Name: Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprenda a detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo. Este método permite quantificar proteínas nucleares e estudar vias de sinalização em células imunes.

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Os autores gostariam de agradecer a Nancy Mora por sua assistência técnica. Este trabalho foi financiado por bolsas de investigação 48573-M e 168098 do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, do México, e por doações e IN212308 IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Academico Pessoal, Universidad Nacional Autónoma de México, México.

1. Isolamento de Neutrófilos (PMN) a partir de Sangue Humano <ol><li> Usar cerca de 20 ml de sangue humano com heparina (10 U / ml) como anti-coagulante. O sangue foi coletado de voluntários adultos saudáveis ​​por venopuntura. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação da Comissão de Bioética no Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM. </li><li> Coloque 2 ml de 6% de dextrana T500 em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar 10 ml de sangue. Misturar invertendo o tubo de duas ou três vezes e deixar repousar durante 45 minutos para permitir a sedimentação de eritrócitos. </li><li> Num tubo de centrífuga de fresco 15 mL cónico colocar 5 ml de Ficoll-Paque. </li><li> Levar o plasma rico em leucócitos que se formou por cima eritrócitos sedimentados, e cuidadosamente pipetar-o em cima do Ficoll-Paque formar uma segunda camada. Certifique-se de duas fases. </li><li> Centrifugar a 516 xg durante 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, a interfase de plasma e de Ficoll-Paque, há uma camada de células mononucleares. Neutrophils estão na parte inferior do tubo. </li><li> Elimine o sobrenadante, romper o pellet celular tocando o tubo contra uma prateleira, e ressuspender as células por adição de 10 ml de frio (4 ° C) Nota PBS:. Ressuspender as células pipetando para cima e para baixo não é recomendada uma vez que este está demasiado prejudiciais para as células. </li><li> Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Quebrar o sedimento de células, como antes e adicionam-se 10 ml de frio (4 ° C) uma solução hipotónica (0,2% de NaCl, 1% de BSA, Hepes 20 mM, pH = 7,4) para lisar os eritrócitos. Misture agitando o tubo suavemente com a mão por exatamente um minuto. </li><li> Adicionar 10 ml de frio (4 ° C) a solução hipertónica (1,6% de NaCl, 1% de BSA, HEPES 20 mM, pH = 7,4), misturar e contar as células utilizando um hemocitómetro (geralmente&gt; 95% são PMN). Nota: Mantenha o tubo com a suspensão de células sobre gelo durante a contagem de células. </li><li> Centrifugar como antes e ressuspender PMN em 107 células / ml em frio (4 ° C) PBS. Manter em gelo. Nota: Os neutrófilos permanecer viável e funcional, a 4 ° C durante cerca de 6 a 8 horas. </li></ol> 2. Ativando PMN <ol><li> Coloque 100 ul de suspensão de PMN (1 x 10 7 células / ml) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Nota: os tubos de amostras deve ser feito pelo menos em duplicata. Habituais controles negativos deve incluir primeiro anticorpo somente, e anticorpo secundário. </li><li> Adicionar o anticorpo para o receptor anti-integrina correspondente ou anti-Fc de anticorpo monoclonal (mAb) a 10 ng / ml e incuba-se em gelo durante 15 min. </li><li> Lavar PMN por adição de 1 ml de frio (4 ° C) PBS, centrifugação a 1743 xg (4500 rpm) numa microcentrífuga, e aspiração do sobrenadante. </li><li> Romper o pellet celular tocando no fundo do tubo contra um rack, adicionar 1 ml de PBS frio, e lavar mais duas vezes como no passo anterior. Nota: Estes lava remover o anticorpo não ligado. </li><li> Ressuspender PMN na mesma (emvolume) mador inicial de água morna (37 ° C) de PBS contendo 60 ug / ml de F (ab &#39;) 2 de cabra anti-IgG de ratinho. Nota: O anticorpo secundário anti-rato IgG que se ligam ao anticorpo anti-receptor da primeira e fará com que a reticulação do receptor. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1 a 20 minutos, dependendo do factor nuclear de interesse. Por min geralmente NF-kB 15, e para Elk-1 geralmente 5 min. Nota: A incubação das células a 37 ° C reticulação do receptor induz, que não pode ter lugar a 4 ° C. