Name: Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o Safety Catch Metodologia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprenda a síntese de bis-peptídeos funcionalizados em fase sólida usando resina HMBA e método de clivagem safety catch. Este protocolo demonstra acoplamentos cíclicos e análise por cromatografia líquida-espectrometria de massas.

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Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Zachary Z. Brown e Jennifer Alleva para o desenvolvimento inicial desta técnica em fase sólida e síntese FL Matthew Parker para discussões úteis. Este trabalho é suportado pela Agência de Redução de Defesa ameaça (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) eo Horst Witzel Award Fellowship suportado por Cephalon, Inc.

1. Instalação <ol><li> A reacção de configuração para a síntese em fase sólida é um polipropileno cartucho de filtro ou reactor de vidro que está ligado por meio da tubagem de polipropileno para um balão fechado filtragem sob vácuo, como mostrado na Figura 1. A reacção pode ser misturado por uma barra de agitação magnética ou fazendo borbulhar azoto através do reactor. </li><li> Um colector de gás ligado a um cilindro de árgon equipado com um tubo de secagem e borbulhador de óleo é também recomendado porque permite que o recipiente de reacção a ser contido sob uma atmosfera inerte e permite a remoção de reagentes a partir de recipientes selados. </li><li> Todas as operações são realizadas em um exaustor e equipamento de proteção individual (óculos de segurança, jaleco e luvas de borracha nitrílica) é necessária. </li></ol> 2. Primeiro a carregar Bis-Peptide Onto Resina <ol><li> Pesar 114 mg de HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g de carregamento, 100 mmol) em 8 mL vaso de reacção e adicionar uma barra de agitação magnética. Tapar o topo da thnavio e com um septo de borracha e de purga do tubo com árgon durante pelo menos 5 minutos. </li><li> Entretanto, a pesar 117,3 mg do composto 1 da Figura 3 (586,63 g / mol, 2eq) e 59,2 mg de 1 - (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) em um tubo de centrífuga de 15 mL descartável e dissolver em 2 mL de diclorometano anidro (DCM). Adicionar 24 ul de 1-metilimidazole (NMI, 80,81 mL / mol, 3eq) à solução e mistura até ficar completamente dissolvida. </li><li> Transferir a solução activado para o vaso de reacção através de uma seringa e deixa-se agitar sob árgon durante a noite (aprox. 10 horas). </li><li> Remover o septo e drenar-se a mistura de reacção. Lavar a resina com DCM (5x) e dimetilformamida (DMF) (5x). Realizar o &quot;teste vermelho de metila&quot;, descrito na seção 10.1 para avaliar o grau de carga de resina. Se a resina permanece vermelho durante o teste de vermelho de metilo, em seguida, os passos de 2,2 e 2,3 deve ser repetido. Uma cor amarela, indicativa de um negativo de teste vermelho de metilo, é preferido;no entanto, uma vez que quaisquer grupos hidroxilo remanescentes será tapado no próximo passo, um resultado ligeiramente positivo (cor de resina laranja claro) pode ser aceitável. </li></ol> 3. A desprotecção da resina Bis-péptido e simultânea Primeiro capping <ol><li> Adicionar 1 mL de DCM para o vaso de reacção, em seguida, adicionar 1 mL de brometo de hidrogénio 33% em ácido acético gota a gota durante 30 segundos (borbulhamento ocorre) e agita-se durante 15 minutos. Escorrer e lavar a resina com DCM (5x), em seguida, repetir processar mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). Neutralizar a resina por lavagem duas vezes com uma solução a 5% v / v de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) em DMF, em seguida, lava-se com DCM (5x) e DMF (5x) novamente. Realizar o &quot;teste de vermelho de metilo&quot; e &quot;teste cloranil&quot; discutido na seção 10.1 e 10.2. Os resultados devem ser negativa para o teste de vermelho de metilo e positiva para o teste de cloranil. </li></ol> 4. Acoplamento Boc / tBu-Protegido funcionalizada Bis-Aminenhum ácido <ol><li> Reintroduzir uma atmosfera inerte para a resina contendo vaso de reacção por lavagem três vezes com DCM anidro, em seguida, anexar um septo e uma linha de árgon. Limpar e lavar o vaso, adicionando mL 1-2 de DCM anidro e deixando agitar por 30 segundos, em seguida, a drenagem do reservatório até que o argônio linha borbulhador começa a subir. Faça isso pelo menos mais uma vez. