Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Este experimento usa citometria de fluxo para detectar e quantificar proteínas nucleares em núcleos isolados e imunomarcados de neutrófilos para purificar os neutrófilos do sangue periférico humano. Remova os glóbulos vermelhos com dextrina seguida de centrifugação do plasma com gradiente de densidade. Em seguida, usando anticorpos anti-receptores, estimule os neutrófilos purificados por meio de integrinas ou receptores FC.

Prossiga para isolar os núcleos e fixar as amostras para imunomarcação com anticorpos específicos contra o fator nuclear NU de interesse. Por exemplo, o NF kappa B finalmente analisa os núcleos por citometria de fluxo para detectar pequenas alterações na ativação do fator nuclear. São obtidos resultados que mostram que a estimulação de neutrófilos por meio de suas integrinas leva a um aumento na concentração nuclear do fator de transcrição N do kappa B As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são geralmente estudadas por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mudança de mobilidade eletroforética em células primárias.

Muitas vezes, esses métodos não são adequados. A citometria de fluxo oferece detecção e quantificação rápidas de proteínas nucleares em núcleos isolados. Comece com 10 mililitros de sangue recém-coletado de voluntários adultos saudáveis.

Pipete dois mililitros de solução de 6% dextrina T 500 em um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de sangue misturado invertendo o tubo duas ou três vezes e aguarde 45 minutos para a sedimentação de eritrócitos por gravidade em um novo tubo de centrífuga cônica de 15 mililitros. Coloque cinco mililitros de embalagem FI fial.

Colha o plasma rico em leucócitos que se formou acima dos eritrócitos sedimentados. Coloque-o cuidadosamente em cima do pacote de fial para formar duas fases, centrifugue a 516 Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e quebre o pellet celular batendo o tubo contra o rack.

Em seguida, ressuspenda as células em 10 mililitros de PBS frio. Transferir a suspensão celular para um tubo de centrifugação cónico de 50 mililitros e centrifugar a 290 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Quebre o pellet celular como antes e adicione 10 mililitros de solução hipotônica fria aos eritrócitos de soda cáustica.

Misture girando o tubo suavemente por exatamente um minuto. Em seguida, adicione 10 mililitros de mistura de solução hipertônica fria e guarde com gelo. Agora enumere as células após a peletização dos neutrófilos por centrifugação.

Suspendemos o PMN em 10 elevado a sete células por mililitro. No PBS frio, mantenha as células no gelo. Alíquota de 100 microlitros de suspensão PMN em tubos einor de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione o anticorpo monoclonal correspondente a 10 microgramas por mililitro e incube no gelo por 15 minutos. Para lavar as células, adicione um mililitro de centrífuga PBS fria e aspire o sobrenadante. Em seguida, quebre suavemente o pellet celular e lave mais duas vezes com PBS.

Para remover o anticorpo não ligado, suspenda novamente o PMN lavado no mesmo volume inicial de PBS quente contendo 60 microgramas por mililitro de go anti musa IgG incubar a 37 graus Celsius por um a 20 minutos, dependendo do fator nuclear de interesse. Agora adicione um mililitro de PBS frio Depois de peletizar as células por centrifugação, remova o snat e congele os pellets de células imediatamente em um banho de etanol com gelo seco. Para cada amostra, remova o tubo do conjunto de gelo seco banho de etanol limpe e resus.

Suspenda os pellets de PMN congelados em 100 microlitros de solução hipotônica fria. Coloque todas as amostras no gelo para monitorar as amostras quanto à integridade dos núcleos. Manchar um Eloqua da suspensão dos núcleos com azul trian.

Se a suspensão dos núcleos contiver muitas células intactas ou detritos, é melhor descartar a preparação e iniciar o procedimento com outra amostra. Depois de peletizar os núcleos por centrifugação, remova o sobrenadante com muito cuidado e fixe os núcleos em 100 microlitros de solução de aldeído paraforme a 4% a frio e incube os núcleos no gelo. Após a peletização dos núcleos, remova cuidadosamente o snat a 100 microlitros de tampão de permeação a frio e incube as amostras em gelo por 10 minutos.

Em seguida, colha os núcleos permanentes por centrifugação. Neste ponto, os pellets de núcleos não se fixam bem no fundo do tubo. Recomenda-se que o futuro centrif novamente.

Se o pellet se soltar Para bloquear locais de ligação não específicos, suspendemos os núcleos em 500 microlitros de soro bovino frio a 4% fetal em PBS e incubamos em gelo por 20 minutos. Pulverize os núcleos por centrifugação e, em seguida, ressuspenda os núcleos e 100 microlitros de PBS frio contendo 4% de FBS e 2,5 microgramas por mililitro do anticorpo monoclonal contra o fator nuclear de interesse. Incube as amostras no gelo por 20 minutos após lavar as amostras duas vezes com 500 microlitros de PBS frio com 4% FBS, suspendemos os núcleos em 100 microlitros de PBS frio contendo 4% FBS e 10 microgramas mililitro do anticorpo secundário marcado com FZ correspondente incubar no gelo por 20 minutos após duas lavagens, suspender novamente os núcleos em 400 microlitros de 4% de paraldeído frio em PBS.

Analise os núcleos imunomarcados em um citômetro de fluxo, como uma varredura de fatos ou aparelho semelhante. Ajuste as configurações de aquisição dois FSC em escala logarítmica em 10 para o SSC negativo em escala logarítmica em 196 e núcleos de porta em adotar plotagem. Adquira 10.000 núcleos por amostra.

Em seguida, analise a fluorescência dos núcleos de coloração fitsy através do canal FL one definido em escala logarítmica em 400. Este método de purificação de PMN geralmente fornece neutrófilos não estimulados com uma pureza superior a 95% dos núcleos de PMN são isolados com altos rendimentos, isolados em núcleos, podem ser facilmente reconhecidos como uma população diferente de PMN intacto no citômetro de fluxo com um gráfico de pontos após a estimulação. Ao reticular as integrinas beta one, o NF kappa B é traduzido para o núcleo e esse incremento no NF kappa B nuclear é detectado como um aumento na fluorescência.

Da mesma forma, a estimulação do PMN pela reticulação de beta duas integrinas também induz a ativação do NF kappa B, conforme indicado por um aumento na fluorescência. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas alterações nos níveis de fator nuclear, como evidenciado pelo fato de que as integrinas beta um, que se ligam a proteínas da matriz extracelular, como a fibronectina, induzem uma ativação mais forte do NF kappa B do que as integrinas beta duas, que se ligam a moléculas de adesão em outras células. Este método apresenta grande flexibilidade porque muitos fluorocromos diferentes podem ser usados e porque permite a preparação de núcleos de diferentes tipos de células, utilizou esta abordagem simples e econômica para estudos de transdução de sinal que envolvem mudanças nos níveis de proteínas no núcleo de uma variedade de tipos de células.