Análise de Transcriptoma Humanos espécimes cirúrgicos retina utilizando Jornal
14 de agosto de 2013
Usamos amostras de retina de retinectomy para uma análise transcriptomic de descolamento de retina. Foi desenvolvido um processo que permite a conservação de ARN entre os blocos cirúrgicos e laboratoriais. Temos um protocolo padronizado para purificar RNA por ultracentrifugação de cloreto de césio para assegurar que os ARN purificados são adequados para a análise de microarray.
O objetivo geral deste procedimento é purificar RNA de espécimes cirúrgicos humanos da retina para análise de transcriptoma na descolamento de retina. Utilizando o jornal para isso, os reagentes e materiais necessários para a coleta do espécime cirúrgico são preparados no laboratório e enviados ao hospital. Durante o procedimento cirúrgico, o espécime é coletado e devolvido ao laboratório.
O RNA é então purificado utilizando um procedimento padronizado de gradiente de cloreto de césio e a qualidade do RNA purificado é avaliada. Por fim, a análise da expressão de mRNA mostra que tanto a inflamação quanto a degeneração dos fotorreceptores estão envolvidas no descolamento da retina, indicado por alterações na expressão de genes-chave. Nestes processos identificados pela análise transcriptômica, a principal vantagem do método em relação às técnicas existentes de purificação de orna, como a extração com GTIN clor, também conhecida como ole, é que o orna resultante não fica contaminado com DNA.
A aplicação desta técnica estende-se às terapias para descolamento de retina, pois fornece meios técnicos para desenvolver novas terapias adjuvantes. Para cada amostra a ser coletada, utilize uma pipeta livre de RNAses para preencher um tubo estéril de polietileno com fundo redondo de cinco mililitros com 2,4 mililitros de uma solução seis molar livre de RNAses de cloreto de guanidina. Utilize gás argônio para preencher a parte superior dos tubos.
Em seguida, coloque rapidamente a tampa, pressionando firmemente para garantir que esteja vedada. Isso evitará a oxidação do cloreto de guinina durante vários anos de armazenamento no armário cirúrgico. A seguir, coloque cada um dos tubos de cinco mililitros em um tubo estéril de polipropileno de 50 mililitros com fundo cônico.
Após adicionar o tecido e rosquear a tampa, coloque os tubos de 50 mililitros em um suporte de poliestireno. Em seguida, coloque o suporte e os envelopes preparados, juntamente com os formulários de envio preparados, em uma caixa de papelão no hospital. Leve a caixa de papelão do armário cirúrgico para a sala cirúrgica.
Durante a cirurgia, coloque a amostra retiniana em um tubo contendo solução de quantidade e cloreto. Feche o tubo firmemente. Agite o tubo brevemente.
Em seguida, coloque o tubo no agitador de tubos de sangue por 10 minutos. Preencha o formulário de amostra acompanhante com a identificação do paciente, data da cirurgia e quaisquer observações adicionais. Depois, escreva o número de identificação no tubo correspondente numerado de 50 mililitros.
Em seguida, coloque o tubo de cinco mililitros com o espécime cirúrgico dentro do tubo de 50 mililitros. Substitua o papel-toalha e tampe o tubo. Em seguida, coloque o tubo de 50 mililitros e o formulário de recebimento da amostra no envelope acolchoado apropriado e feche-o.
Uma vez que a amostra for recebida no laboratório, homogeneíze o espécime no seu tubo de cinco mililitros com um homogeneizador Polytron TM na configuração máxima por um minuto, movimentando o tubo para cima e para baixo. Após a homogeneização da amostra, para extrair os polissacarídeos, adicione 270 microlitros de acetato de potássio dois molar e coloque o tubo em um agitador na posição horizontal. Agite vigorosamente por 10 minutos, em seguida centrifugue por 10 minutos a 6.500 ×g a 20 graus Celsius.
Após a centrifugação, utilize uma pipeta para aspirar cuidadosamente a fração solúvel sem perturbar o precipitado. Transfira o sobrenadante para um tubo estéril de 14 mililitros livre de RNAses. Ao lado do sobrenadante, adicione 5,3 mililitros de Lauril Sarcosina 1% em Tris 100 milimolar e 3,2 gramas de cloreto de césio.
A sarcosina solubilizará a membrana e o cloreto de césio é usado para gerar um gradiente. Misture o tubo por vortexagem durante um minuto. Adicione 1,8 mililitros de cloreto de césio com EDTA a um tubo de centrífuga estéril de 11 mililitros de polímero.
Em seguida, com uma pipeta Pasteur estéril de 10 mililitros, sobreponha a solução de RNA à solução de cloreto de césio com EDTA permitindo que escorra pela superfície interna do tubo. Coloque os tubos em uma centrífuga. Use um segundo tubo contendo os tampões sem retina como contrapeso, se necessário, e centrifugue por 24 horas a 225.000 ×g a 20 °C.
