Protocolos de coloração de ilhotas pancreáticas humanas

O objetivo geral deste procedimento é caracterizar ilhós pancreáticos humanos usando coloração de hematina e eosina e imuno-histoquímica. Isso é feito criando seções seriais a partir de uma amostra de pâncreas embutida em um bloco de parafina. As seções são então colocadas em slides em sua orientação original.

Uma parte das lâminas é corada com hematina e eoína, enquanto as lâminas restantes são coradas por imuno-histoquímica, a etapa final é escanear as lâminas coradas e organizá-las por caso. Em última análise, essas imagens podem ser carregadas em um banco de dados de patologia online, onde podem ser visualizadas por outros pesquisadores da área. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é que as lâminas são coradas em série, mantendo sua orientação original.

Demonstrando o procedimento estarão Linda Snyder, tecnóloga em histo, Emily Montgomery, cientista biológica, e Tiffany Hippo, técnica de laboratório em meu laboratório. Para começar, configure o banho-maria e o micrótomo seguindo os procedimentos padrão para microtomia com parafina. Em seguida, rotule as lâminas carregadas positivamente com o número do caso, a região do pâncreas e o número da lâmina.

Depois que tudo estiver preparado, coloque o bloco de parafina no mandril do micrótomo com a etiqueta do no lado esquerdo. Após os procedimentos normais de microtomia, corte o bloco até que o tecido esteja uniformemente exposto. Uma vez que o tecido seja encontrado uniformemente, produza uma fita de seções seriais com cerca de quatro mícrons de espessura.

Três a seis seções são necessárias, dependendo do número de manchas iniciais necessárias. Em seguida, separe as seções da faixa de opções. Pegue cada seção em ordem e coloque-a em um slide.

Registre o número da seção com um lápis. Se uma seção estiver inutilizável, pule esse número e continue numerando as seções na ordem exata. Tome cuidado para manter a mesma orientação no slide encontrada no com a etiqueta do slide voltada para a esquerda.

Em seguida, coloque as lâminas em um rack de slides e deixe-as secar durante a noite. À temperatura ambiente, feche novamente a superfície do bloco de parafina com uma fina camada de parafina para preservar o tecido e arquive-o em temperatura ambiente ou menos 20 graus Celsius. Repita este procedimento para a próxima amostra.

É importante manter a numeração das seções seriais em cada nível, como visto acima, ou para a coloração h e e. Coloque a primeira lâmina de cada bloco em um rack de slides e, em seguida, coloque o rack na primeira bandeja do corante automático. Selecione o programa HE padrão e inicie o processo de coloração.

Quando a coloração terminar, remova as lâminas do corante automático e coloque-as no capô para que a tampa deslize. Coloque uma lamínula em cada lâmina usando técnicas padrão. Por fim, rotule os slides com uma etiqueta impressa e deixe-os secar completamente no capô.

Comece configurando o corante automático e preparando todos os reagentes necessários. Escolha o programa Daco para manchas duplas. Insira o número de lâminas e o tratamento que cada uma receberá.

Carregue todos os reagentes no corante automático de acordo com as recomendações do fabricante. Em seguida, prepare TBST e citrato, tampões, anticorpos e outros reagentes necessários para o procedimento. Retire a análise das lâminas colocando-as em xileno durante cinco minutos.

Não permita que as lâminas sequem, pois isso resultará em manchas excessivas de fundo e poros enquanto as lâminas estiverem depa. Despeje o tampão de citrato em um vaporizador para pré-aquecer antes de usar. Em seguida, submeta as lâminas de depa a uma série de lavagens com etanol.

Enxágue as lâminas uma última vez em água deionizada. Adicione as lâminas ao tampão de citrato pré-aquecido e deixe-as cozinhar por 30 minutos. Após este período, transfira imediatamente as lâminas para um banho-maria à temperatura ambiente até que arrefeçam completamente.

Depois de resfriado, transfira as lâminas para os racks Dayco auto Stainer, tomando cuidado para manter a sequência adequada. Por fim, execute o programa de coloração dupla que foi carregado anteriormente quando o programa de coloração dupla for concluído. Remova as lâminas do corante automático e deixe-as secar por pelo menos uma hora antes de desidratar.

Para continuar a desidratação, transfira-os para 80% de etanol por um minuto. Continue desidratando as lâminas mergulhando-as em etanol a 95% e depois em 100%. Por fim, mergulhe e segure as lâminas em xileno por um minuto.

Monte imediatamente as corrediças com lamínulas usando vedação cyto Para concluir o procedimento. Imprima etiquetas que contenham as informações do caso, incluindo o número do órgão e do bloco, o tipo de mancha e a data. Coloque uma etiqueta em cada lâmina para digitalizar as lâminas de mancha.

Coloque-os em uma bandeja de scanner e siga os procedimentos padrão. Arquive as lâminas de mancha em temperatura ambiente e quaisquer lâminas não manchadas restantes a menos 20 graus Celsius para uso futuro. Por fim, organize as imagens coradas por doador e tipo de tecido visto.

Aqui está um exemplo de coloração de KI 67 mais insulina em níveis baixos e altos de ampliação. As imagens dos cortes pancreáticos corados são submetidas a um banco de dados de patologia on-line, criando um biobanco virtual. Usando esse banco de dados, os investigadores podem acessar rapidamente as informações necessárias para pesquisas e diabetes tipo um.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar e manchar lâminas de alta qualidade do pâncreas humano.