Um método simples e eficiente para detectar ativação do fator nuclear em neutrófilos humanos por citometria de fluxo

Este experimento utiliza citometria de fluxo para detectar e quantificar proteínas nucleares em núcleos isolados e marcados imunologicamente a partir de neutrófilos, com o objetivo de purificar os neutrófilos do sangue periférico humano. Remova os glóbulos vermelhos com dextrina, seguido por centrifugação em gradiente de densidade do plasma. Em seguida, utilizando anticorpos anti-receptores, estimule os neutrófilos purificados por meio de integrinas ou receptores Fc.

Prossiga com o isolamento dos núcleos e fixe as amostras para imunomarcação com anticorpos específicos contra o fator nuclear NU de interesse. Por exemplo, NF kappa B, e finalmente analise os núcleos por citometria de fluxo para detectar pequenas alterações na ativação do fator nuclear. São obtidos resultados que mostram que a estimulação de neutrófilos por meio de suas integrinas leva a um aumento na concentração nuclear do fator de transcrição N de kappa B. As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são geralmente estudadas por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética em células primárias.

Muitas vezes, esses métodos não são adequados. A citometria de fluxo oferece detecção e quantificação rápidas de proteínas nucleares em núcleos isolados. Inicie com 10 mililitros de sangue recém-coletado de voluntários adultos saudáveis.

Pipete dois mililitros de solução de dextrina 6% T 500 em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de sangue misturado invertendo o tubo duas ou três vezes e deixe por 45 minutos para sedimentação eritrocitária por gravidade em um tubo cônico de centrífuga de 15 mililitros novo. Coloque cinco mililitros do pacote de fial FI.

Colete o plasma rico em leucócitos que se formou acima dos eritrócitos sedimentados. Cubra cuidadosamente a parte superior do frasco com este plasma para formar duas fases, centrifugue a 516 Gs por 20 minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e rompa o pellet celular batendo o tubo contra o suporte.

Em seguida, ressuspenda as células em 10 mililitros de PBS frio. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de centrífuga de 50 mililitros e centrifugue a 290 Gs durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Desagregue o pellet celular como anteriormente e adicione 10 mililitros de solução hipotônica fria para lisar os eritrócitos.

Agite suavemente o tubo por exatamente um minuto. Em seguida, adicione 10 mililitros da mistura de solução hipertônica fria e armazene no gelo. Agora, enumere as células após o pellet de neutrófilos por centrifugação.

Suspendemos os PMN a 10⁷ células por mililitro. Mantenha as células em gelo em PBS frio. Aliquote 100 microlitros da suspensão de PMN em tubos einor de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione o anticorpo monoclonal correspondente a 10 microgramas por mililitro e incube no gelo por 15 minutos. Para lavar as células, adicione um mililitro de PBS frio, centrifugue e aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda suavemente o pellet celular e lave mais duas vezes com PBS.

Para remover o anticorpo não ligado, re-suspenda os PMN lavados no mesmo volume inicial de PBS quente contendo 60 microgramas por mililitro de IgG anti-go-muse, e incube a 37 graus Celsius por um a 20 minutos, dependendo do fator nuclear de interesse. Agora, adicione um mililitro de PBS frio. Após a centrifugação para obter o pellet celular, remova o sobrenadante e congele imediatamente os pellets celulares em um banho de gelo seco com etanol. Para cada amostra, retire o tubo do banho de gelo seco com etanol, limpe bem e re-suspenda.

Suspenda os pellets congelados de PMN em 100 microlitros de solução hipotônica fria. Coloque todas as amostras em gelo para monitorar a integridade dos núcleos. Contraste uma alíquota da suspensão de núcleos com azul de trian.

Se a suspensão de núcleos contiver muitas células intactas ou detritos, é melhor descartar o preparo e iniciar o procedimento com outra amostra. Após a centrifugação para obter o pellet de núcleos, remova o sobrenadante com muito cuidado, então fixe os núcleos em 100 microlitros de solução fria de paraformaldeído a 4% e incube os núcleos em gelo. Após a centrifugação cuidadosa dos núcleos, remova o sobrenadante e adicione 100 microlitros de tampão de permeabilização frio, incubando as amostras em gelo por 10 minutos.

Em seguida, colete os núcleos permeabilizados por centrifugação. Neste ponto, os pellets de núcleos não aderem bem ao fundo do tubo. Recomenda-se centrifugar novamente.

Se o pellet soltar, para bloquear os sítios de ligação não específicos, suspendemos os núcleos em 500 microlitros de soro bovino fetal a 4% frio em PBS e incubamos no gelo por 20 minutos. Pelotize os núcleos por centrifugação, depois re suspenda os núcleos em 100 microlitros de PBS frio contendo 4% de FBS e 2,5 microgramas por mililitro do anticorpo monoclonal contra o fator nuclear de interesse. Incube as amostras no gelo por 20 minutos; após lavar as amostras duas vezes com 500 microlitros de PBS frio com 4% de FBS, suspendemos os núcleos em 100 microlitros de PBS frio contendo 4% de FBS e 10 microgramas por mililitro do anticorpo secundário correspondente marcado com FZ, incube no gelo por 20 minutos; após duas lavagens, re suspenda os núcleos em 400 microlitros de paraformaldeído a 4% frio em PBS.

Analisar os núcleos imunomarcados em um citômetro de fluxo, como um equipamento tipo FACS Scan ou similar. Ajustar as configurações de aquisição com FSC na escala logarítmica em 10 elevado a menos um, SSC na escala logarítmica em 196 e selecionar os núcleos em um gráfico de dispersão. Adquirir 10.000 núcleos por amostra.

Em seguida, analise a fluorescência das núcleos corados com fitsy através do canal FL1 ajustado na escala logarítmica em 400. Este método de purificação de PMN geralmente fornece neutrófilos não estimulados com uma pureza superior a 95%. Os núcleos de PMN são isolados com altos rendimentos; após o isolamento, os núcleos podem ser facilmente reconhecidos como uma população distinta de PMN intactos no citômetro de fluxo com um dot plot após estimulação. Ao promover a ligação cruzada das integrinas beta1, o NF-kappa B é translocado para o núcleo e este aumento no NF-kappa B nuclear é detectado como um incremento na fluorescência.

Da mesma forma, a estimulação de PMN por meio da ligação cruzada de integrinas beta dois também induz a ativação de NF-kappa B, conforme indicado pelo aumento da fluorescência. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas alterações nos níveis do fator nuclear, como evidenciado pelo fato de que integrinas beta um, que se ligam a proteínas da matriz extracelular como fibronectina, induzem uma ativação mais forte de NF-kappa B do que as integrinas beta dois, que se ligam a moléculas de adesão em outras células. Este método apresenta grande flexibilidade porque podem ser utilizados muitos fluorocromos diferentes e porque permite o preparo de núcleos de diferentes tipos celulares, usando esta abordagem simples e econômica para estudos de transdução de sinal que envolvem alterações nos níveis de proteínas no núcleo de uma variedade de tipos celulares.