Isolar células de melanócito-like primárias do coração mouse

O objetivo geral deste procedimento é isolar células viáveis semelhantes a melanócitos cardíacos do coração de camundongo. Isso é realizado primeiramente coletando corações de camundongos eutanasiados. O segundo passo é picar os corações e dissociar as células utilizando digestão enzimática e agitação mecânica.

Em seguida, a suspensão celular é centrifugada e o pellet contendo os cardiomiócitos e células semelhantes a melanócitos é ressuspendido. O passo final é o plaqueamento e cultivo. As células isoladas, células semelhantes a melanócitos cardíacos, podem ser utilizadas em estudos de patch ou análise de microarranjo em resposta a estressores fisiopatológicos para avaliar a excitabilidade celular ou o estado do transcriptoma.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes projetados para isolar e cultivar os cardiomiócitos é que ela resulta no isolamento de muitas células semelhantes a melanócitos cardíacos viáveis. Bem, tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando descobrimos uma nova população celular no coração de camundongo e desejamos investigar sua fisiologia. Para começar, prepare dois conjuntos de instrumentos cirúrgicos esterilizados, um para dissecar os corações e outro para picar o tecido.

Em seguida, prepare os suplementos do meio, mas aguarde para adicioná-los ao meio de cultura até imediatamente antes de semear as células. Após preparar o filtro do meio de cultura para esterilizar a solução enquanto trabalha em uma cabine de cultura de tecidos, armazene o meio a quatro graus Celsius. Prepare a solução de DNA adicionando 0,05 gramas de DNA a 100 mililitros de DPBS com 10% de FBS mais antibióticos.

Em seguida, prepare uma solução de tripsina 0,5% adicionando 0,5 gramas de tripsina a 100 mililitros de DPBS com antibióticos. Por fim, reúna os demais equipamentos necessários para realizar o procedimento, incluindo placas de Petri, tubos cónicos de 50 mililitros, peneiras celulares de 40 mícrons, DPBS com antibióticos e placas de cultura de 60 milímetros e 35 milímetros. Após a eutanásia de filhotes de camundongo neonatais de P zero a P dois, limpe o tórax com álcool e coloque-os em uma placa P dois de 10 centímetros com DPBS. Trabalhando sob um microscópio estereoscópico, abra cuidadosamente a cavidade torácica e remova todo o coração com as átrias anexadas.

Lave os corações em DPBS e transfira-os para um novo recipiente de Petri de 10 centímetros. Transfira o recipiente de Petri com os corações excisados para uma câmara de cultura tecidual e siga a técnica asséptica para os passos seguintes. Primeiro, lave os corações três vezes em DPBS estéril acrescido de antibióticos.

Coloque os corações em uma placa de cultura de 60 milímetros e adicione seis a oito mililitros de tripsina 0,5% em solução. Em seguida, corte os corações em pequenos pedaços e incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a conclusão da incubação, aspire a solução resultante da placa para um tubo cônico estéril de 10 mililitros.

Usando uma pipeta estéril de 10 mililitros, remisture a solução rapidamente, mas suavemente, de 30 a 50 vezes, e filtre a suspensão resultante através de um filtro celular de 40 mícrons para um novo tubo cônico limpo de 50 mililitros. Após a centrifugação, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet remanescente em seis a oito mililitros de DPBS estéril. Repita este passo mais duas vezes.

Após a terceira lavagem, seguindo a centrifugação, drenar ou aspirar cuidadosamente a solução de lavagem e ressuspender o pellet em seis mililitros de meio de cultura suplementado. Em seguida, aspirar a solução ressuspensa em uma pipeta estéril de transferência e colocar as células em uma placa de 35 milímetros. Coletar as células cardíacas isoladas de três camundongos neonatos após uma incubação noturna, aspirar o meio de cultura juntamente com quaisquer células não aderidas e, em seguida, lavar as placas uma vez com DPBS, adicionar meio fresco às placas e substituir o meio.

A cada dois dias, as células isoladas de corações neonatais ou embrionários podem ser mantidas em cultura por até três semanas, enquanto as células isoladas de corações adultos podem ser mantidas em cultura por até 10 dias. Para isolar células semelhantes a melanócitos de um coração de camundongo adulto, primeiro lave os corações removidos em DPBS estéril contendo antibióticos em uma cabine de cultura de tecidos. Aperte levemente o coração com pinças de dissecação curvas para remover qualquer sangue remanescente e, em seguida, enxágue o coração em DPBS mais uma vez.

Em seguida, remova os átrios e o anel átrio-ventricular dos corações e coloque os espécimes de tecido ressecado em uma placa de 35 milímetros. Corte os corações em pequenos pedaços utilizando tesoura curva e pinça. Adicione seis a oito mililitros de solução de tripsina 0,5% à placa e incube a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.

Após a incubação, repita os passos demonstrados anteriormente para obter uma suspensão de células cardíacas adultas e platers antes. Neste exemplo, a seta branca identifica o melanócito cardíaco em ambos os painéis. Observe que, sem a ajuda do marcador fluorescente, o melanócito cardíaco é difícil de identificar e distinguir dos miócitos atriais aderidos à placa, os quais são indicados pela seta azul-clara que aponta para células atriais mal aderidas à placa, conforme mostrado aqui, um melanócito cardíaco saudável isolado do coração de um camundongo neonatal.

Eles desenvolveram extensos processos dendríticos e se assemelham estreitamente aos melanócitos cutâneos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser realizada em algumas horas, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar células de melanócitos viáveis do coração.

Isso será adequado para análise fisiológica e molecular.