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,15 M funcionalizado bis-amino ácido (3eq) e 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) em 2 mL de 2:1 DCM: DMF num ensaio à chama secas tubo sob atmosfera de árgon. Adicionar 47 ul de diisopropilcarbodiimida (DIC, 156,6 mL / mol, 3eq) e agita-se durante 90 minutos. </li><li> Adicionar 35 DIPEA uL (174,19 mL / mol, 2eq) em 666 uL de DMF anidro à resina e agita-se durante 5 minutos. </li><li> Transferir o pré-activada de solução de ácido bis-amino para o vaso de reacção através de uma seringa e deixa-se agitar durante a noite. </li><li> Drenar-se a mistura reaccional e lava-se duas vezes com DCM anidro enquanto sob<html> árgon. </li><li> Para promover o encerramento da dicetopiperazina, adicionar uma solução 0,25 M de HOAt (136,11 g / mol, 10eq) e DIC (156,6 mL / mol, 10eq) num 4 mL de 1:1 DCM: DMF e deixa-se agitar sob atmosfera de árgon durante 1 hora. </li><li> Remover o septo e drenar-se a mistura de reacção. Lavar a resina com DCM (5x) e DMF (5x). Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10.2. </li></ol> 5. A desprotecção do Boc / tBu-protegido Ácido Bis-Amino funcionalizado <ol><li> Adicionar 2 mL de uma solução de ácido trifluororacetic 95:5 (TFA): triisopropylsilane (TIPS) para o vaso de reacção e permitir que ele a agitar durante 1 hora. Escorra e lave a resina para cerca de 30 segundos com DCM (5x), em seguida, repita o processo mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). Neutralizar a resina por lavagem duas vezes com uma solução a 5% v / v de DIPEA em DMF, em seguida, lavar DCM (5x) e DMF (5x) novamente. Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10.2. </li></ol>le &quot;passos&gt; 6. Repita 4 e 5, como desejado para sintetizar alvo bis peptídeo. 7. Funcionalização do Fim Prolidine Bis-Peptide <ol><li> A extremidade prolidine do crescimento bis-péptido pode ser acilado independentemente ou em conjunto através de uma dicetopiperazina. Além disso, este fim pode ser deixado protegido, o qual será clivado último, obtendo-se o aminoácido livre. Se desejar, realizar o &quot;teste de cloranil&quot; discutido na seção 10,2 para avaliar a eficiência de acoplamento. </li></ol> 8. A desprotecção de Fmoc e acilação do Fim Quaternário do Bis-Peptide <ol><li> Uma solução de 2 ml de piperidina a 20% em DMF é adicionada ea reacção é misturada durante 20 minutos. Escorrer e lavar a resina com DMF (5x), em seguida, repita o processo mais uma vez. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li><li> Preparar uma solução de 0,15 M de aminoácido (3eq) em 2 mL de N-metilpirrolidona (NMP) com 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio hexafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) e 104,5 DIPEA uL (174,19 mL / mol, 6eq) e misturar bem. Adicionar à vaso de reacção e agita-se durante 6 horas. </li><li> Lavar a resina com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li></ol> 9. Remover o grupo Boc da resina de Ligação de aminoácidos e Cleave a partir de resina <ol><li> Adicionar 2 mL de uma TFA 1:1: solução DCM para o vaso de reacção e deixa-se agitar durante 30 minutos. Escorrer e lavar a resina com DCM (5x), em seguida, repetir processar mais uma vez. </li><li> Lavar e drenar a resina durante 30 segundos com DCM (5x), em seguida, DMF (5x). </li><li> Adicionar 2 mL de uma solução de DIPEA a 10% em DMF anidro e deixa-se agitar de 24-48 horas. </li><li> Colete mistura de reacção em pré-pesado balão de fundo redondo. Transferir 30 uL desta solução a 450 uL de THF em um frasco de LC-MS e submete para análise. Lava-se a resina com alíquotas adicionais de DMF e recolher para o balão de fundo redondo, em seguida, remover o solvente sob vácuo. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificação de Bis-Peptide <ol><li> Dissolver em bruto bis-péptido numa quantidade mínima de sulfóxido de dimetilo (100-250 uL) e transferência para HPLC de inserção do frasco. Inserto lugar em amostrador automático de HPLC semi-prepitive sistema (Hewlett Packard 1100 Série) equipado com um MS Prep XTerra C18 5 micrómetros coluna milímetros 7.8x150 e um circuito 100 de injecção uL. </li><li> Executar múltiplas injecções de 50 ul da amostra, utilizando um programa de gradiente de acetonitrilo 5-95% em água com 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos enquanto monitorando a 274 nm. Recolher o pico do produto num tubo de centrífuga de pré-pesado descartável e congelar seca utilizando um liofilizador. Devem ser tomadas precauções com a primeira execução como uma ligeira mudança no tempo de retenção do pico em comparação com LCMS analíticos é tipicamente observado. </li></ol> 11. Métodos de Avaliação <ol><li> METHYL TEST RED 7: Remover ~ 1 mg de resina seca através de uma pipeta descartável e enxaguar em 4 mL vaso de reacção. Adicionar uma solução de 20 mg de vermelho de metilo, 50 N ul, N&#39;-diisopropilcarbodiimida (DIC), e 5 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) em 500 uL DCM anidro e agita-se durante 5-10 min. Escorra e lave resina com DCM até que o filtrado se torne incolor. Indicação positiva é as pérolas de resina restantes laranja ou vermelha. </li><li> Cloranil ENSAIO 12: Transferência ~ 1 mg de resina seco para um pequeno frasco através de uma pipeta descartável. Adicionar 3 gotas de ambos cloranil mM um 0,8 em solução de DMF e acetaldeído 2% em solução de DMF e deixar repousar à temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Indicação positiva é a resina, transformando azul / roxa. </li><li> Teste de activação TRAP: compostos activado durante a síntese pode ser avaliada através da transferência de uma pequena quantidade (uL 5-10) da solução activada para uma espectrometria de massa de cromatografia-líquida (LC-MS) frasco contendo 50 uL de pirrolidina. Misture com a mão por alguns segundos (solutiem deve tornar-se amarela), em seguida, dilui-se com 450 ul de tetra-hidrofurano (THF) e submete para LC-MS análise. </li><li> ANÁLISE LC-MS: O produto final e intermediários activados podem ser avaliados através de uma série HP 1200 sistema LC-MS equipado com um Xterra Waters C18 MS 3,5 uM 4,6 mm x 150 mm coluna e um sistema de gradiente de acetonitrilo 5-95% em água com 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos. </li></ol> 12. Os resultados representativos Um exemplo de ambos em bruto (Figura 4) e purificado (Figura 5) vestígios LCMS são fornecidos. Rendimento purificadas de cerca de 10% são esperados utilizando os métodos descritos acima. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama do conjunto experimental para síntese em fase sólida. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclatura relevante de Bis-aminoácidos / Bis-peptídeos. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema de síntese geral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="A Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> A Figura 4a. HPLC de rastreamento do produto bruto em 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. MS Espectro de pico de produto bruto. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC Rastreamento de produto purificado em 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. Espectro de MS purificada Product Pico.