Isolar células de melanócito-like primárias do coração mouse

O objetivo geral deste procedimento é isolar células viáveis semelhantes a melanócitos cardíacos do coração do camundongo. Isso é feito primeiro colhendo corações de camundongos sacrificados. O segundo passo é picar os corações e dissociar as células usando digestão enzimática e agitação mecânica.

Em seguida, a pasta de células é centrifugada e o pellet contendo os cardiomiócitos e células semelhantes a melanócitos é suspenso. A etapa final é o prato e a cultura. As células isoladas em última análise de melanócitos cardíacos podem ser usadas para estudos de contato ou análise de microarray em resposta ao estressor fisiopatológico para avaliar a excitabilidade celular ou o status do transcriptoma.

A principal vantagem desta técnica sobre o método existente projetado para isolar e cultivar os cardiomiócitos é que ela resulta no isolamento de muitos melanócitos cardíacos vestíveis como células. Bem, tivemos a ideia para esse método quando descobrimos uma nova população de células, o coração de camundongo, e queríamos investigar sua fisiologia. Para começar, prepare dois conjuntos de instrumentos cirúrgicos esterilizados, um para dissecar os corações e outro para picar o tecido.

Em seguida, prepare os suplementos de mídia, mas espere para adicioná-los à mídia de cultura até pouco antes de plaquear as células. Depois de preparar o filtro do meio de cultura para esterilizar a solução enquanto trabalha em uma capela de cultura de tecidos, armazene o meio a quatro graus Celsius. Prepare a solução de DNA adicionando 0,05 gramas de DNA, um a 100 mililitros de DPBS com 10% de FBS mais antibióticos.

Em seguida, prepare uma solução de 0,5% de tentina adicionando 0,5 gramas de tripsina a 100 mililitros de DPBS mais antibióticos. Por fim, reúna outros equipamentos necessários para concluir o procedimento, incluindo placas de Petri, tubos cônicos de 50 mililitros, filtros de células de 40 mícrons, DPBS mais antibióticos, placas de cultura de 60 milímetros e 35 milímetros. Depois de sacrificar P zero a P dois filhotes de camundongos neonatais, limpe o peito com álcool e coloque-os em um prato P de 10 centímetros com DPBS trabalhando sob um microscópio estéreo, abra cuidadosamente a cavidade torácica e remova todo o coração com os átrios conectados.

Lave os corações em DPBS e transfira-os para uma nova placa de Petri de 10 centímetros. Mover a placa de Petri com os corações excisados para uma capa de cultura de tecidos e seguir a técnica estéril para os passos seguintes. Primeiro, lave os corações três vezes em DPBS estéril mais antibióticos.

Coloque os corações em uma placa de cultura de 60 milímetros e adicione de seis a oito mililitros de 0,5% de viagens em solução. Em seguida, corte os corações em pedaços pequenos e incube-os a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após a conclusão da incubação, puxe a solução resultante do prato para um tubo cônico estéril de 10 mililitros.

Usando uma pipeta estéril de 10 mililitros rapidamente, mas reavalie suavemente a solução 30 a 50 vezes, filtre a suspensão resultante através de um filtro de célula de 40 mícrons em um novo tubo cônico limpo de 50 mililitros. Após a centrifugação, aspire suavemente o supinato e ressuspenda o pellet restante em seis a oito mililitros de DPBS estéril. Repita esta etapa mais duas vezes.

Após o terceiro enxágue após a centrifugação, drene ou aspire cuidadosamente a solução de lavagem e ressuspenda o pellet em seis mililitros de meio de cultura suplementado. Em seguida, coloque a solução ressuspensa em uma pipeta de transferência estéril e coloque as células em um prato de 35 milímetros. Retire as células cardíacas isoladas de três camundongos neonatais após uma incubação noturna, aspire o meio de cultura junto com quaisquer células soltas e, em seguida, enxágue as placas uma vez com DPBS, adicione meio novo às placas e substitua o meio.

A cada dois dias, as células isoladas de corações neonatais ou embrionários podem ser mantidas em cultura por até três semanas, enquanto as células isoladas de corações adultos podem ser mantidas em cultura por até 10 dias. Para isolar células semelhantes a melanócitos de um coração de camundongo adulto, primeiro lave os corações excisados em DPBS estéril contendo antibióticos em uma capa de cultura de tecidos. Aperte levemente o coração com uma pinça de dissecação curva para remover o sangue restante e, em seguida, enxágue o coração na SPBD mais uma vez.

Em seguida, remova os átrios e o anel ventricular atrial dos corações e coloque as amostras de tecido excisado em um prato de 35 milímetros. Corte os corações em pedaços pequenos usando uma tesoura curva e uma pinça. Adicione seis a oito mililitros de 0,5% de viagens em solução ao prato e incube a 37 graus Celsius por 45 a 60 minutos.

Após a incubação, repita as etapas demonstradas anteriormente para obter uma suspensão de células cardíacas adultas e placas antes. Neste exemplo, a seta branca identifica o melanócito cardíaco em ambos os painéis. Observe que, sem o auxílio do marcador fluorescente, o melanócito cardíaco é difícil de identificar e distinguir dos miócitos atriais ligados à placa, a ponta da seta azul clara aponta para células atriais que não estão bem presas à placa mostrada aqui, um melanócitos cardíacos saudáveis isolados de um coração de camundongo neonatal.

Eles desenvolveram extensos processos dendríticos e se assemelham muito aos melanócitos cutâneos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em poucas horas se for executada corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar células de melanócitos viáveis do coração.

Isso será adequado para análises fisiológicas e moleculares.