Análise de Transcriptoma Humanos espécimes cirúrgicos retina utilizando Jornal

O objetivo geral deste procedimento é purificar o RNA de espécimes cirúrgicos da retina humana para análise do transcriptoma no descolamento de retina. Para isso, os reagentes e materiais necessários para a coleta da peça cirúrgica são preparados em laboratório e enviados ao hospital. Durante o procedimento cirúrgico, a amostra é coletada e devolvida ao laboratório.

O RNA é então purificado usando um procedimento padronizado de gradiente de cloreto de césio e a qualidade do RNA purificado é avaliada. Finalmente. A análise da expressão do mRNA mostra que tanto a inflamação quanto a degeneração dos fotorreceptores estão envolvidas no descolamento da retina indicado por alterações na expressão de genes-chave. Nestes processos identificados pela análise transcriptômica, A principal vantagem do jornal sobre a purificação de orna existente, como o cloro GTIN de extração, também conhecido como ole, é o resultado da orna não estão contaminados com DNA.

A aplicação desta técnica se estende às terapias de descolamento de retina, pois fornece meios técnicos para desenvolver novas terapias adjuvantes. Para cada amostra a ser coletada, use uma pipeta livre de RNAs para encher um tubo de fundo redondo de polietileno estéril de cinco mililitros com 2,4 mililitros de uma solução de cloreto de guiné livre de seis molares de RNAs. Use gás argônio para encher a parte superior dos tubos.

Em seguida, coloque rapidamente a tampa pressionando firmemente para garantir que ela esteja selada. Isso evitará a oxidação do cloreto de Guiné ao longo de vários anos de armazenamento no gabinete cirúrgico. Em seguida, coloque cada um dos cinco tubos de mililitro em um tubo inferior cônico de polipropileno estéril de 50 mililitros.

Depois de adicionar o lenço e aparafusar a tampa, coloque os tubos de 50 mililitros em uma grade de poliestireno. Em seguida, coloque o rack e os envelopes preparados junto com os formulários de remessa preparados em uma caixa de papelão no hospital. Traga a caixa de papelão do gabinete cirúrgico para a sala cirúrgica.

Durante a cirurgia, coloque a amostra de retina em um tubo cheio de quantidade e solução de cloreto. Feche bem o tubo. Misture o tubo brevemente.

Em seguida, coloque o tubo no balancim do tubo de sangue por 10 minutos. Preencha o formulário de amostra que acompanha com a identificação do paciente, data da cirurgia e quaisquer observações adicionais. Em seguida, escreva o número de identificação no tubo numerado correspondente de 50 mililitros.

Em seguida, coloque o tubo de cinco mililitros com a peça cirúrgica no tubo de 50 mililitros. Substitua o lenço de papel e tampe o tubo. Em seguida, coloque o tubo de 50 mililitros e o formulário de entrada de amostra no envelope acolchoado apropriado e feche-o.

Assim que a amostra for recebida no laboratório, homogeneizar a amostra em seu tubo de cinco mililitros com um homogeneizador poly tron TM na configuração máxima por um minuto enquanto move o tubo para cima e para baixo. Uma vez homogeneizada a amostra, para extrair os polissacarídeos, adicione 270 microlitros de acetato de potássio de dois molares e coloque o tubo em um agitador na posição horizontal. Agitar vigorosamente durante 10 minutos e, em seguida, centrifugar durante 10 minutos a 6 500 g a 20 graus Celsius.

Após a centrifugação, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente a fração solúvel sem perturbar o pellet. Transfira o sobrenadante para um tubo livre de RNAs estéreis de 14 mililitros. Ao lado do sobrenadante, adicione 5,3 mililitros de 1% e Laurel Sarcosine em 100, tri milimolar e 3,2 gramas de cloreto de césio.

A sarcosina solubilizará a membrana e o cloreto de césio é usado para gerar um gradiente. Misture o tubo por vórtice por um minuto. Adicione 1,8 mililitros de cloreto de césio EDTA a um tubo de centrífuga de polímero estéril de 11 mililitros.