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A abordagem sintética aqui apresentada fornece um método para a síntese de bis-funcionalizados péptidos a partir de bis-amino blocos de construção de ácido usando comuns em fase sólida técnicas de síntese de péptidos. A síntese destes monômero &quot;Pro4&quot; blocos de construção de trans-4-hidroxiprolina 3 é altamente escalável e foi concluída com êxito para o palco hidantoína em mmol 600 (234 g) escala (não publicado). Uma vez que os monómeros são dadas, a utilização de técnicas de fase sólida proporciona um método mais rápido de bis-péptido síntese do que a nossa metodologia solução de fase corrente 4, eliminando a necessidade de reacção de trabalho-ups e purificações intermédios. O desafio primário na síntese em fase sólida é diagnosticar o progresso sintético e resolução de problemas uma vez que não intermediários são isolados. Isto levou ao desenvolvimento de muitos testes colorimétricos incluindo aqueles para identificar se aminas livres (o teste de Kaiser 10) ou livre HydroxYLS (Metil Teste vermelho 7) estão expostos na resina. Infelizmente, o comumente usado teste de Kaiser 10 não é geralmente aplicável no nosso síntese em fase sólida, devido à utilização quase exclusiva de aminas secundárias ou aminas ligados a um carbono quaternário. Outras opções para avaliação de resina HMBA incluem clivagens teste usando um nucleófilo como hidrazina 11, clivagem Fmoc quantitativa monitorado por UV / Vis 1,11, e captura e análise de compostos de entrada ativados. Outra questão ignorado no síntese em fase sólida é a natureza repetitiva de passos sintéticos exigidas pelo operador. Com isto em mente, os autores recomendamos fortemente o uso de uma planilha ou lista de verificação quando efectuar qualquer manual de síntese de peptídeos em fase sólida. A dificuldade na utilização de bis-péptidos em fase sólida para a síntese em comparação com comuns α-aminoácidos inclui o potencial para acoplamentos mais difícil devido à Hin estéricoDrance, a necessidade de fechos em resina-dicetopiperazina, e deprotections simultâneas (Boc / tBu; Cbz / tBu). Outra dificuldade reside na obtenção de libertação quantitativo a partir da resina usando este &quot;fecho de segurança&quot; método quando comparado com meios mais convencionais. Com esses fatores em mente, é muito possível que uma maior otimização desse método pode ser alcançado e os esforços atuais estão em andamento em nosso grupo para melhorar o método aqui apresentado.

<table border="1"><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> NovaBiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> NovaBiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Carcinogênico </td></tr><tr><td> DCM anidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Carcinogênico </td></tr><tr><td> Brometo de hidrogénio 33% em ácido acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Tóxico, Corrosive, Fumes quando aberto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> DMF anidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DICAS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Inflamável, tóxico </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> NovaBiochem </td><td> 851055 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> Vermelho de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Inflamável, peróxido, Toxic Formando </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Inflamável, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo </td><td> Pescador </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> Vasos de reacção SPPS </td><td> Graça </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Série 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Série 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

síntese em fase sólida de um funcionalizada bis peptide-usando o &quot;safety catch&quot; metodologia

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

Em 1962, RB Merrifield publicado o primeiro procedimento em fase sólida utilizando síntese de péptidos como uma nova via para sintetizar eficientemente péptidos. Esta técnica rapidamente mostrou-se vantajoso em relação ao antecessor fase de solução em termos de tempo e trabalho. Melhorias relativamente à natureza do suporte sólido, os grupos protectores utilizados e os métodos de acoplamento utilizados nos últimos cinco décadas têm só aumentou a utilidade do sistema original Merrifield. Hoje em dia, a utilização de uma protecção Boc-base e base / estratégia resina nucleófilo clivável ou Fmoc de protecção de base e da estratégia