Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas
May 23rd, 2012
Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H & E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H & E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.
O objetivo geral deste procedimento é caracterizar ilhós pancreáticos humanos usando coloração de hematina e eosina e imuno-histoquímica. Isso é feito criando seções seriais a partir de uma amostra de pâncreas embutida em um bloco de parafina. As seções são então colocadas em slides em sua orientação original.
Uma parte das lâminas é corada com hematina e eoína, enquanto as lâminas restantes são coradas por imuno-histoquímica, a etapa final é escanear as lâminas coradas e organizá-las por caso. Em última análise, essas imagens podem ser carregadas em um banco de dados de patologia online, onde podem ser visualizadas por outros pesquisadores da área. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que as lâminas são coradas em série, mantendo sua orientação original.
Demonstrando o procedimento estarão Linda Snyder, tecnóloga em histo, Emily Montgomery, cientista biológica, e Tiffany Hippo, técnica de laboratório em meu laboratório. Para começar, configure o banho-maria e o micrótomo seguindo os procedimentos padrão para microtomia com parafina. Em seguida, rotule as lâminas carregadas positivamente com o número do caso, a região do pâncreas e o número da lâmina.
Depois que tudo estiver preparado, coloque o bloco de parafina no mandril do micrótomo com a etiqueta do no lado esquerdo. Após os procedimentos normais de microtomia, corte o bloco até que o tecido esteja uniformemente exposto. Uma vez que o tecido seja encontrado uniformemente, produza uma fita de seções seriais com cerca de quatro mícrons de espessura.
Três a seis seções são necessárias, dependendo do número de manchas iniciais necessárias. Em seguida, separe as seções da faixa de opções. Pegue cada seção em ordem e coloque-a em um slide.
Registre o número da seção com um lápis. Se uma seção estiver inutilizável, pule esse número e continue numerando as seções na ordem exata. Tome cuidado para manter a mesma orientação no slide encontrada no com a etiqueta do slide voltada para a esquerda.
Em seguida, coloque as lâminas em um rack de slides e deixe-as secar durante a noite. À temperatura ambiente, feche novamente a superfície do bloco de parafina com uma fina camada de parafina para preservar o tecido e arquive-o em temperatura ambiente ou menos 20 graus Celsius. Repita este procedimento para a próxima amostra.
É importante manter a numeração das seções seriais em cada nível, como visto acima, ou para a coloração h e e. Coloque a primeira lâmina de cada bloco em um rack de slides e, em seguida, coloque o rack na primeira bandeja do corante automático. Selecione o programa HE padrão e inicie o processo de coloração.
Quando a coloração terminar, remova as lâminas do corante automático e coloque-as no capô para que a tampa deslize. Coloque uma lamínula em cada lâmina usando técnicas padrão. Por fim, rotule os slides com uma etiqueta impressa e deixe-os secar completamente no capô.
Comece configurando o corante automático e preparando todos os reagentes necessários. Escolha o programa Daco para manchas duplas. Insira o número de lâminas e o tratamento que cada uma receberá.
Carregue todos os reagentes no corante automático de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, prepare TBST e citrato, tampões, anticorpos e outros reagentes necessários para o procedimento. Retire a análise das lâminas colocando-as em xileno durante cinco minutos.
Não permita que as lâminas sequem, pois isso resultará em manchas excessivas de fundo e poros enquanto as lâminas estiverem depa. Despeje o tampão de citrato em um vaporizador para pré-aquecer antes de usar. Em seguida, submeta as lâminas de depa a uma série de lavagens com etanol.
Enxágue as lâminas uma última vez em água deionizada. Adicione as lâminas ao tampão de citrato pré-aquecido e deixe-as cozinhar por 30 minutos. Após este período, transfira imediatamente as lâminas para um banho-maria à temperatura ambiente até que arrefeçam completamente.
Depois de resfriado, transfira as lâminas para os racks Dayco auto Stainer, tomando cuidado para manter a sequência adequada. Por fim, execute o programa de coloração dupla que foi carregado anteriormente quando o programa de coloração dupla for concluído. Remova as lâminas do corante automático e deixe-as secar por pelo menos uma hora antes de desidratar.
Para continuar a desidratação, transfira-os para 80% de etanol por um minuto. Continue desidratando as lâminas mergulhando-as em etanol a 95% e depois em 100%. Por fim, mergulhe e segure as lâminas em xileno por um minuto.
Monte imediatamente as corrediças com lamínulas usando vedação cyto Para concluir o procedimento. Imprima etiquetas que contenham as informações do caso, incluindo o número do órgão e do bloco, o tipo de mancha e a data. Coloque uma etiqueta em cada lâmina para digitalizar as lâminas de mancha.
Coloque-os em uma bandeja de scanner e siga os procedimentos padrão. Arquive as lâminas de mancha em temperatura ambiente e quaisquer lâminas não manchadas restantes a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Por fim, organize as imagens coradas por doador e tipo de tecido visto.
Aqui está um exemplo de coloração de KI 67 mais insulina em níveis baixos e altos de ampliação. As imagens dos cortes pancreáticos corados são submetidas a um banco de dados de patologia on-line, criando um biobanco virtual. Usando esse banco de dados, os investigadores podem acessar rapidamente as informações necessárias para pesquisas e diabetes tipo um.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e manchar lâminas de alta qualidade do pâncreas humano.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra procedimentos para a caracterização de ilhotas pancreáticas humanas usando coloração hematoxilina e eosina (H&E) e imunohistoquímica (IHC). A técnica permite a avaliação da composição endócrina das ilhotas, replicação celular e infiltrados inflamatórios.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Endocrinologia
- Histologia
Fundamentos
- As ilhotas pancreáticas humanas desempenham um papel crucial no metabolismo da glicose.
- A caracterização da composição das ilhotas é essencial para entender o diabetes.
- H&E e IHC são técnicas padrão para análise de tecidos.
- Manter a orientação original das lâminas é crítico para uma avaliação precisa.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar ilhotas pancreáticas humanas.
- Determinar a composição endócrina das ilhotas.
- Avaliar replicação celular e respostas inflamatórias.
Métodos Utilizados
- Criação de secções seriadas a partir de amostras de pâncreas emparaffinadas.
- Coloração das secções com H&E e IHC.
- Escaneamento de lâminas coloridas para análise.
- Organização das imagens por caso para upload no banco de dados.
Principais Resultados
- Identificação de insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático nas ilhotas.
- Avaliação da replicação celular usando coloração Ki67.
- Avaliação de infiltrados inflamatórios através da coloração H&E e CD3.
- Localização bem-sucedida da região uncinada usando IHC.
Conclusões
- O método fornece uma caracterização abrangente das ilhotas pancreáticas.
- Manter a orientação original da lâmina melhora a precisão da análise.
- Os resultados contribuem para a compreensão da função pancreática na saúde e doença.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