Em seguida, com uma pipeta pastor estéril de 10 mililitros, coloque a solução de RNA na solução de cloreto de césio EDTA, permitindo que ela escorra pela superfície interna do tubo. Coloque os tubos em uma centrífuga. Use um segundo tubo contendo os tampões sem retina como equilíbrio, se necessário, e gire por 24 horas a 225.000 G a 20 graus Celsius.

No dia seguinte. Após a centrifugação, uma camada lipídica terá se formado no topo do tubo. O DNA estará no meio e o RNA será peletizado no fundo do tubo.

Use uma pipeta de pasta estéril para remover e descartar cuidadosamente a camada lipídica superior com uma segunda pipeta de pasta estéril. Remova gradualmente a solução até que o DNA viscoso seja aspirado. Descarte a solução e o DNA.

Em seguida, usando uma terceira pipeta pastor estéril, remova e descarte a solução restante. Tomando cuidado para não perturbar o pellet de RNA. Agora, usando um bisturi esterilizado com chama, corte o tubo conforme mostrado aqui e descarte a parte superior.

Coloque a parte restante de cabeça para baixo em gaze estéril. Inverta o tubo e use uma pipeta para enxaguá-lo delicadamente com 160 microlitros de cloreto de guiné. Deixe o pellet secar por 10 minutos.

Assim que o pellet estiver seco, ressuspenso em 150 microlitros de tris, E-D-T-A-S-D-S. Em seguida, adicione 150 microlitros de tris, EDTA e 30 microlitros de acetato de sódio de três molares e, em seguida, vórtice para precipitar o RNA. Adicione 900 microlitros de gelado, 100% de etanol.

Vortex o tubo e coloque-o no gelo derretido por 30 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por 30 minutos a 18.000 G a quatro graus Celsius. Após a rotação, uma pequena pelota branca pode ou não ser visível.

Quer o pellet possa ou não ser visto delicadamente, aspire o sobrenadante e descarte-o. Em seguida, para remover o excesso de sal, adicione 500 microlitros de temperatura ambiente, 70% de etanol e vórtice, a centrífuga de tubo, o tubo por 20 minutos a 18.000 G a quatro graus Celsius. Depois de repetir a lavagem e centrifugação com etanol a 70%, use uma pipeta P 200 para remover o etanol restante.

Deixe o pellet secar ao ar por 10 minutos. Ressuspenda o pellet em 50 microlitros de água tratada vigorosamente por vórtice por dois minutos. Em seguida, coloque a amostra em banho-maria a 45 graus Celsius por 15 minutos.

Para ressuspender totalmente o RNA. Por fim, determinar a concentração de RNA por absorbância a 260 nanômetros e analisar o RNA por eletroforese em gel de acordo com o protocolo. No documento anexo, Para examinar o transcriptoma do descolamento de retina, o procedimento de diário foi usado para recuperar e analisar o RNA da retina de 18 pacientes com descolamento de retina e 18 controles pareados por idade preparados usando retinas post-mortem.

O RNA foi posteriormente purificado e analisado usando eletroforese em gel e base rettino, conforme descrito neste relatório, mostrados aqui estão gráficos de radar que representam a expressão do monócito quimiotático M CP um gene CCL dois. A parte direita da figura rotulada RD corresponde ao RNA dos pacientes com descolamento de retina, enquanto a parte esquerda rotulada N é RNA dos controles, como pode ser visto aqui. O descolamento de retina resulta na regulação positiva do CCL dois, conforme indicado pelos altos valores de C na maioria das amostras de RD à direita em comparação com os controles à esquerda.

Esse aumento indica inflamação nos pacientes com descolamento de retina, como pode ser visto aqui. A expressão do gene transdutor de fotorreceptores de bastonetes GNAT um foi diminuída ao contrário do CCL dois, os valores são baixos para os espécimes RD à direita, uma diminuição na expressão da opsina do cone de ondas curtas O PN um SW, e o gene homeo CRX também foi observado sugerindo degeneração fotorreceptora de bastonetes e cones em pacientes com descolamento de retina Através deste método pode fornecer informações sobre as alterações na expressão gênica após o descolamento de retina. Também pode ser aplicado a outras patologias da retina em modelos animais, como degenerações retinianas hereditárias.

Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque requer conhecimento de ácido nucléico. Cy.Uma demonstração visual deste método é crítica como um workover, que RNA após a certificação é complicado.