Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um modelo de cultura neuronal humana, identificar marcadores neuronais e isolar uma população pura de neurônios para análise de expressão gênica. Isso é conseguido primeiro expandindo as células neuroprogenitoras humanas para criar um suprimento contínuo de células progenitoras. Como segunda etapa, as células neuroprogenitoras são cultivadas na presença de suplementos de diferenciação e fatores de crescimento neurotróficos em placas revestidas com fatores de fixação.

Em seguida, a coloração imunofluorescente para marcadores neuronais é realizada para determinar o destino das células neuroprogenitoras diferenciadas. Finalmente, a microdissecção por captura a laser de neurônios cultivados em lâminas de membrana PEN é realizada para facilitar a análise da expressão gênica específica do neurônio. São obtidos resultados que mostram que as células neuroprogenitoras diferenciadas são predominantemente de natureza neuronal.

Baseado em coloração imunofluorescente e captura de neurônios. Por microdissecção por captura a laser, as células neuroprogenitoras humanas podem ser expandidas e diferenciadas em culturas ricas em neurônios. Para estudos in vitro, como essas culturas possuem algumas células gal, podemos usar micro dissecção de captura a laser para isolar uma população pura de neurônios.

Demonstrando esses procedimentos estará Ron Bouchard, um pesquisador associado sênior em nossas instalações de núcleo de microscópio. Para iniciar este procedimento, reviva um estoque congelado de células neuroprogenitoras humanas isoladas do cérebro fetal, aquecendo-as rapidamente a 37 graus Celsius e, em seguida, adicionando-as a um T 75 contendo 15 mililitros de meio neurobasal pré-aquecido, suplementado com 10 nanogramas por mililitro, EG, F e FGF. Depois de cultivar as células por três dias, transfira as neuroesferas para um tubo de 15 mililitros e pelete-as por centrifugação a 1000 RPM por cinco minutos após a centrifugação, descarte o sobrenadante, deixando para trás cerca de 100 microlitros de meio, e transfira o pellet celular para um tubo einor.

Um pellet de célula de 100 microlitros é suficiente para dividir em dois frascos T 75. Se menos, reduza o número de frascos, pois as células neuroprogenitoras não proliferam. Se divididas finamente, quebre completamente as neuroesferas em uma única suspensão celular, pipetando para cima e para baixo 50 vezes, mantendo a ponta de 200 microlitros contra o fundo do tubo.

Verifique visualmente o progresso usando um microscópio para garantir a dissociação das neuroesferas. Em seguida, dividir a suspensão celular em partes iguais e adicioná-la a dois balões T 75. Um para expansão contínua e outro para diferenciação.

Em seguida, incubar os frascos. Mudar o meio das células neuroprogenitoras no frasco marcado para expansão por centrifugação. Em seguida, descartando o meio antigo e adicionando um novo meio.

Mude o meio a cada quatro a cinco dias até que as neuroesferas atinjam seu tamanho original de 300 a 500 mícrons. Para iniciar a diferenciação de células neuroprogenitoras em uma cultura rica em neurônios, coloque uma única lamínula em cada poço de uma placa de 24 poços e cubra adicionando 500 microlitros de 100 microgramas por mililitro de poli L lisina a cada um. Bem incubar os pratos por 30 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, aspirar a solução de poliol lisina.

Enxágue a placa com água estéril deionizada e aspire novamente. Em seguida, cubra os poços da placa com 500 microlitros de cinco microgramas por mililitro, laminina de camundongo e incube por 30 minutos após a incubação, lave os poços com aspirado de PBS novamente e coloque-os para secar na coifa de cultura de tecidos. Quatro dias após a divisão das células, transfira as pequenas neuroesferas do frasco marcado para diferenciação para a placa revestida de 24 poços.

Adicione uma densidade de cerca de 500 neuroesferas por poço após incubação por seis horas quando as neuroesferas estiverem presas ao prato, remova o meio de proliferação e adicione diferenciação. Meio constituído por meio neurobasal B 27, suplemento N-G-F-B-D-N-F-D-B-C e ácido retinóico. Retorne a placa à incubadora após a cultura de células neuroprogenitoras em meio de diferenciação neuronal por duas semanas, uma cultura rica em neurônios é obtida.

Enxágue os neurônios uma vez em PBS e fixe-os em aldeído paraforme a 4% por 30 minutos. Depois de fixado, enxágue as células três vezes com PBS. Em seguida, prepare as células para a coloração imunológica, incubando-as com tampão permeável à temperatura ambiente por 60 minutos.