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS frio e centrifugar 3 min a 1743 xg em microcentrífuga. </li><li> Remover o sobrenadante </li><li> PMN congelar imediatamente em banho dry-ice/ethanol e mantê-los lá por 10 min. </li></ol> 3. Isolamento e Fixação de Núcleos <ol><li> Ressuspender o pellet congelado PMN em 100 ul de frio (4 ° C) de tampão hipotónico (10 mM HEPES, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, e 1 mM frescamente agregado DL-ditiotreitol [DTT], PH = 7,9). Recomenda-se a levar os tubos fora do banho dry-ice/ethanol um por um, e para limpar a parte inferior do tubo, antes de adicionar o tampão hipotónico. </li><li> Colocar em gelo, e verificar a integridade núcleos por coloração de uma aliquota da suspensão de núcleos com azul de tripano. Núcleos de olhar em volta e azul. PMN intacto não ficam manchadas e os detritos de célula aparece como partículas azuis de forma irregular. Nota: Se a suspensão contém muitos núcleos de células intactas ou fragmentos, é melhor para descartar a preparação e repetir o procedimento com outra amostra. </li><li> Centrifugar a 775 xg núcleos (3000 rpm) em microcentrífuga durante 10 minutos dentro de uma câmara fria. Neste ponto são núcleos de atendimento muito frágeis e devem ser levados em manter as amostras frio e não centrifugação a forças excessivas. </li><li> Remover o sobrenadante por pipetagem muito cuidado. </li><li> Adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio para fixar núcleos. Nota: O sedimento é muito solta umd adicionando o tampão é suficiente para ressuspender os núcleos. Pipetando para cima e para baixo, deve ser evitada. </li><li> Incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Immunolabel núcleos por citometria de fluxo, ou mantê-los durante até 24 horas a 4 ° C. </li></ol> 4. Imunomarcação Núcleos de Análise de Citometria de Fluxo <ol><li> Centrifugar a 1.743 xg núcleos (4500 rpm) em microcentrífuga durante 1 minuto, e remover o sobrenadante por pipetagem suave muito. </li><li> Adicionar 100 ul de frio (4 ° C) 0,1% de Triton X-100, paraformaldeído a 4% em PBS para permeabilizar núcleos. Incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Centrífuga permeabilizadas núcleos em 1743 xg em microcentrífuga e remova cuidadosamente o sobrenadante. Neste ponto, os núcleos aglomerados não atribuem bem na parte inferior do tubo. Recomenda-se a centrifugar de novo se o sedimento se solta. </li><li> Núcleos ressuspender em 500 ul de frio de 4% de soro fetal bovino (FBS) em PBS para bloquear locais de ligação não específicos, e incubar em gelo durante 20 min. Centrifugadornúcleos em 1743 xg durante 3 minutos em microcentrifuga e remover cuidadosamente o sobrenadante. </li><li> Ressuspender núcleos em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 2,5 ng / ml do mAb contra o factor nuclear de interesse. Incubar em gelo durante 20 min. Nota: Usual controlos negativos devem incluir anti-nuclear anticorpo único factor, e FITC marcado com anticorpo secundário apenas. </li><li> Lavar duas vezes com 500 ul de PBS frio com 4% de FBS e centrifugação a 1743 xg durante 3 min. </li><li> Remover o sobrenadante cuidadosamente, núcleos ressuspender em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 10 ng / ml de anticorpo marcado com FITC derivado correspondente, e incubar em gelo durante 20 min. </li><li> Lave os núcleos duas vezes com 500 ul de PBS frio com FBS a 4% como no passo anterior. </li><li> Ressuspender núcleos em 400 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio. Nota: Os núcleos são colocados em paraformaldeído para permitir que a amostra a ser armazenadas durante vários dias sem contaminaçãoproblemas que podem ocorrer na presença de soro. </li><li> Analisar por citometria de fluxo imediatamente ou armazenar no escuro a 4 ° C durante um máximo de três dias. </li></ol> 5. Análise por Citometria de Fluxo <ol><li> Analise núcleos immunolabeled num citómetro de fluxo tal FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) ou aparelho semelhante. </li><li> Ajustar as configurações de aquisição para: FSC no log-balança a 10-1, SSC, log-balança a 196, e núcleos portão em um ponto-enredo. </li><li> Adquirir 10 mil núcleos por amostra. </li><li> Analisar a fluorescência do FITC manchado de núcleos através do canal FL-1 (506 nm), fixado em log-balança a 400. </li></ol>

