Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

O objetivo geral do experimento a seguir é medir a estabilidade da proteína intracelular e extracelular em embriões vivos de peixe-zebra. Isso é conseguido marcando uma proteína de interesse com uma proteína fluorescente fotoconversível e injetando mRNA, codificando a fusão, bem como um corante fluorescente em embriões de peixe-zebra. Em seguida, a proteína de fusão fotoconversível é fotoconvertida, cujo pulso rotula a proteína.

Neste exemplo, a proteína de fusão é secretada e, em seguida, o decaimento na intensidade de fluorescência fotoconvertida intra e extracelular é monitorado ao longo do tempo e equipado com uma função exponencialmente decrescente para determinar as meias-vidas intracelulares e extracelulares da proteína de fusão. Os resultados mostram a estabilidade in vivo de proteínas de fusão fotoconversíveis com base no decaimento do sinal fluorescente ao longo do tempo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave nos campos da biologia celular e do desenvolvimento.

Por exemplo, como a estabilidade influencia a distribuição e disponibilidade de proteínas. Estamos usando nosso software EP para a análise de dados de DP FD. O EP está disponível gratuitamente em nossa página da web Depois de gerar mRNA tampado na codificação de uma proteína de fusão conversível de verde para vermelho de interesse, transfira aproximadamente 31 embriões de peixe-zebra em estágio celular para uma placa de Petri de plástico revestida de vidro ou ágar de cinco centímetros de diâmetro contendo aproximadamente oito mililitros de meio embrionário.

Adicione dois mililitros de solução de estoque pro nay previamente preparada e descongelada ao prato e incube em temperatura ambiente por cinco a 10 minutos. Encha um alto-falante de vidro com meio embrionário e, evitando expor os embriões ao ar ou ao plástico, transfira os embriões para o béquer inclinando a placa de Petri enquanto a submerge no meio. Depois que os embriões se acomodarem no fundo do copo, despeje a maior parte do meio e use meio fresco para substituí-lo cuidadosamente.

O leve redemoinho do meio fresco fará com que os embriões percam seu córion enfraquecido. Depois de repetir a lavagem, use uma pipeta de PEs de vidro com ponta inflamada para transferir os embriões revestidos para uma placa de injeção revestida de agarose. Em seguida, co-injete o mRNA e um conjugado Alexa 4 88 DExT Strand de três quilodalton diretamente no centro da célula para garantir uma distribuição uniforme do mRNA e do corante.

Assim que a clivagem começar, transfira os embriões injetados para um poço revestido de uma a 2% de agarose de um prato de plástico de seis poços cheio de embriões, meio e incube no escuro a 28 graus Celsius até que os embriões atinjam o estágio final da esfera com um microscópio estereoscópico, identifique de um a cinco embriões saudáveis e use uma pipeta de PEs de vidro com uma ponta inflamada para removê-los do prato. Ejete suavemente os embriões em um tubo de microcentrífuga contendo aproximadamente um mililitro de aros derretido de 1% de baixo ponto de fusão em um meio embrionário x danios. Em seguida, puxe os embriões de volta para a pipeta junto com alguns aros.

Em seguida, ejete suavemente o aros e os embriões na tampa. Vidro de um prato com fundo de vidro. Para reutilizar a pipeta de vidro, limpe o aros residual para evitar entupimento, pipetando rapidamente o meio embrionário para cima e para baixo, trabalhando rapidamente antes que o aros solidifique.

Use uma sonda de metal para posicionar os embriões de forma que o poste do animal fique voltado para a lamínula sob o microscópio estereoscópico. Monitore as posições dos embriões e reajuste conforme necessário até que o agarro endureça. Quando o agarro estiver solidificado, use um meio de embrião x danios para encher o prato de fundo de vidro.

