Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Técnicas Biológicas
0 visualizações • 5:42 min. • July 8th, 2025
As quebras de fita dupla de DNA induzidas por radiação, ou DSBs, iniciam o recrutamento de proteínas de reparo de DNA no local danificado - ativando o reparo de DNA.
Para detectar as proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 em locais DSB usando imunofluorescência indireta, pegue lamínulas contendo células epiteliais. Irradie um subconjunto das células. Incubar, permitindo que as células de controle não irradiadas e irradiadas cresçam por tempos específicos.
Trate com um tampão para extrair os núcleos celulares. Fixe os núcleos celulares para preservar sua morfologia. Trate com uma solução de bloqueio para minimizar a ligação de anticorpos primários não específicos.
Adicione anticorpos primários direcionados às duas proteínas de reparo de DNA. Os anticorpos se ligam às respectivas proteínas.
Incubar com anticorpos secundários marcados com fluoróforos vermelhos e verdes, respectivamente. Os anticorpos secundários - específicos para cada anticorpo primário - ligam-se aos seus alvos. Adicione um meio de montagem contendo DAPI em uma lâmina de vidro. Monte as lamínulas nele para obter imagens.
DAPI - um corante de ligação ao DNA - liga-se aos sulcos menores ricos em AT do DNA de fita du
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