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<li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).</li>
<li>Garcia-Garcia, E., Rosales, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor+activation+by+Fc%CE%B3R+in+human+peripheral+blood+neutrophils+detected+by+a+novel+flow+cytometry-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method.</a> J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).</li>
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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

O método de purificação descrito aqui permite o isolamento dos neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (avaliada por observação microscópica), num curto período de tempo. Por vezes, os neutrófilos podem ser contaminados por eritrócitos, se este não estiver completamente lisadas. Isso geralmente não afetam a técnica, uma vez que os eritrócitos e PMN pode facilmente ser distinguido como populações de células distintas por citometria de fluxo. PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de re...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico 1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa 2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos 3 fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias 4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório 6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas 5 e a inibição da apoptose 7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e 4 na regulação da sobrevivência celular e apoptose 9-11 em vários tipos de células. As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados ​​em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear 12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos 14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo 15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB 15 e Elk-1 16 factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Heparina </td><td>PiSA (México)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Pharmacosmos A/S (Holbaek, Dinamarca)</td><td>T1-Dextran T500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Pharmacia</td><td>17-0320-01</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Sigma</td><td>A2153</td><td>Fração de Cohn</td></tr><tr><td>V HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio anidro </td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>DL- ditiotreitol (DTT) </td><td>Sigma</td><td>D9163</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (solução a 0,4%)</td> <td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 </td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td> <td>GIBCO</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal IV.3</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td> <td>025-1</td><td>Anticorpo monoclonal anti-FcRII (CD32) </td></tr> específico para humanos <tr><td>3G8</td><td>Medarex (Annandale, NJ)</td><td>028-2</td> Anticorpo monoclonal <td>anti-FcRIII (CD16) </td></tr> específico para humanos <tr><td>TS2/16</td><td>Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)</td><td>Doado pelo Dr. Martin Hemler</td><td>Anti-&#946 específico para humanos; 1 integrina (CD29)</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonal IB4</td><td>Universidade da Califórnia, São Francisco</td><td>Doado pelo Dr. Eric J. Brown</td><td>Anti-&#946 específico para humanos; 2 integrina (CD18)</td></tr><tr><td>F(ab')2 cabra anti-camundongo IgG </td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55468</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 cabra conjugada com FITC IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55522</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2 cabra conjugada com FITC IgG</td><td>Cappel (Aurora, OH)</td><td>55665</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p50</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td><td>sc-114</td><td>Anticorpo policlonal de coelho</td></tr><tr><td>Anti-NF-&#954; B p65</td><td>Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)</td> <td>sc-109</td><td>Anticorpo</td></tr><tr> policlonal de coelho < td colspan = "4 ">EQUIPMENT</td></tr> tubo <tr><td>de centrífuga de 15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>tubo de centrífuga de 50 ml</td><td>Centrífuga de 430291</td><td></td><td></td>Corning</tr><tr><td>, Sorvall Tabletop</td><td>Dupont Instruments</td><td>RT 6000D</td><td></td></tr><tr><td>medidor de</td> <td>pHPipeta Corning</td><td>340</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Pipeta</td><td>Pipetman F123600</td><td></td></tr><tr><td>P-200</td><td>Pipeta Pipetman Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P-1000</td><td>Hemocitômetro</td><td>Gilson F123602</td><td></td></tr><tr><td></td> Microscópio <td>0267110</td><td></td><td>Fisher Scientific</td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse E600</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Incubadora de</td> banho-maria Nikon <td>TMS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>2IS-M</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5414C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)</td><td>FACScalibur</td><td></td></tr></tbody></table>

