Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma biblioteca focada de peptidomiméticos cíclicos com diversidade conformacional utilizando irradiação por micro-ondas para o desenvolvimento de novos terapêuticos anti-parasitários. Este método pode auxiliar no desenvolvimento de novas ferramentas para direcionar especificamente interações proteína-proteína. Para iniciar este procedimento, adicione 2,5 mililitros do aminoácido desejado, um mililitro do ativador e 0,5 mililitros da base do ativador a um cartucho de polipropileno.

Coloque o cartucho em um sintetizador por micro-ondas automatizado e deixe a reação de acoplamento prosseguir por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius. Após a conclusão da reação, lave a resina com sete mililitros de N,N-dimetilformamida, ou DMF, por 120 segundos à temperatura ambiente. Após repetir o passo anterior cinco vezes, adicione sete mililitros de piperidina 20% em DMF com 1-hidroxibenzotriazol, ou HOBt, 0,1 molar ao cartucho de polipropileno e incube por 30 segundos a 45 watts e 75 graus Celsius.

Quando terminado, drene a mistura de reação. Em seguida, adicione sete mililitros de piperidina 20% em DMF com HOBt 0,1 molar ao cartucho de polipropileno e incube por 180 segundos a 45 watts e 75 graus Celsius. Após drenar a mistura de reação, lave a resina com sete mililitros de DMF por 120 segundos à temperatura ambiente.

Em seguida, lave a resina com sete mililitros de diclorometano, ou DCM, durante 120 segundos à temperatura ambiente. Para acoplamento com anidrido, lave a resina com sete mililitros de 1-metil-2-pirrolidinona, ou NMP, durante 120 segundos à temperatura ambiente. Após a conclusão, drene a mistura reacional.

Após repetir o passo anterior três vezes, dissolva 10 equivalentes do anidrido correspondente em cinco mililitros de NMP em um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Em seguida, adicione um equivalente de 4-dimetilaminopiridina, ou DMAP, e 10 equivalentes de N,N-diisopropiletilamina, ou DIEA, à solução. Adicione esta mistura à resina e incube por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius.

Após lavar a resina com NMP, lave-a com sete mililitros de DMF por 120 segundos à temperatura ambiente. Neste ponto, transfira a resina para uma cartucho de polipropileno equipado com tampão e torneira. Uma vez que a resina tenha sido lavada com DCM, adicione de 15 a 25 mililitros de uma mistura contendo 1% de ácido trifluoroacético, 5% de triisopropilsilano e 94% de DCM ao cartucho de polipropileno por cada 1 grama de resina.

Coloque o cartucho de polipropileno em um agitador e agite por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução do cartucho de polipropileno aplicando vácuo. Após repetir os passos anteriores três vezes, lave a resina com sete mililitros de DCM durante 120 segundos à temperatura ambiente.

Esses passos são extremamente importantes, pois observou-se que os grupos protetores tritila em várias resinas foram parcialmente clivados em soluções de ácido trifluoroacético em diclorometano. A remoção dos grupos metiltritila é um processo lento que exige várias lavagens. Em um tubo de polipropileno de 50 mililitros, dissolva cinco equivalentes de hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-trispirrolidinofosfônio em cinco mililitros de dibromometano.

Em seguida, adicione 10 equivalentes de DIEA à solução. Adicione a mistura à resina lavada com DCM e incube por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius. Após isso, lave a resina com sete mililitros de DCM por 120 segundos à temperatura ambiente.

Após duas lavagens com DCM, transfira a resina para uma cartela de polipropileno e lave duas vezes com éter dietílico. Seque a resina em um dessecador a vácuo à temperatura ambiente por pelo menos três horas sobre hidróxido de potássio. Em seguida, adicione 10 mililitros de uma mistura de ácido trifluoroacético previamente resfriada a cada um grama de resina.

Coloque o cartucho de polipropileno em um agitador e agite por 3 horas à temperatura ambiente. Em seguida, colete a solução de clivagem filtrando a resina para um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione 35 mililitros de éter dietílico frio ao tubo.

Centrifugue por cinco minutos a 1.207 × g a quatro graus Celsius. Em seguida, decante a camada de éter. Para o teste de Kaiser, prepare a Solução A dissolvendo 16,5 miligramas de cianeto de potássio em 25 mililitros de água destilada.

Dilua um mililitro da solução com 49 mililitros de peridina. Em seguida, prepare a Solução B dissolvendo um grama de ninidrina em 20 mililitros de etanol. Prepare a Solução C dissolvendo 40 gramas de fenol em 20 mililitros de etanol.

Após o preparo das soluções, transfira algumas perlas da resina para um tubo de ensaio. Adicione três gotas de cada solução ao tubo e misture. Por fim, aqueça o tubo de ensaio em um bloco de aquecimento a 110 graus Celsius por cinco minutos.

A síntese dos peptídeos cíclicos com esqueleto principal foi realizada utilizando um sintetizador por micro-ondas automatizado em suporte sólido, seguindo o protocolo FMOC, t-butila. O produto foi analisado por espectrometria de massas, e seu grau de pureza foi determinado por CLAE. A triagem biológica mostrou que o peptídeo pL1 apresentou atividade contra Leishmania donovani, um parasita causador da leishmaniose visceral, a forma mais grave de leishmaniose em humanos.

O peptídeo pL1 reduziu a viabilidade do parasita em 75% em comparação com o tratamento controle. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em três a cinco dias, se for executada corretamente. Após o seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores de diversas áreas explorarem peptídeos como reguladores farmacológicos em pesquisas básicas e terapêuticas.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver uma biblioteca direcionada de peptidomiméticos com diversidade conformacional para especificamente alvejar interações proteína-proteína. Não se esqueça de que trabalhar com ácido trifluoroacético pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de proteção ocular, jaleco laboratorial e luvas enquanto se trabalha em uma capela bem ventilada, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.