No dia seguinte. Após a centrifugação, uma camada lipídica terá se formado na parte superior do tubo. O DNA estará na camada intermediária e o RNA estará em pelota na base do tubo.
Utilize uma pipeta de Pasteur estéril para remover cuidadosamente e descartar a camada lipídica superior com uma segunda pipeta de Pasteur estéril. Remova gradualmente a solução até que o DNA viscoso seja aspirado. Descarte a solução e o DNA.
Em seguida, utilizando uma terceira pipeta Pasteur estéril, remova e descarte a solução remanescente, tomando cuidado para não perturbar o pellet de RNA. Agora, utilizando um bisturi esterilizado pela chama, corte o tubo conforme mostrado aqui e descarte a porção superior.
Coloque a parte restante de cabeça para baixo sobre uma gaze estéril. Inverta o tubo e use uma pipeta para lavá-lo delicadamente com 160 microlitros de cloreto de guiné. Deixe o precipitado secar por 10 minutos.
Uma vez que o pellet esteja seco, ressuspenda em 150 microlitros de tris, E-D-T-A-S-D-S. Em seguida, adicione 150 microlitros de tris, EDTA e 30 microlitros de acetato de sódio três molar, e então vortexe para precipitar o RNA. Adicione 900 microlitros de etanol 100% gelado.
Vortexe o tubo e coloque-o sobre gelo derretido por 30 minutos. Em seguida, centrifugue o tubo por 30 minutos a 18.000 G a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, um pequeno pellet branco pode ou não estar visível.
Independentemente de o pellet ser visível ou não, aspire cuidadosamente o sobrenatante e descarte-o. Em seguida, para remover o excesso de sal, adicione 500 microlitros de etanol 70% à temperatura ambiente e vortexe o tubo. Centrifugue o tubo por 20 minutos a 18.000 ×g a quatro graus Celsius. Após repetir a lavagem com etanol 70% e a centrifugação, utilize uma pipeta P200 para remover todo o etanol remanescente.
Deixe o pellet secar ao ar por 10 minutos. Re-suspenda o pellet em 50 microlitros de água tratada, misturando vigorosamente em vórtex por dois minutos. Em seguida, coloque a amostra em banho-maria a 45 graus Celsius por 15 minutos.
Para ressuspender completamente o RNA. Por fim, determine a concentração de RNA por absorvância em 260 nanômetros e analise o RNA por eletroforese em gel de acordo com o protocolo. No documento anexo, para examinar o transcriptoma do descolamento da retina, o procedimento do periódico foi utilizado para recuperar e analisar o RNA retiniano de 18 pacientes com descolamento da retina e 18 controles pareados por idade, preparados usando retinas pós-mortem.
O RNA foi posteriormente purificado e analisado por eletroforese em gel e base retino, conforme descrito neste relatório. Aqui são apresentados gráficos de radar representando a expressão do gene CCL dois, quimiotático para monócitos MCP um. A parte direita da figura, identificada como RD, corresponde ao RNA de pacientes com descolamento de retina, enquanto a parte esquerda, identificada como N, corresponde ao RNA dos controles, conforme pode ser observado. O descolamento de retina resulta na superexpressão de CCL dois, indicada pelos altos valores de C na maioria das amostras de RD à direita, em comparação com as dos controles à esquerda.
Esse aumento indica inflamação nos pacientes com descolamento de retina, como pode ser visto aqui. A expressão do gene transducina dos fotorreceptores bastonetes GNAT1 foi reduzida, ao contrário do CCL2; os valores são baixos para as amostras de DR à direita, uma diminuição na expressão da opsinina do cone de onda curta OPN1SW e também foi observada uma redução no gene homeobox CRX, sugerindo degeneração dos fotorreceptores bastonetes e cones em pacientes com descolamento de retina. Este método pode fornecer informações sobre alterações na expressão gênica após o descolamento de retina. Pode ser também aplicado a outras patologias retinianas em modelos animais, como degenerações retinianas herdadas.
Indivíduos novos neste método podem ter dificuldades porque ele exige conhecimento sobre ácidos nucleicos. Uma demonstração visual deste método é essencial como revisão, já que o RNA após a certificação é delicado.
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Visão Geral
Este estudo tem como foco a purificação de RNA de espécimes cirúrgicos retinianos humanos para analisar o transcriptoma em casos de descolamento de retina. Um procedimento padronizado com gradiente de cloreto de césio é utilizado para garantir a qualidade do RNA para análises posteriores.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Retiniana
- Transcriptômica
Contexto
- A descolamento da retina pode levar à perda significativa da visão.
- Compreender as alterações na expressão gênica é crucial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas.
- A qualidade do RNA é essencial para uma análise transcritômica precisa.