um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico. Estas células são os primeiros a aparecer nos locais de inflamação e à infecção, tornando-se a primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Os neutrófilos possuem importantes funções antimicrobianas, tais como fagocitose, a libertação de enzimas líticas e produção de espécies reactivas de oxigénio. Em adição às funções de defesa importantes, os neutrófilos realizar outras tarefas, em resposta à infecção, tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Citocinas recrutar outros leucócitos que ajudam a eliminar a infecção, e a inibição da apoptose permite que o neutrófilo de viver mais tempo no local da infecção. Estas funções são reguladas ao nível da transcrição. No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com métodos convencionais de gene repórter já que não há eficientes para técnicas de transfecção de neutrófilos. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar puros a partir de neutrófilos de sangue periférico humano, estimular estas células com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo. O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB e Elk-1 factores nucleares de núcleos a partir de neutrófilos e de outros tipos de células. Assim, este método representa uma opção para a análise de activação de factores de transcrição no núcleo isolado a partir de uma variedade de tipos de células.

O método de purificação descrito aqui fornece geralmente neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (Figura 1A). PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de reticulação específicos com anticorpos monoclonais específicos. Temos estimulado PMN através de receptores Fc e integrinas (Figura 1B). Uma vez estimulado, PMN são lisadas e os núcleos são isolados com rendimentos elevados. Os núcleos são então immunolabeled para um determinado factor nuclear, tais com...

Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue. Os neutrófilos possuem funções transcricionalmente regulados tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Estas funções podem ser estudadas com o método aqui apresentado, o que permite a detecção e quantificação dos factores nucleares por citometria de fluxo em núcleos isolados

Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Este experimento utiliza citometria de fluxo para detectar e quantificar proteínas nucleares em núcleos isolados e marcados imunologicamente a partir de neutrófilos, com o objetivo de purificar os neutrófilos do sangue periférico humano. Remova os glóbulos vermelhos com dextrina, seguido por centrifugação em gradiente de densidade do plasma. Em seguida, utilizando anticorpos anti-receptores, estimule os neutrófilos purificados por meio de integrinas ou receptores Fc.Prossiga com o isolamento dos núcleos e fixe as amostras para imunomarcação com anticorpos específicos contra o fator nuclear NU de interesse. Por exemplo, NF kappa B, e finalmente analise os núcleos por citometria de fluxo para detectar pequenas alterações na ativação do fator nuclear. São obtidos resultados que mostram que a estimulação de neutrófilos por meio de suas integrinas leva a um aumento na concentração nuclear do fator de transcrição N de kappa B. As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são geralmente estudadas por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética em células primárias.Muitas vezes, esses métodos não são adequados. A citometria de fluxo oferece detecção

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um método de quantificação da aderência de neutrófilos é relatado. Este método cria um ambiente dinâmico de fluxo semelhante ao encontrado em um vaso sanguíneo. Ele permite a investigação de adesão de neutrófilos, quer moléculas de adesão purificadas (ligando) ou substrato de células endoteliais (HUVEC) num contexto semelhante ao ambiente in vivo com tensão de cisalhamento.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

São apresentados ensaios de alto rendimento que, em combinação, fornecem excelentes ferramentas para quantificar a liberação de NET de neutrófilos humanos.

