Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o "Safety Catch" Metodologia

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar um peptídeo BSP funcionalizado usando técnicas de fase sólida. Isso é conseguido carregando um aminoácido BIS protegido na resina de ácido hidroxietilbenzóico. Em seguida, os ciclos de acoplamento de proteção profunda são repetidos para anexar aminoácidos bis funcionalizados, um processo que alonga o peptídeo BIS e exibe a funcionalidade desejada.

Finalmente, o primeiro aminoácido bis é modificado com um aminoácido alfa para clivar o peptídeo BIS da resina pela formação de DI Keto pirazina. São obtidos resultados que mostram a síntese bem-sucedida de um peptídeo BSP funcionalizado em boa pureza bruta e rendimentos isolados consistentes de aproximadamente 10% com base na análise de espectrometria de massa por cromatografia líquida. As implicações desta técnica se estendem para a síntese paralela e de biblioteca de peptídeos bis porque os peptídeos BIS são montados em uma resina sólida, que é mais facilmente manipulada do que as reações em solução e os subprodutos são facilmente removidos por filtração.

A demonstração visual desse método é crítica, pois muitas das etapas são difíceis de aprender porque há muitos detalhes importantes necessários para garantir que todas as reações se aproximem da conclusão o mais próximo possível. Com a síntese em fase sólida, não há como purificar os intermediários. Portanto, para obter um produto final limpo, cada reação deve ser conduzida o mais longe possível.

Recomendamos a criação de uma lista de verificação de procedimentos experimentais para evitar confusão, pois as etapas são de natureza repetitiva. Este protocolo começa com o carregamento do primeiro peptídeo BSP, a proteção do primeiro peptídeo BSP e o capeamento simultâneo da resina. Para começar, carregue o primeiro peptídeo BSP pesando 114 miligramas de resina H-M-B-A-A em um recipiente de reação de oito mililitros e adicione uma barra de agitação magnética.

Tampe a parte superior do recipiente com o septo de borracha e purgue o tubo com Argonne por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução de aminoácido BIS ativada conforme descrito no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, transfira a solução para o vaso de reação via seringa e mexa sob Argonne durante a noite no dia seguinte, remova o septo e drene a mistura de reação.

Lave a resina adicionando aproximadamente dois mililitros de clorometano à resina. Mexa por 30 segundos a um minuto e escorra. Repita esse processo quatro vezes com DCM e, em seguida, lave a resina cinco vezes com dimetilformamida.

Para realizar a proteção profunda do primeiro aminoácido bis e o capeamento simultâneo da resina, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de brometo de hidrogênio a 33% em ácido acético e DCM ao recipiente de reação. Deixe mexer por 15 minutos após drenar e lavar a resina cinco vezes em DCM. Repita a sequência de proteção D mais uma vez.

Em seguida, lave a resina cinco vezes em DCM seguidas de cinco vezes em DMF, neutralize a resina lavando duas vezes com a solução de volume de 5% de D-I-P-E-A em DMF. Em seguida, lave cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF mais uma vez. Agora, o acoplamento do aminoácido bis funcionalizado protegido pode ser realizado.

Primeiro, reintroduza uma atmosfera inerte no vaso de reação contendo resina lavando três vezes com DCM anidro. Em seguida, anexe uma purga de septo e linha de argônio e lave o recipiente adicionando um a dois mililitros de DCM anidro e mexendo por 30 segundos. Em seguida, drene o recipiente até que o borbulhador de linha de argônio comece a subir.

Repita esse processo pelo menos mais uma vez. Em seguida, prepare uma solução de aminoácido bis funcionalizado em um tubo de ensaio seco sob a atmosfera de Argonne. Adicione 47 microlitros de DIC e mexa por 90 minutos.

Em seguida, adicione 35 microlitros de D-I-P-E-A em 666 microlitros e DMF hidratado à resina e mexa por mais cinco minutos. Transfira a solução de aminoácido BIS pré-ativada para o recipiente por meio de uma seringa e mexa durante a noite no dia seguinte. Escorra a mistura de reação e lave duas vezes com DCM anidro enquanto estiver sob argônio.

Uma etapa crítica neste procedimento são os acoplamentos de aminoácidos biz. Para garantir o fechamento do anel de di ceto piperazinas, empregamos tempos de reação mais longos com agentes ativadores adicionais. Para promover o fechamento da di ceto pirazina, adicione uma solução de HOAT e DIC e mexa sob argônio por uma hora.

Em seguida, remova o septo e drene a mistura de reação. Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. Esta seção cobre a proteção profunda do aminoácido BIS funcionalizado, a proteção profunda do F moc e a acilação do primeiro aminoácido BIS.

