Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas
23 de maio de 2012
Este vídeo demonstra os procedimentos para caracterização de ilhotas pancreáticas humanas com hematoxilina e eosina (H & E) e imuno-histoquímica (IHQ). Seções pancreáticas de cabeça, corpo e regiões da cauda estão manchadas por tanto H & E e IHC para determinar a composição endócrino ilhéu (insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático), a replicação celular (Ki67), e infiltrado inflamatório (H & E, CD3). A região uncinado está localizado usando IHC para polipeptídeo pancreático.
O objetivo geral deste procedimento é caracterizar ilhotas pancreáticas humanas utilizando coloração com hematoxilina e eosina e imunohistoquímica. Isso é realizado criando cortes seriados a partir de uma amostra de pâncreas embutida em um bloco de parafina. Os cortes são então colocados em lâminas mantendo sua orientação original.
Uma parte das lâminas é corada com hematina e eosina, enquanto as lâminas restantes são coradas por imunohistoquímica; o passo final é escanear as lâminas coradas e organizá-las por caso. Em última análise, essas imagens podem ser carregadas em um banco de dados on-line de patologia, onde podem ser visualizadas por outros pesquisadores da área. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que as lâminas são coradas em série, mantendo sua orientação original.
Para demonstrar o procedimento, estarão presentes Linda Snyder, histotecnóloga, Emily Montgomery, cientista biológica, e Tiffany Hippo, técnica de laboratório do meu laboratório. Para começar, prepare o banho-maria e o micrótomo seguindo os procedimentos padrão para microtomia em parafina. Em seguida, rotule lâminas com carga positiva com o número do caso, a região do pâncreas e o número da lâmina.
Uma vez que tudo esteja preparado, coloque o bloco de parafina na morsa do micr&otómo com o rótulo da cassete no lado esquerdo. Seguindo os procedimentos normais de microtomia, corte o bloco até que o tecido seja uniformemente exposto. Quando o tecido for encontrado de maneira homogênea, produza uma fita de cortes seriados com cerca de quatro mícrons de espessura.
São necessárias de três a seis seções, dependendo do número de colorações iniciais exigidas. Em seguida, separe as seções da fita. Pegue cada seção em ordem e coloque-a sobre uma lâmina.
Registre o número da seção com um lápis. Se uma seção for inutilizável, pule esse número e continue numerando as seções em ordem exata. Tenha cuidado para manter a mesma orientação no lâmina da forma como estava na cassete, com o rótulo do lâmina orientado para a esquerda.
Em seguida, coloque as lâminas em uma grade para lâminas e deixe secar durante a noite. À temperatura ambiente, resele a superfície do bloco de parafina com uma fina camada de parafina para preservar o tecido e armazene-o à temperatura ambiente ou a menos 20 graus Celsius. Repita este procedimento para a próxima amostra.
É importante manter a numeração das seções seriadas em cada nível, conforme mostrado acima para a coloração com hematoxilina e eosina. Coloque a primeira lâmina de cada bloco em uma rack de lâminas e, em seguida, posicione a rack na primeira bandeja do coloridor automático. Selecione o programa padrão de HE e inicie o processo de coloração.
Quando a coloração estiver concluída, remova as lâminas do coloridor automático e coloque-as na capela para a aplicação das lamínulas. Aplique uma lamínula em cada lâmina utilizando técnicas padrão. Por fim, identifique as lâminas com um rótulo impresso e deixe-as secar completamente na capela.
Comece configurando o coloridor automático e preparando todos os reagentes necessários. Escolha o programa Daco para colorações duplas. Insira o número de lâminas e o tratamento que cada uma receberá.
Carregue todos os reagentes no estainador automático de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, prepare o TBST e o citrato, tampões, anticorpos e outros reagentes necessários para o procedimento. Desparafine as lâminas colocando-as em xilol por cinco minutos.
Não permita que as lâminas sequem, pois isso resultará em fundo excessivo e coloração dos poros enquanto as lâminas estiverem em depa. Despeje tampão de citrato em um vaporizador para pré-aquecimento antes do uso. Em seguida, submeta as lâminas depa a uma série de lavagens com etanol.
Lave as lâminas uma última vez com água desionizada. Adicione as lâminas ao tampão de citrato pré-aquecido e deixe-as em banho-maria por 30 minutos. Após esse período, transfira imediatamente as lâminas para um banho de água à temperatura ambiente até que esfriem completamente.
Uma vez resfriado, transfira as lâminas para as grades do estainador automático Dayco, tomando cuidado para manter a sequência correta. Por fim, execute o programa de coloração dupla que foi carregado anteriormente; quando o programa de coloração dupla for concluído, remova as lâminas do estainador automático e deixe-as secar por pelo menos uma hora antes da desidratação.
Para continuar a desidratação, transfira-os para etanol 80% por um minuto. Continue desidratando as lâminas mergulhando-as em etanol 95% e, em seguida, em etanol 100%. Por fim, mergulhe e mantenha as lâminas em xilol por um minuto.
Monte imediatamente as lâminas com lamínulas utilizando cyto seal para concluir o procedimento. Imprima rótulos contendo as informações do caso, incluindo o órgão e o número do bloco, o tipo de coloração e a data. Coloque um rótulo em cada lâmina para digitalizar as lâminas coradas.
Coloque-os em uma bandeja de scanner e siga os procedimentos padrão. Arquive as lâminas coradas em temperatura ambiente e quaisquer lâminas não coradas remanescentes a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Por fim, organize as imagens coradas por doador e tipo de tecido observado.