- Os métodos existentes de purificação de RNA podem levar à contaminação.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para purificação de RNA a partir de amostras de retina.
- Analisar a expressão de mRNA relacionada ao descolamento de retina.
- Avaliar o envolvimento da inflamação e da degeneração dos fotorreceptores.
Métodos Utilizados
- Coleta de amostras da retina durante a retinectomia.
- Preparação de reagentes e materiais para extração de RNA.
- Procedimento padronizado de gradiente de cloreto de césio para purificação de RNA.
- Avaliação da qualidade do RNA para análise por microarray.
Resultados Principais
- Identificação de alterações-chave na expressão gênica associadas ao descolamento de retina.
- Evidência de inflamação e degeneração dos fotorreceptores na análise transcriptômica.
- Demonstração de que o novo método evita contaminação por DNA.
- Qualidade aprimorada do RNA, adequada para análise por microarray.
Conclusões
- O método de purificação de RNA desenvolvido é eficaz para amostras da retina.
- A análise transcriptômica fornece informações sobre os mecanismos do descolamento da retina.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para pesquisas adicionais em doenças da retina.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O descolamento de retina desencadeia inflamação e degeneração dos fotorreceptores simultaneamente, criando um ambiente fisiopatológico complexo que complica o desenvolvimento de terapias. O método jouRNAl permite o perfilamento transcriptômico de alta fidelidade de espécimes humanos de retina descartados cirurgicamente, fornecendo uma fonte escalável de tecido relevante para a doença, útil na validação de alvos. Essa abordagem auxilia na redução de riscos mecanicistas ao associar assinaturas moleculares a fenótipos clínicos, orientando decisões de avanço ou interrupção em pipelines oftalmológicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da detecção simultânea de vias inflamatórias e degenerativas em tecido retiniano humano.
- Valor Operacional: Transforma espécimes cirúrgicos descartados em sistemas biológicos validados, reduzindo a dependência de modelos animais na avaliação inicial de alvos.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao fornecer dados de expressão derivados de humanos para CCL2, GNAT1, OPN1SW e CRX como biomarcadores da progressão da RD.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Fornece RNA livre de DNA adequado para microarranjos e RT-PCR, garantindo especificidade do ensaio em leituras de expressão gênica.
- Valor Operacional: Protocolo padronizado de gradiente de cloreto de césio assegura reprodutibilidade entre lotes e locais, permitindo campanhas de triagem escaláveis.
- Prontidão para Ensaios: Qualidade do RNA purificado validada por eletroforese em gel e absorbância, apoiando avaliação confiável de compostos em telas fenotípicas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a descoberta e o trabalho pré-clínico ao utilizar espécimes retinianos humanos para validar achados em modelos animais de degeneração retiniana herdada.
- Alinhamento de Biomarcadores: Identifica a superexpressão de CCL2 e a subexpressão de genes de fotorreceptores como assinaturas passíveis de translação para o monitoramento terapêutico.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece subsídios mecanicistas sobre a progressão da DR, orientando o desenho de ensaios clínicos estratificados por biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método jouRNAl integra-se ao continuum de descoberta, desde a identificação inicial de alvos até a validação pré-clínica, permitindo a redução de riscos baseada em tecidos humanos antes da otimização do fármaco líder.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre vias de inflamação e degeneração por meio da análise transcriptômica de espécimes retinianos humanos.
- Triagem: Fornece saídas padronizadas e quantitativas de RNA adequadas para perfis de expressão gênica de alto rendimento.
- Análises: Gera resultados mensuráveis (por exemplo, superexpressão de CCL2, subexpressão de GNAT1) que permitem comparação entre condições e priorização de alvos.
- Pesquisa Translacional: Conecta dados de espécimes humanos à continuidade pré-clínica, permitindo análises comparativas em sistemas relevantes para a doença.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma reutilizável para extração de RNA de tecidos cirúrgicos, aplicável a diversas patologias retinianas e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir a ambiguidade mecanicista por meio da transcriptômica direta de tecidos humanos.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade por meio da purificação com cloreto de césio, minimizando a variabilidade entre lotes em estudos multicêntricos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer evidências moleculares derivadas de humanos, reduzindo o risco biológico em estágios avançados em programas de oftalmologia.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em assinaturas simultâneas de inflamação e degeneração em amostras derivadas de pacientes.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de ácidos nucleicos e em técnicas de ultracentrifugação em gradiente.
- Depende do acesso a cloreto de césio, ultracentrífugas e infraestrutura laboratorial livre de RNase.
- Necessita padronização entre equipes cirúrgicas, de patologia e de biologia molecular para o rastreamento de espécimes.
- A adaptação a outros tipos de tecidos pode exigir otimização das etapas de homogeneização e lise.
- Limitação prática: o rendimento de RNA depende da transferência oportuna dos espécimes e da prevenção da exposição à RNase durante a coleta cirúrgica.