Para realizar a proteção profunda do aminoácido bis funcionalizado protegido, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de TFA e TIPS ao vaso de reação e mexa por uma hora após a drenagem, lave a resina com DCM por cerca de 30 segundos e depois escorra repita a lavagem DCM cinco vezes. Em seguida, repita toda a sequência de lavagem da resina de proteção profunda após a lavagem A-D-C-M-D-M-F. Neutralize a resina lavando duas vezes com uma solução de volume de 5% de D-I-P-E-A em DMF.

Em seguida, execute outra lavagem DCMDF. A partir daqui, o peptídeo BIS pode ser alongado com outros aminoácidos bis funcionalizados ou funcionalizado no ácido carboxílico nitrogênio principal ou ambos. Para proteger o grupo FM, adicione uma solução de dois mililitros de paridina a 20% em DMF e misture a reação por 20 minutos.

Escorra e lave a resina cinco vezes em DMF. Repita este processo mais uma vez após uma lavagem adicional da resina. Isole o primeiro aminoácido bis adicionando a solução de aminoácidos preparada ao recipiente de reação e agite por seis horas como etapa final.

Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. A parte final deste protocolo inclui a remoção do grupo de Bach do aminoácido ligado à resina e a clivagem da resina. Primeiro, adicione dois mililitros de uma solução T-F-A-D-C-M um-para-um ao recipiente de reação e mexa por 30 minutos.

Escorra e lave a resina cinco vezes em DCM. Em seguida, repita esse processo mais uma vez. Lave e drene a resina por 30 segundos, cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF.

Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de 10%D-I-P-E-A em DMF anidro e mexa por 24 a 48 horas. Por fim, recolher a mistura de reacção num balão de fundo redondo pré-pesado. Transfira 30 microlitros dessa solução para 450 microlitros de Tetra Hydro FU em um arquivo lc MS e envie-o para análise.

Lavar a resina com alíquotas suplementares de DMF e recolhê-la para o balão redondo de fundo. Os seguintes métodos podem ser usados para monitorar as transformações químicas da resina ao longo da síntese. Para detectar grupos hidroxila livres, execute o teste de vermelho de metila removendo primeiro aproximadamente um miligrama de resina seca por meio de pipeta descartável.

Enxágüe em um recipiente de reação de quatro mililitros. Adicione uma solução de vermelho de metila preparada conforme descrito no texto e mexa por cinco a 10 minutos. Drene e lave a resina cinco vezes com esferas de resina laranja ou vermelha DCM indicam a presença de grupos hidroxila livres.

Este teste pode ser usado para avaliar a carga das primeiras etapas de capeamento de aminoácidos e resinas. Para detectar meios secundários, execute o teste cloral transferindo aproximadamente um miligrama de resina seca para um pequeno frasco via pipeta descartável. Adicione três gotas de cloral 0,8 milimolar em solução de DMF e aldeído ácido a 2% em solução de DMF.

E vamos sentar em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Nesse caso, grânulos de resina azul ou roxo são uma indicação de que meios secundários livres estão presentes no composto ligado à resina. Para confirmar as eficiências de ativação, realize o teste de armadilha de ativação: o composto ativado durante a síntese pode ser avaliado transferindo de cinco a 10 microlitros da solução ativada para um frasco de espectrometria de massa por cromatografia líquida contendo 50 microlitros de olaína misturada à mão.

Por alguns segundos, a solução deve ficar amarela, depois diluir com 450 microlitros de tetra hidro urano e submeter à análise lc MS. O produto final e os intermediários ativados podem ser avaliados usando um sistema LCM S equipado com uma coluna de fase reversa C 18 e um sistema solvente de acetil nitrilo de água com 0,1% de ácido fórmico. Este traço L-C-M-S-U-V fornece um exemplo da boa pureza do produto bruto.

O pico principal no espectro encontrado em 21,3 minutos é encontrado para ter uma máscara consistente com a massa esperada do produto. Isso pode ser visualizado no espectro de massa do produto bruto, o pico revelando os principais picos correspondentes à massa, mais a massa do íon sódio, bem como a massa menos a massa do grupo protetor IV DDE. Aqui é mostrado o traço UV LCMS dos espectros purificados revelando um produto muito puro em 21,3 minutos e o espectro de massa confirmando a identidade deste pico de trier purificado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar técnicas de rosto sólido para sintetizar peptídeos bis funcionalizados após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo de peptídeos biz explorarem aplicações em interações proteína-proteína e catálise, uma vez dominado. Essa técnica pode levar à síntese de um trímero de peptídeo biz funcionalizado em quatro a cinco dias, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter as esferas imersas nas soluções de reação e lavagem Após este procedimento. Outros métodos, como síntese paralela ou de biblioteca, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como o efeito da estereoquímica ou funcionalidades alternativas na ligação às proteínas ou na atividade catalítica. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes orgânicos pode ser extremamente perigoso e precauções como o uso de equipamentos de segurança pessoal adequados e um exaustor devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.