resina acídica clivável, iniciada por RC Sheppard, são mais comumente utilizado para a síntese de péptidos 1. Inspirado por estratégia sólida de Merrifield suportado, nós desenvolvemos uma Boc / terc-butil estratégia de síntese de fase sólida para a montagem de funcionalizados bis-péptidos 2, que é aqui descritos. A utilização de síntese em fase sólida em comparação tO metodologia de solução de fase não é apenas vantajoso em termos de tempo e de trabalho, tal como descrito por Merrifield 1, mas também permite que uma maior facilidade na síntese de bis-peptídicos bibliotecas. A síntese que demonstram aqui incorpora uma fase de clivagem final que utiliza um de dois passos &quot;fecho de segurança&quot; mecanismo para libertar o funcionalizado bis-péptido a partir da resina por formação de dicetopiperazina. Bis-péptidos são rígidas, espiro-escada com oligómeros de bis-aminoácidos que são capazes de posicionar a funcionalidade de uma forma previsível e projetáveis, controlada pelo tipo e estereoquímica das unidades monoméricas e da conectividade entre cada monómero. Cada ácido bis-amino é um estereoquimicamente puro, andaime cíclico que contém dois aminoácidos (um ácido carboxílico com um α-amina) 3,4. Nosso laboratório está atualmente investigando o potencial de funcionais bis-peptídeos em uma ampla variedade de áreas, incluindo catálise, interações proteína-proteína e nanomaterials.

A síntese de péptidos em fase sólida eficiente de um trímero bis péptido-funcionalizado utilizando um &quot;fecho de segurança&quot; procedimento de clivagem a partir de resina de HMBA é descrito.

Síntese em Fase Sólida de um funcionalizada Bis Peptide-Usando o &quot;Safety Catch&quot; Metodologia

Em 1962, R.B. Merrifield publicou o primeiro procedimento utilizando a síntese de peptídeos em fase sólida como uma nova via para sintetizar peptídeos de forma eficiente. Isso ...

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar um peptídeo BSP funcionalizado utilizando técnicas de fase sólida. Isso é alcançado carregando um aminoácido BIS protegido em resina de ácido hidroxietilbenzoico. Em seguida, ciclos de acoplamento com proteção profunda são repetidos para ligar aminoácidos bis funcionalizados, um processo que alonga o peptídeo BIS e exibe a funcionalidade desejada.Por fim, o primeiro aminoácido bis é modificado com um aminoácido alfa a fim de clivar o peptídeo BIS da resina por meio da formação de pirazina DI-cetônica. Os resultados obtidos demonstram a síntese bem-sucedida de um peptídeo BSP funcionalizado com boa pureza bruta e rendimentos isolados consistentes de aproximadamente 10%, com base na análise por espectrometria de massas com cromatografia líquida. As implicações dessa técnica estendem-se à síntese paralela e em bibliotecas de peptídeos bis, pois os peptídeos BIS são montados em uma resina sólida, que é mais facilmente manipulada do que reações em solução, e os subprodutos são removidos com facilidade por filtração.A demonstração visual deste método é essencial, pois muitas das etapas são difíceis de aprender, já que existem muitos detalhes importantes necessários para garantir que todas as reações alcancem a conclusão o mais próximo possível. Na síntese em fase sólida, não há como purificar os intermediários. Portanto, para obter um produto final puro, cada reação deve ser conduzida ao máximo possível.Recomenda-se criar uma lista de verificação dos procedimentos experimentais para evitar confusão, já que as etapas são repetitivas por natureza. Este protocolo inicia-se com a carga do primeiro peptídeo BSP, a proteção do primeiro peptídeo BSP e o capeamento simultâneo da resina. Para iniciar, carregue o primeiro peptídeo BSP pesando 114 miligramas da resina H-M-B-A-A em um vaso de reação de oito mililitros e adicione uma barra de agitação magnética.Tampe a parte superior do recipiente com a rolha de borracha e purgue o tubo com argônio por pelo menos cinco minutos. Enquanto isso, prepare a solução ativada de aminoácido BIS conforme descrito no protocolo escrito. Acompanhando este vídeo, transfira