Em seguida, adicione anticorpos policlonais e monoclonais em 3% BSA em PBS aos poços. Adicionando um par de anticorpos diferente em cada um, incube-os durante a noite a quatro graus Celsius em uma coqueteleira na manhã seguinte. Lave as lamínulas três vezes com PBS e, em seguida, incube-as com anticorpos secundários anti-coelho P SI três e anti-US fitzy à temperatura ambiente no escuro por 90 minutos após a incubação.

Lave as lamínulas três vezes com PBS. Em seguida, coloque 10 microlitros de meio de montagem em uma lâmina de vidro. Retire a lamínula do prato de cultura e coloque-a de cabeça para baixo no suporte de montagem.

Limpe suavemente qualquer excesso de meio de montagem e sele as bordas com esmalte. Para preparar as células para a microdissecção primeiro, diferencie as células neuroprogenitoras em uma cultura rica em neurônios na membrana PEN. Lâminas revestidas com poli L lisina e laminina.

Execute todas as etapas subsequentes em condições livres de RNA. Em seguida, corar as culturas usando a coloração do gene histo para visualizar as coragens do gene histo das células os núcleos roxos e o citoplasma, um rosa claro, facilitando a diferenciação de neurônios e células gliais por suas morfologias distintas. Coloque a lâmina em etanol a 75% e água estéril deionizada por 30 segundos.

Em seguida, coloque o slide em um lenço umedecido. Adicione 200 microlitros de histogene e aguarde 20 segundos. Em seguida, coloque a lâmina sequencialmente por 30 segundos cada em água estéril deionizada, etanol 75%, etanol 95% e etanol 100%.

Em seguida, coloque no xileno por cinco minutos e seque em um lenço umedecido por cinco minutos. Em seguida, coloque uma lâmina de membrana PEN sobre a lâmina normal e coloque-a no sistema de microdissecação de captura a laser Veritas ou LCM usando o software. Pegue uma imagem de roteiro para encontrar as áreas de populações neuronais puras desprovidas de astrócitos.

Marque esses neurônios usando as ferramentas de desenho. Em seguida, execute a captura a laser dessas áreas usando precisão e automação controladas por computador em um processo de duas etapas. Primeiro, o IR é disparado em vários pontos com uma configuração de potência do laser de 70 miliwatts e um pulso de 2.500 microssegundos para prender a membrana à tampa.

Em seguida, a área marcada é excisada usando uma ferramenta de corte UV em uma configuração de nível baixo de 10 milivolts. A combinação desses processos captura seletivamente as áreas marcadas em tampas macro LCM de captura. Quando um mínimo de 100 neurônios forem capturados, use um microscópio para remover a membrana da tampa e coloque-a em um tubo.

Isole o RNA total de amostras de LCM usando um kit de isolamento de RNA P OPU e trate com DNAs. Em seguida, amplifique o RNA isolado usando o kit de amplificação de RNA de ribo amp seguindo as instruções do kit. Finalmente, realize uma análise RTPC em tempo real usando sondas TAC MAN para detectar a cadeia pesada do neurofilamento humano.

Uma cultura rica em neurônios é obtida pela diferenciação de neuroesferas de quatro dias usando poli L lisina e superfícies revestidas com laminado em combinação com fatores de crescimento específicos de diferenciação. Após duas semanas, uma cultura rica em neurônios mostrada aqui é obtida em áreas de baixa densidade. As células podem se diferenciar em astrócitos como os vistos aqui.

A diferenciação de astrócitos também pode ser direcionada usando o fator de crescimento CNTF em vez daqueles usados para diferenciação de neurônios. A diferenciação de neurônios pode ser identificada usando anticorpos para os marcadores neuronais específicos, novo N e sinapsina, acetilcolinesterase e sinaptofisina e BDNF e GAAP 43 A coloração positiva é uma evidência de que as células diferenciadas têm características de neurônios primários. Além disso, os astrócitos podem ser identificados por meio de estatística positiva três e imunocoloração GAP.

A microdissecção de neurônios por captura a laser é realizada em células que foram diferenciadas em membrana PEN revestida com poli L lisina e laminina As lâminas mostradas aqui são neurônios corados com histo coragem. Para visualizar as células, as células de interesse podem ser delineadas usando um laser, que derrete a membrana PEN, fazendo com que ela grude na tampa de captura colocada acima dela. No final, várias células podem ser delineadas e capturadas na mesma tampa para análise de DNA ou RNA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar neurônios usando microdissecção de captura a laser.