Rastreamento de celular utilizando proteínas Photoconvertible Durante o Desenvolvimento Zebrafish

O objetivo geral deste procedimento é rastrear células fototrocadas em um embrião vivo de peixe-zebra. Isso é feito primeiro incorporando um embrião, expressando uma foto específica do tecido, proteína fluorescente conversível em baixa temperatura de fusão. Em seguida, a proteína dentro da região de interesse é completamente convertida em fotos.

Em seguida, o embrião é cuidadosamente removido de aros e mantido em água com ovo a 28,5 graus Celsius até estágios posteriores. Finalmente, o embrião fotoconvertido é novamente incorporado em aros de baixa temperatura de fusão. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram que as células fotoconvertidas podem ser detectadas com precisão em estágios posteriores devido à presença estável da proteína fotoconvertida por meio de microscopia confocal.

Portanto, achamos que o método que apresentaremos hoje será bastante útil no contexto da biologia celular e do desenvolvimento. Portanto, achamos que usar essa metodologia no contexto da migração celular, dinâmica dos tecidos e outros comportamentos celulares será bastante útil. Demonstrando o procedimento estará Veronica Lombardo, uma pós-doutoranda do meu laboratório Depois de cruzar o peixe-zebra transgênico, expressando uma proteína fluorescente fotoconversível.

Escolha os embriões mais brilhantes que são homozigotos e cultive-os a 28,5 graus Celsius quando atingirem o estágio desejado. Use uma pinça para revesti-los em um recipiente de vidro com água de ovo para anestesiar os embriões. Use uma pipeta de vidro ou uma ponta de pipeta cortada para transferi-los um de cada vez para o trica.

Transfira um embrião anestesiado para a tampa de uma placa de cultura e mantenha o embrião dentro do menor volume possível de meio. Transfira o embrião para aros pipetando-o com 1% de agros de baixa temperatura de fusão com trica a 30 graus Celsius e coloque-o em uma placa de cultura com fundo de vidro de cobertura. Use uma ponta de plástico lisa para orientar o embrião quando o agros estiver polimerizado.

Cubra-o com solução Trica em um microscópio confocal invertido equipado com fontes de laser de 405, 488 e 561 nanômetros e uma objetiva de 20 x. Use os lasers de 488 e 561 nanômetros para gerar uma pilha Z de toda a estrutura da amostra, que inclui a região de interesse. Selecione a ferramenta de série temporal e defina para dois ciclos sem intervalo, um para pré e outro para pós-conversão de foto.

Selecione a ferramenta da região e defina uma ou mais regiões de interesse para conversão de fotos. Em seguida, selecione a ferramenta de branqueamento e defina para iniciar o branqueamento após a digitalização. Um dos dois usados aqui é um laser de diodo de 30 miliwatts e 405 nanômetros.

Cuidadosamente otimizado para a quantidade mínima de luz laser necessária para a conversão completa da foto, que é obtida variando a intensidade da luz laser, as iterações de varredura da região de interesse e a velocidade de varredura. Escaneie a amostra com os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros para visualizar qualquer fluorescência verde restante e a fluorescência vermelha convertida na foto da proteína fluorescente conversível. Após a fotoconversão, descarte a solução e, usando uma agulha ou ponta de plástico lisa, remova cuidadosamente o embrião do agros.

Mantenha o embrião em água com ovo no escuro a 28,5 graus Celsius até o estágio de desenvolvimento desejado. Incorpore o embrião uma segunda vez e, em seguida, gere um Zack da amostra, incluindo a região de interesse, novamente usando os lasers de 488 e 561 nanômetros. Como esse protocolo não afeta o desenvolvimento normal, é possível observar o embrião fotoconvertido em estágios posteriores.

Aqui está um exemplo de um ensaio de conversão de fotos. As células endoteliais foram rastreadas durante o desenvolvimento do peixe-zebra de 48 a 72 horas após a fertilização usando uma linha repórter transgênica expressando kick G dentro dos núcleos endoteliais, como mostrado aqui antes da fotoconversão kick G foi expresso dentro do tecido endotelial e só foi detectável como fluorescência verde usando uma varredura de controle a laser de argônio de 488 nanômetros com um laser de 561 nanômetros para fluorescência vermelha. Não detectou nenhuma foto convertida kick GR antes da conversão da foto.

Posteriormente, a região de interesse foi completamente convertida em foto usando um laser de diodo de 405 nanômetros a 10% de intensidade, 20 iterações e os vasos principais foram escaneados novamente usando os lasers de 488 nanômetros e 561 nanômetros. Neste painel, o chute verde G mudou completamente para vermelho dentro da região de interesse para rastrear as células endoteliais fotoconvertidas em estágios posteriores. O embrião foi observado 24 horas após a fotoconversão, que é aproximadamente 72 horas após a fertilização dentro dos tecidos endoteliais decorrentes da região de interesse fotoconvertida.

As proteínas G de chute não convertidas e fotoconvertidas foram observadas devido à estabilidade do chute fluorescente vermelho g e à síntese de um novo chute verde não convertido G após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia do desenvolvimento explorarem a biologia celular e a remodelação de tecidos em vários peixes.