a solução para o vaso de reação por meio de uma seringa e agite sob argônio durante a noite. No dia seguinte, remova a rolha e drene a mistura de reação.Lave a resina adicionando aproximadamente dois mililitros de clorometano à resina. Agite por 30 segundos a um minuto e, em seguida, drene. Repita este processo quatro vezes com DCM e, depois, lave a resina cinco vezes com dimetilformamida.Para realizar a desproteção profunda do primeiro bisaminoácido e o bloqueio simultâneo da resina, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de 33% de brometo de hidrogênio em ácido acético e DCM ao vaso de reação. Deixe sob agitação por 15 minutos após drenar e lavar a resina cinco vezes com DCM. Repita a sequência de desproteção D mais uma vez.Em seguida, lave a resina cinco vezes com DCM seguido por cinco vezes com DMF, neutralize a resina lavando duas vezes com a solução de D-I-P-E-A em DMF a 5% volume por volume. Em seguida, lave cinco vezes com DCM e mais cinco vezes com DMF novamente. Agora pode-se realizar o acoplamento do bis aminoácido funcionalizado protegido.Primeiro, reintroduza uma atmosfera inerte ao vaso de reação contendo a resina lavando-o três vezes com DCM anidro. Em seguida, fixe uma séptula e purgue e lave o vaso com linha de argônio adicionando um a dois mililitros de DCM anidro e agitando por 30 segundos. Depois, drene o vaso até que o borbulhador da linha de argônio comece a subir.Repita este processo pelo menos mais uma vez. Em seguida, prepare uma solução de bis aminoácido funcionalizado em um tubo de ensaio seco à chama sob atmosfera de argônio. Adicione 47 microlitros de DIC e agite por 90 minutos.Em seguida, adicione 35 microlitros de D-I-P-E-A em 666 microlitros e DMF Hydrus à resina e agite por mais cinco minutos. Transfira a solução pré-ativada do aminoácido BIS para o recipiente por meio de seringa e agite durante a noite no dia seguinte. Drene a mistura de reação e lave duas vezes com DCM anidro sob argônio.Uma etapa crítica deste procedimento são as acoplamentos de aminoácidos biz. Para garantir o fechamento dos anéis de di-ceto piperazinas, empregamos tempos de reação mais longos com agentes ativadores adicionais. Para promover o fechamento da di-ceto pirazina, adicione uma solução de HOAT e DIC e agite sob argônio por uma hora.Em seguida, remova o septo e drene a mistura de reação. Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. Esta seção aborda a proteção profunda do aminoácido BIS funcionalizado, a proteção profunda do F moc e a acilação do primeiro aminoácido BIS.Para realizar a desproteção profunda do bisaminoácido funcionalizado protegido, adicione lentamente dois mililitros de uma solução de TFA e TIPS ao vaso de reação e agite por uma hora após o escoamento; lave a resina com DCM por cerca de 30 segundos e, em seguida, escoe, repetindo a lavagem com DCM cinco vezes. Em seguida, repita toda a sequência de lavagem de desproteção profunda da resina seguindo a lavagem A-D-C-M-D-M-F. Neutralize a resina lavando-a duas vezes com uma solução 5% volume/volume de D-I-P-E-A em DMF.Em seguida, realize uma nova lavagem D-C-M-D-M-F. A partir daqui, o peptídeo BIS pode ser alongado com outros bis aminoácidos funcionalizados ou funcionalizado no ácido carboxílico do nitrogênio terminal, ou ambos. Para desproteger o grupo FM, adicione uma solução de dois mililitros de 20% de piperidina em DMF e misture a reação por 20 minutos.Drene e lave a resina cinco vezes com DMF. Repita este processo mais uma vez após uma lavagem adicional da resina. A isole o primeiro bisaminoácido adicionando a solução de aminoácido preparada ao vaso de reação e agite por seis horas como etapa final.Lave a resina cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF. A etapa final deste protocolo inclui a remoção do grupo Bach do aminoácido ligado à resina e a clivagem da resina. Primeiro, adicione dois mililitros de uma solução de T-F-A-D-C-M na proporção um para um ao vaso de reação e agite por 30 minutos.Escoe e lave a resina cinco vezes com DCM. Em seguida, repita este