High Throughput medição de Extracelular DNA lançamento e Formação NET quantitativa em neutrófilos humanos<em&gt; In Vitro</em

Um método simples e de confiança é descrito aqui para analisar um conjunto de funções das células NK, tais como desgranulação, produção de citocina e quimiocina dentro de diferentes subconjuntos de células NK.

Ensaio de citometria de fluxo baseada para a monitorização das funções das células NK

armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETS) são redes de ADN, histonas e proteínas de neutrófilos. Embora um componente da resposta imunitária inata, redes estão implicados na autoimunidade e trombose. Este protocolo descreve um método simples para o isolamento dos neutrófilos canino e quantificação de redes que utilizam um ensaio de microplaca de fluorescência.

A fluorescência ensaio simples para a quantificação de Canine neutrófilos Extracelular Armadilha lançamento

Este artigo fornece o método detalhado de realização de um teste rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando o isolamento de neutrófilos no chip do sangue total e o teste de quimiotaxia em um único microfluídico.

Um método All-on-chip para análise rápida de quimiotaxis de neutrófilos diretamente de uma gota de sangue

Um método baseado em citometria de fluxo para determinar quantitativamente a atividade citotóxica de células humanas de assassino natural é mostrado aqui.

Um ensaio de citotoxicidade baseados em citometria de fluxo para a avaliação da atividade das células NK humana

Aqui, apresentamos um protocolo para detectar a presença de neutrófilos em seções fixas/permeabilizado histologia e avaliar o estado de ativação de neutrófilos purificados ao vivo. Em particular, o peptídeo de40 MUB vincula lactoferrina presente nos grânulos neutrófilos específicos e terciários. Exposição do conteúdo do grânulo através de permeabilização ou ativação de neutrófilos permite a marcação de neutrófilos.

O peptídeo de40 MUB para uso na detecção de eventos inflamação mediada por neutrófilos

Este protocolo descreve um ensaio de neutrófilos armadilha extracelular (NET) altamente sensível e alta taxa de transferência para a quantificação semi-automático de ex vivo NET formação pela microscopia confocal tridimensional de imunofluorescência. Este protocolo pode ser usado para avaliar a formação de líquido e degradação após estímulos diferentes e pode ser usado para estudar terapias NET-alvo potenciais.

Um ensaio de alta produtividade para avaliar e quantificar a formação de neutrófilos extracelular armadilha

Este protocolo apresenta um conjunto de ensaios funcionais de neutrófilos para ser usado como um método de triagem para cobrir funções de diferentes vias de sinalização. O protocolo inclui uma avaliação inicial e simples da viabilidade celular, pureza, produção de espécies reativas de oxigênio, migração em tempo real, fagocitose e uma sugestão preliminar de armadilhas extracelulares para neutrófilos.

Um conjunto de técnicas de triagem para uma rápida visão geral da função dos neutrófilos

Apresentamos um método automatizado de alto rendimento para quantificar armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) utilizando o sistema de análise de células vivas, juntamente com uma abordagem dual-dye dependente de permeabilidade de membrana.

Técnica de Alto Rendimento em Tempo Real para Quantificar a Formação de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Neutrófilos Humanos

Este protocolo definido descreve uma abordagem de microscopia de alto rendimento em tempo real para visualizar e quantificar a liberação de armadilha extracelular de neutrófilos humanos (NET) in vitro. O método reprodutível permite a investigação das características e cinética da liberação de NET após estimulação com indutores distintos de NETosis e permite a avaliação da farmacologia dos antagonistas da NETosis.

Quantificação microscópica em tempo real e de alto rendimento da liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos humanos e avaliação da farmacologia dos antagonistas

Aprenda a detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo. Este método permite quantificar proteínas nucleares e estudar vias de sinalização em células imunes.

Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

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