isopropanol. Então, vou agitar o slide na água primeiro para me livrar do SDS e depois lavar o propanol dza e colocá-lo diretamente no medidor padrão.

E aqui, tome cuidado para não expor muito a luz ao ar para evitar o ressecamento. Então eu vou diretamente do buffer da estação de dano para a água E lavamos o slide. Alguns minutos, apenas certifique-se de que o movimento seja apenas para cima e para baixo, não para os lados.

E também certifique-se de que o slide não esteja acima da água e vamos transferi-lo para isopropanol imediatamente. E ele fica aqui por alguns minutos novamente. E sua página poderia responder sua página em temperatura ambiente por cinco minutos?

700 R.Cool. Portanto, nosso slide também está pronto para ser hibridizado e é melhor mantê-lo em uma caixa de slides para protegê-lo do ônibus. Então, para a estação de colheita, usaremos elevador ou deslizamento.

Há tiras brancas na lamínula e elas fornecerão alguma sustentação e fornecerão algum espaço para nossa amostra entrar entre a lamínula e o slide. E eu limpo com etanol E então fio colocado E apenas certifique-se de que não há partícula de teste. Então, primeiro pegaremos nosso modelo de slide que marcamos na área de impressão e, em cima dele, colocaremos o slide que preparamos e garantiremos que eles se alinhem perfeitamente.

Certifique-se de que eles se alinham perfeitamente. E você precisa ter certeza de que as tiras estão na lateral, que vamos enfrentá-las para baixo. Portanto, é muito difícil de ver, mas certifique-se de que você pode vê-lo.

E as listras devem estar nas laterais dos slides. E vamos carregar nossa amostra pelos lados. Eu pego pequenas quantidades de amostra, então pego 15 microlitros primeiro e começo a carregar do canto da lamínula.

E lentamente eu o puxava e me movia ao longo da borda para cobrir toda a área. Nesta fase, é muito importante não introduzir bolhas e pego outro migrador 15 e aplico na lateral das lâminas para evitar qualquer ressecamento. Portanto, nossa amostra está pronta e você incubará nossas lâminas e câmaras de priorização, que possuem microcanais para hidratar a lâmina durante a hibridização.

E adicionaremos 10 profissionais de marketing de três XSSC em seis cantos do slide. Havia seis lugares no, na câmara, desculpe, em cada canto eu, e de cada lado, certifique-se de transferir o slide com muito cuidado para que a lamínula não escorregue. E quando você colocar o slide com o lado direito para cima, você verá que ele vai empilhar, vai grudar na água que você colocou e colocar a tampa E certifique-se de que os parafusos estejam apertados.

Vamos incubar a câmara de conversação em um saco de água de 65 graus, mas não queremos colocá-lo diretamente no fundo. Então, colocamos algum tipo de barreira de plástico para evitar o excesso de transferência de calor. E colocamos nossa câmara de ização suavemente e para evitar qualquer deslocamento, você também pode colocar algum tipo de peso.

E essa incubação durará durante a noite, normalmente entre 10 a 12 horas. Portanto, para a lavagem da fatia, usamos um XSSC com 0,05% de SDS. Isso será para remover a lamínula.

E isso vai ser para lavar o primeiro passo. E faremos mais duas etapas apenas com 0,06%seis XSC em todo o SDS que temos. Então, todos nós estragamos a conversa e pegamos slides e os colocamos virados para baixo no recipiente da bolsa.

E vamos apenas sacudi-lo de um lado para o outro e veremos que a lamínula cairá suavemente. Tudo bem, e, E vamos apenas transferir para outro buffer de lavagem que contenha XES. Você fica por um minuto.

Mova-se para ir oh seis XSSC. E só para ter certeza de que nos livramos de todos os FDS, vamos repeti-lo mais uma vez. A centrífuga para secar estava em temperatura ambiente por cinco minutos a 700 RP. Você mantém este slide na caixa de slides porque é sensível à luz.

Então, este é o scanner de slides e você colocará o slide aqui, pouco espaço aqui, colocará o slide voltado para baixo, rotulado em direção a e, E no segundo slide, você apenas definirá a área que deseja digitalizar. E você verá essa área em nossos slides. Nós temos, usamos 16 pinos para imprimir nossos slides.

Portanto, cada bloco corresponde a um alfinete e nossos slides contêm mais de 8.000 pontos. E representamos o genoma da cor vi duas vezes porque tem cerca de 4.000 genes. Portanto, temos dois pontos para cada oligo que usamos.

E se eles aumentarem o zoom, você veria neste experimento em particular, comparamos mutantes reguladores de transcrição com o tipo selvagem, e o mutante seria rotulado com scifi, que dá a cor vermelha. E o tipo selvagem era o local três, que dá a cor verde. Então, qualquer coisa que pareça vermelha, como essas manchas, indica que a abundância dos transcritos no mutante era maior do que no tipo selvagem.

Então eles aparecem vermelhos ou tons de vermelho, e qualquer coisa que pareça verde indica que a abundância do transcrito foi maior no tipo selvagem em comparação com o mutante. E qualquer ponto que apareça amarelo indica que esse transcrito estava igualmente presente tanto no mutante quanto no selvagem. Então, quando eles se sobrepõem, eles aparecem amarelos como esses mas.