processo mais uma vez. Lave e escoe a resina por 30 segundos, cinco vezes com DCM e cinco vezes com DMF.Em seguida, adicione dois mililitros de uma solução de 10% de D-I-P-E-A em DMF anidro e agite por 24 a 48 horas. Por fim, colete a mistura reacional em um balão de fundo redondo previamente pesado. Transfira 30 microlitros desta solução para 450 microlitros de Tetra Hidro FU em um frasco de LC-MS e envie para análise.Lave a resina com alíquotas adicionais de DMF e colete no frasco de fundo redondo. Os seguintes métodos podem ser utilizados para monitorar transformações químicas na resina durante a síntese. Para detectar grupos hidroxila livres, realize o teste com vermelho de metila removendo primeiro cerca de um miligrama de resina seca por meio de pipeta descartável.Lave em um vaso de reação de quatro mililitros. Adicione uma solução de vermelho de metila preparada conforme descrito no texto e agite por cinco a 10 minutos. Drene e lave a resina cinco vezes com DCM; bolinhas de resina laranja ou vermelhas indicam a presença de grupos hidroxila livres.Este teste pode ser utilizado para avaliar a etapa de carregamento do primeiro aminoácido bis e as etapas de tamponamento da resina. Para detectar aminas secundárias, realize o teste do cloral transferindo aproximadamente um miligrama de resina seca para um pequeno frasco via pipeta descartável. Adicione três gotas da solução de cloral 0,8 milimolar em DMF e três gotas da solução de aldeído ácido 2% em DMF.E vamos deixar em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Neste caso, as esferas de resina azuis ou roxas indicam que aminas secundárias livres estão presentes no composto ligado à resina. Para confirmar as eficiências de ativação, realize o teste de aprisionamento de ativação: o composto ativado durante a síntese pode ser avaliado transferindo-se cinco a 10 microlitros da solução ativada para um frasco de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas contendo 50 microlitros de olaina, misturado manualmente.Por alguns segundos, a solução deve ficar amarela, depois dilua com 450 microlitros de tetra-hidrofuran e submeta à análise por LC-MS. O produto final e os intermediários ativados podem ser avaliados usando um sistema LCM-S equipado com uma coluna C18 de fase reversa e um sistema de solventes de água e acetonitrila com 0,1% de ácido fórmico. Este traçado L-C-M-S-U-V fornece um exemplo da boa pureza do produto bruto.O pico principal no espectro encontrado aos 21,3 minutos apresenta uma máscara compatível com a massa do produto esperado. Isso pode ser visualizado no espectro de massas do produto bruto, cujo pico revela picos principais correspondentes à massa, mais a massa do íon sódio, bem como à massa menos a massa do grupo protetor IV DDE. É mostrado aqui o traçado UV de LCMS dos espectros purificados, revelando um produto muito puro aos 21,3 minutos, e o espectro de massas confirmando a identidade desse pico trier purificado.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar técnicas de síntese em fase sólida para produzir bis peptídeos funcionalizados após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para que pesquisadores na área de bis peptídeos explorassem aplicações em interações proteína-proteína e catálise, uma vez dominada. Quando realizada corretamente, esta técnica pode levar à síntese de um trímero de bis peptídeo funcionalizado em quatro a cinco dias.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de manter as esferas imersas nas soluções de reação e de lavagem seguindo este procedimento. Outros métodos, como síntese paralela ou em biblioteca, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como o efeito da estereoquímica ou de funcionalidades alternativas na ligação proteica ou na atividade catalítica. Não se esqueça de que trabalhar com reagentes orgânicos pode ser extremamente perigoso e precauções, como o uso de equipamento adequado de segurança pessoal e capela de exaustão, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

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