Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

As quebras de fita dupla de DNA induzidas por radiação, ou DSBs, iniciam o recrutamento de proteínas de reparo de DNA no local danificado - ativando o reparo de DNA.

Para detectar as proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 em locais DSB usando imunofluorescência indireta, pegue lamínulas contendo células epiteliais. Irradie um subconjunto das células. Incubar, permitindo que as células de controle não irradiadas e irradiadas cresçam por tempos específicos.

Trate com um tampão para extrair os núcleos celulares. Fixe os núcleos celulares para preservar sua morfologia. Trate com uma solução de bloqueio para minimizar a ligação de anticorpos primários não específicos.

Adicione anticorpos primários direcionados às duas proteínas de reparo de DNA. Os anticorpos se ligam às respectivas proteínas.

Incubar com anticorpos secundários marcados com fluoróforos vermelhos e verdes, respectivamente. Os anticorpos secundários - específicos para cada anticorpo primário - ligam-se aos seus alvos. Adicione um meio de montagem contendo DAPI em uma lâmina de vidro. Monte as lamínulas nele para obter imagens.

DAPI - um corante de ligação ao DNA - liga-se aos sulcos menores ricos em AT do DNA de fita dupla, contracolorindo os núcleos. Visualize os núcleos das células usando um microscópio de fluorescência.

Em comparação com os núcleos celulares não irradiados, os núcleos irradiados exibem múltiplos focos de γH2AX que diminuem com o tempo, indicando reparo progressivo do DNA em células cultivadas por períodos mais longos.

Os sinais de fluorescência vermelhos e verdes sobrepostos aparecem em amarelo, indicando a co-localização de γH2AX e 53BP1 no local do DSB após a irradiação.

Comece cultivando 40.000 células HeLa em cada poço de uma placa de 12 poços com uma lamínula de vidro redonda de 18 milímetros para 80% de confluência. Depois de expor as células à irradiação gama 4 Gray, lave-as duas vezes com 1 mililitro de PBS. Em seguida, remova o PBS completamente e adicione 200 microlitros de NEB a cada poço. Incube as células por 2 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, remova o NEB.

Lembre-se de que o tempo de incubação pode variar dependendo da linhagem celular, mas geralmente não deve exceder dois minutos. Lave as células com 1 mililitro de PBS. Em seguida, remova o PBS completamente e adicione 200 microlitros de PFA a 4% em cada poço para fixação celular.

Incube as células por 10 minutos a 4 graus Celsius, em seguida, remova o PFA e adicione 1 mililitro de PBS a cada poço. Remova o PBS completamente e, em seguida, adicione 200 microlitros de solução de bloqueio a cada poço e incube as células por 2 horas em temperatura ambiente, ou 16 a 18 horas a 4 graus Celsius.

Diluir o anticorpo primário em tampão de diluição e vortexá-lo até ficar bem misturado. Em uma caixa de umidade, cole um pedaço de parafilme e adicione 10 microlitros de anticorpo primário em uma única gota. Alinhe uma borda da lamínula do poço com a gota e abaixe-a lentamente sobre o parafilme, espalhando o líquido. Incube a lamínula por 2 horas em temperatura ambiente.

Após a incubação, lave as lamínulas três vezes em PBS por 1 minuto por lavagem. Diluir o anticorpo secundário em tampão de diluição e vórtice até ficar bem misturado. Aplique 10 microlitros de anticorpo secundário em cada lamínula conforme descrito anteriormente e incube por 2 horas em temperatura ambiente, protegido da luz.

Lave as lamínulas três vezes com PBS - e uma vez com água - por 1 minuto por lavagem. Em seguida, monte-os em lâminas de vidro com uma mídia de montagem à base de glicerol contendo DAPI. Sele as lamínulas com esmalte transparente e deixe secar por 20 minutos. Coloque uma gota de óleo de imersão na lente objetiva 60X e use DAPI para localizar os núcleos através da ocular.

Para aquisição de imagem XYZ, abra o software de aquisição e defina o "Tipo de scanner" como "Galvano", o "Modo de scanner" como "Ida e volta" e o tamanho de imagem "512 por 512". No painel PMT, defina o modo como VBM, a média como Quadro e a varredura sequencial como Linha. Em seguida, defina os detectores de corante e calor. Defina o canal 1 para DAPI e SD1, o canal dois para Alexa Fluor 488 e HSD3 e o canal 3 para Alexa Fluor 647 e HSD4. Selecione "ON" em "Z".

Para ajustar a imagem ao vivo, pressione o botão Live na Live Window e ajuste o foco. Em seguida, use a janela "Ferramenta PMT" para definir a intensidade, sensibilidade, ganho e deslocamento do laser. Para pilhas Z, selecione Início a Fim e 15 Fatias. Selecione a pasta para salvar as imagens e pressione o botão Iniciar do LSM para iniciar a aquisição. Quando terminar, pressione o botão Série concluída para concluir a aquisição da imagem.