Desenvolvimento de um Backbone cíclica Biblioteca de Peptídeos como potencial antiparasitário Therapeutics Usando Microondas Irradiação

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver uma biblioteca peptidomimética cíclica de backbone focada com diversidade conformacional usando irradiação de micro-ondas para novas terapêuticas antiparasitárias. Este método pode ajudar a desenvolver novas ferramentas para direcionar especificamente as interações proteína-proteína. Para iniciar este procedimento, adicione 2,5 mililitros do aminoácido desejado, um mililitro de ativador e 0,5 mililitros de base ativador a um cartucho de polipropileno.

Coloque o cartucho em um sintetizador de micro-ondas automatizado e deixe a reação de acoplamento prosseguir por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius. Quando a reação estiver completa, lave a resina com sete mililitros de N, N-dimetilformamida ou DMF, por 120 segundos em temperatura ambiente. Depois de repetir o passo anterior cinco vezes, adicione sete mililitros de piperidina a 20% em DMF com 1-hidroxibenzotriazol 0,1 molar, ou HOBt, ao cartucho de polipropileno e incube por 30 segundos a 45 watts e 75 graus Celsius.

Quando terminar, escorra a mistura de reação. Em seguida, adicione sete mililitros de piperidina a 20% em DMF com 0,1 molar HOBt ao cartucho de polipropileno e incube por 180 segundos a 45 watts e 75 graus Celsius. Depois de drenar a mistura de reação, lave a resina com sete mililitros de DMF por 120 segundos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave a resina com sete mililitros de diclorometano, ou DCM, por 120 segundos em temperatura ambiente. Para acoplamento de anidrido, lave a resina com sete mililitros de 1-metil-2-pirrolidinona, ou NMP, por 120 segundos em temperatura ambiente. Quando terminar, escorra a mistura de reação.

Depois de repetir a etapa anterior três vezes, dissolva 10 equivalentes do anidrido correspondente em cinco mililitros de NMP em um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Em seguida, adicione um equivalente de 4-Dimetilaminopiridina, ou DMAP, e 10 equivalentes de N, N-diisopropiletilamina, ou DIEA, à solução. Adicione esta mistura à resina e incube por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius.

Após lavar a resina com NMP, lave-a com sete mililitros de DMF por 120 segundos em temperatura ambiente. Neste ponto, transfira a resina para um cartucho de polipropileno equipado com um tampão e torneira. Uma vez que a resina tenha sido lavada com DCM, adicione 15 a 25 mililitros de uma mistura de ácido trifluoroacético a 1%, 5% de triisopropilsilano e 94% DCM ao cartucho de polipropileno por 1 grama de resina.

Coloque o cartucho de polipropileno em um shaker e agite por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, drene a solução do cartucho de polipropileno aplicando um vácuo. Depois de repetir os passos anteriores três vezes, lave a resina com sete mililitros de DCM por 120 segundos em temperatura ambiente.

Essas etapas são muito importantes, pois os grupos protetores de tritila em várias resinas foram parcialmente clivados nas soluções de ácido DCM-trifluoroacético. A remoção de grupos metiltritil é um processo lento que requer várias lavagens. Em um tubo de polipropileno de 50 mililitros, dissolva cinco equivalentes de hexafluorfosfato de benzotriazol-1-ly-oxi-tris-pirrolidinofosfônio em cinco mililitros de dibromometano.

Em seguida, adicione 10 equivalentes de DIEA à solução. Adicione a mistura à resina enxaguada com DCM e incube por 300 segundos a 25 watts e 75 graus Celsius. Em seguida, lave a resina com sete mililitros de DCM por 120 segundos em temperatura ambiente.

Após duas lavagens com DCM, transferir a resina para um cartucho de polipropileno e lavar duas vezes com éter dietílico. Seque a resina em um dessecador a vácuo em temperatura ambiente por pelo menos três horas sobre hidróxido de potássio. Em seguida, adicione 10 mililitros de um coquetel de clivagem de ácido trifluoroacético pré-resfriado a cada grama de resina.

Coloque o cartucho de polipropileno em uma coqueteleira e agite por 3 horas em temperatura ambiente. Em seguida, colete a solução de clivagem filtrando a resina em um tubo de polipropileno de 50 mililitros. Adicione 35 mililitros de éter dietílico frio ao tubo.

Centrifugue por cinco minutos a 1.207 vezes g a quatro graus Celsius. Em seguida, decantar a camada de éter. Para o teste de Kaiser, prepare a Solução A dissolvendo 16,5 miligramas de cianeto de potássio em 25 mililitros de água destilada.

Diluir um mililitro da solução com 49 mililitros de peridina. Em seguida, prepare a Solução B dissolvendo um grama de ninidrina em 20 mililitros de etanol. Prepare a Solução C dissolvendo 40 gramas de fenol em 20 mililitros de etanol.

Depois que as soluções forem preparadas, transfira alguns grânulos da resina para um tubo de ensaio. Adicione três gotas de cada solução ao tubo e misture. Finalmente, aqueça o tubo de ensaio em um bloco de aquecimento a 110 graus Celsius por cinco minutos.

A síntese dos peptídeos cíclicos da espinha dorsal foi realizada usando um sintetizador de micro-ondas automatizado em suporte sólido seguindo o protocolo FMOC, t-butyl. O produto foi analisado por espectrometria de massas, e seu grau de pureza foi determinado por HPLC. A triagem biológica mostrou que o peptídeo pL1 foi ativo contra Leishmania donovani, um parasita causador da leishmaniose visceral, a leishmaniose mais grave em humanos.

O peptídeo pL1 reduziu a viabilidade do parasita em 75% em comparação com o tratamento controle. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três a cinco dias se for executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em uma ampla gama de campos explorarem peptídeos como reguladores farmacológicos em pesquisa básica e terapêutica.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver uma biblioteca focada de peptidomiméticos com diversidade conformacional para direcionar especificamente as interações proteína-proteína. Não se esqueça de que trabalhar com ácido trifluoroacético pode ser extremamente perigoso, e precauções, como usar proteção para os olhos, jaleco e luvas ao trabalhar com um capuz bem ventilado, devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.