Para se preparar para a conversão de fotos, defina a incubadora para 28 graus Celsius e coloque uma grande gota de óleo de imersão na objetiva para garantir que o filme de óleo entre a objetiva e a lamínula não se quebre à medida que o estágio se move para diferentes posições do embrião. Durante a imagem com segurança, coloque o prato com fundo de vidro no palco para que o prato não se desloque quando o palco se mover. Em seguida, no pacote de software do microscópio confocal, defina a posição de cada embrião.

Ajuste a profundidade Z para cada embrião e tente atingir aproximadamente o mesmo plano em cada embrião usando os lasers de 4, 88 e 5, 43 nanômetros. Adquira imagens pré-conversão de fotos. Em seguida, configure o software do microscópio confocal para obter imagens de cada uma das posições definidas anteriormente com as condições de imagem apropriadas.

A cada 10 ou 20 minutos ou um curso de cinco horas para converter a chave da proteína de fusão em uma objetiva de 10 x e expor grupos de embriões à luz UV da lâmpada de mercúrio com um filtro de aproximadamente 300 a 400 nanômetros a 100% de saída por dois minutos. Mude o foco ao longo do eixo Z para promover uma conversão uniforme de fotos após a conversão de fotos. Volte para a objetiva 25 x ou 40 x imediatamente e confirme se as posições definidas anteriormente ainda são precisas.

Se o prato mudou durante a conversão da foto, redefina as posições dos embriões. Inicie o curso de tempo de imagem e deixe-o funcionar por cinco horas. Observe o tempo decorrido entre a fotoconversão e o início da imagem para cada embrião.

Ocasionalmente, verifique o experimento e monitore o nível do meio de Danielle, adicionando mais, se necessário. Comece inspecionando visualmente os conjuntos de dados do curso do tempo de cada embrião. Descarte conjuntos de dados de embriões que morreram durante a imagem que mudaram significativamente, que têm níveis muito baixos de sinal fotoconvertido ou que contêm regiões de células que parecem incomuns e que pararam de se mover e se dividir.

Usando o pacote de software baseado em Python, o PI F DAP cria uma máscara usando o sinal Alexa 4 88, que é estritamente intracelular. Para separar o sinal de fotoconversão intracelular e extracelular, aplique a máscara na imagem do canal vermelho correspondente para evitar que pixels intracelulares sejam considerados. Ao calcular a intensidade extracelular média para medir a intensidade intracelular média, inverta a máscara, exiba as imagens mascaradas geradas e inspecione-as visualmente e descarte conjuntos de dados nos quais as máscaras não distinguem com precisão o espaço intracelular do extracelular.

Use PI F DAP para calcular as intensidades médias de fluorescência extracelular e intracelular para cada imagem. Em seguida, ajuste os dados de fluorescência conforme mostrado aqui de acordo com as diretrizes do protocolo de texto e calcule a proteína extracelular e intracelular. Metade vive tau da taxa de liberação.

Constance K squint é uma proteína secretada que induz a expressão de genes endodérmicos mis durante a embriogênese do peixe-zebra. Neste experimento, os embriões foram co-injetados com Alexa 4 88 dextrana e mRNA que codifica o estrabismo DENDRA two e submetidos ao ensaio F DAP. Como mostrado aqui, a intensidade do sinal extracelular convertido por foto diminui com o tempo.

Usando PI F dap, perfis de intensidade extracelular de 23 embriões foram gerados e os dados foram ajustados com um modelo de depuração de primeira ordem. Os resultados indicam uma tau de meia-vida média de 116 minutos. Perfis de intensidade e proteína semelhantes.

As meias-vidas foram obtidas quando os intervalos entre as imagens foram de 10 ou 20 minutos. Sugerindo que o branqueamento de fotos ou a conversão inadvertida de fotos não contribuíram significativamente para as mudanças de intensidade. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o decaimento de fluorescência após a conversão de fotos.

Para medir in vivo. Meias-vidas de proteínas de fusão fotoconversíveis em embriões vivos de peixe-zebra.