Aqui está um exemplo da coloração para KI 67 e insulina em níveis baixo e alto de ampliação. As imagens das seções pancreáticas coradas são enviadas a um banco de dados on-line de patologia, criando um biobanco virtual. Utilizando este banco de dados, os pesquisadores podem acessar rapidamente as informações necessárias para pesquisas sobre diabetes tipo 1.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar e corar lâminas de alta qualidade a partir do pâncreas humano.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra os procedimentos para a caracterização de ilhotas pancreáticas humanas utilizando coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e imuno-histoquímica (IHC). A técnica permite a avaliação da composição endócrina das ilhotas, da replicação celular e dos infiltrados inflamatórios.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Endocrinologia
- Histologia
Contexto
- As ilhotas pancreáticas humanas desempenham um papel crucial no metabolismo da glicose.
- A caracterização da composição das ilhotas é essencial para o entendimento do diabetes.
- H&E e IHC são técnicas padrão para análise de tecidos.
- A manutenção da orientação original dos cortes é fundamental para uma avaliação precisa.
Objetivo do Estudo
- Caracterizar ilhotas pancreáticas humanas.
- Determinar a composição endócrina das ilhotas.
- Avaliar a replicação celular e as respostas inflamatórias.
Métodos Utilizados
- Criação de cortes seriados a partir de amostras de pâncreas emblocadas em parafina.
- Coloração dos cortes com H&E e IHC.
- Escaneamento de lâminas coradas para análise.
- Organização das imagens por caso para upload no banco de dados.
Resultados Principais
- Identificação de insulina, glucagon e polipeptídeo pancreático em ilhotas.
- Avaliação da replicação celular utilizando coloração para Ki67.
- Avaliação de infiltrados inflamatórios por meio das colorações H&E e CD3.
- Localização bem-sucedida da região unciforme utilizando IHC.
Conclusões
- O método fornece uma caracterização abrangente das ilhotas pancreáticas.
- Mantendo a orientação original da lâmina, melhora-se a precisão da análise.
- Os resultados contribuem para a compreensão da função pancreática na saúde e na doença.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Fluxos de trabalho padronizados de histopatologia para ilhotas pancreáticas humanas permitem a caracterização reprodutível de células endócrinas, apoiando a validação de alvos na pesquisa sobre diabetes. Ao preservar a orientação de cortes seriados e gerar imagens digitais completas de lâminas, o método facilita o compartilhamento cruzado de dados e o biobanco para desvio mecanicista de terapias direcionadas às ilhotas. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer dados quantificáveis e com resolução espacial sobre a composição, replicação e infiltrados imunes das ilhotas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio de histopatologia rigorosa e imunolocalização de células endócrinas das ilhotas.
- Valor Operacional: Apoia a desmistificação biológica por meio da caracterização da morfologia, tamanho, densidade e composição celular endócrina das ilhotas utilizando colorações H&E e IHC.
- Valor Preditivo: Auxilia na triagem de portfólios por meio da avaliação da replicação das ilhotas e de células apoptóticas por meio de Ki67 e outros marcadores de proliferação.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores por meio do processamento padronizado do pâncreas humano em regiões definidas (cabeça, corpo, cauda) e seções transversas.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade de ensaios mediante a numeração e indicação alfabética de subseções com base no tamanho, permitindo uma análise completa das seções transversas.
- Valor da Plataforma: Destaca a prontidão para triagem e escalabilidade por meio de imagens digitais completas de lâminas organizadas em um banco de dados on-line de patologia, acessível a mais de 200 pesquisadores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância da doença ao avaliar ilhotas para inflamação, fibrose, amiloide e infiltrados de linfócitos T usando coloração H&E e CD3.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica mediante a avaliação de compartimentos endócrinos e exócrinos, incluindo patologia ductal e neoplasia.
- Avanço Ajustado ao Risco: Foca na desmistificação preditiva ao caracterizar neoplasia intraductal pancreática e sua relação com o sistema ductal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a avaliação pré-clínica, permitindo o corte em série, a coloração padronizada e o biobanco digital de tecido pancreático humano.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias por meio da histopatologia e imunolocalização de ilhotas pancreáticas e células endócrinas.
- Triagem: Garante prontidão e reprodutibilidade do ensaio mediante a manutenção da orientação original das lâminas durante o corte seriado e a coloração em série.
- Análises: Destaca medições quantitativas da área das ilhotas, número, composição celular endócrina, replicação e infiltrados de linfócitos T por meio de H&E e IHC, permitindo comparação entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica pela avaliação de amiloidose insular, fibrose e infiltrados inflamatórios relevantes para a patogênese do diabetes tipo 1.
- Reutilização Corporativa: Estrutura o método como uma capacidade reutilizável por meio de um banco de dados on-line de patologia que permite compartilhamento rápido de dados e seleção de blocos para cortes seriados em parafina ou congelados.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista na composição endócrina das ilhotas e nas interações imunes.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do corte seriado, coloração e arquivamento digital de lâminas.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguimento ou interrupção, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante identificação precoce de patologias das ilhotas e status de replicação.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base em morfologia, densidade e fenótipos celulares endócrinos das ilhotas quantificáveis.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em histotecnologia, imuno-histoquímica e fluxos de trabalho em patologia digital.
- Necessidades de instrumentação e infraestrutura analítica, incluindo micrótomo, colorador automático, scanner de lâminas e acesso a banco de dados online de patologia.
- Requisitos de padronização entre equipes, particularmente para rotulagem de lâminas, numeração de cortes e manutenção da orientação entre as equipes de histologia e de imagem.
- Considerações sobre adaptação em diferentes sistemas modelo, especialmente ao aplicar o processamento regional padronizado (cabeça, corpo, cauda) a pâncreas de espécies não humanas.
- Limitações práticas incluem a variabilidade tecidual proveniente de doadores de órgãos e a necessidade de validação otimizada de anticorpos para coloração imuno-histoquímica múltipla.
