Captura Laser Microdissecção de neurônios a partir de células diferenciadas neuroprogenitoras humanas em cultura

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um modelo de cultura neuronal humana, identificar marcadores neuronais e isolar uma população pura de neurônios para análise de expressão gênica. Isso é alcançado primeiramente expandindo células progenitoras neurais humanas para criar um suprimento contínuo de células progenitoras. Como segundo passo, as células progenitoras neurais são cultivadas na presença de suplementos de diferenciação e fatores neurotróficos de crescimento em placas revestidas com fatores de adesão.

Em seguida, realiza-se a coloração por imunofluorescência para marcadores neuronais a fim de determinar o destino das células progenitoras neurais diferenciadas. Por fim, realiza-se a microdissecção a laser de neurônios cultivados em lâminas com membrana PEN para facilitar a análise específica da expressão gênica neuronal. São obtidos resultados que mostram que as células progenitoras neurais diferenciadas são predominantemente de natureza neuronal.

Com base na coloração por imunofluorescência e no isolamento de neurônios. Por meio da microdissecção a laser, as células progenitoras neurais humanas podem ser expandidas e diferenciadas em culturas ricas em neurônios. Para estudos in vitro, como essas culturas contêm alguns glóbulos, podemos usar a microdissecção a laser para isolar uma população pura de neurônios.

Esses procedimentos serão demonstrados por Ron Bouchard, um pesquisador sênior associado em nossa instalação central de microscopia. Para iniciar este procedimento, reviva uma estirpe congelada de células progenitoras neurais humanas isoladas do cérebro fetal aquecendo-as rapidamente até 37 graus Celsius e, em seguida, adicionando-as a um frasco T75 contendo 15 mililitros de meio neurobasal pré-aquecido, suplementado com 10 nanogramas por mililitro de EGF e FGF. Após cultivar as células por três dias, transfira os neuroesferoides para um tubo de 15 mililitros e faça a centrifugação a 1000 RPM durante cinco minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante, deixando cerca de 100 microlitros de meio, e transfira o pellet celular para um tubo eppendorf.

Um pellet de células de 100 microlitros é suficiente para dividir em dois frascos T 75. Se houver menos, reduza o número de frascos, pois as células progenitoras neurais não conseguem proliferar. Se a divisão for fina, desagregue completamente as neuroesferas em uma suspensão de células simples pipetando para cima e para baixo 50 vezes, mantendo a ponteira de 200 microlitros contra o fundo do tubo.

Verifique visualmente o progresso usando um microscópio para garantir a dissociação dos neuroesferas. Em seguida, divida igualmente a suspensão celular e adicione-a a dois frascos T 75. Um para expansão contínua e outro para diferenciação.

Em seguida, incubar os frascos. Trocar o meio das células progenitoras neurais no frasco marcado para expansão por centrifugação. Em seguida, descartar o meio antigo e adicionar meio novo.

Troque o meio a cada quatro a cinco dias até que as neuroesferas atinjam seu tamanho original de 300 a 500 micrômetros. Para iniciar a diferenciação de células progenitoras neurais em um cultivo rico em neurônios, coloque um único lamínula em cada poço de uma placa de 24 poços e recubra adicionando 500 microlitros de poli-L-lisina a 100 microgramas por mililitro em cada poço. Incube os poços por 30 minutos à temperatura ambiente, em seguida aspire a solução de poli-L-lisina.

Lave a placa com água estéril desionizada e aspire novamente. Em seguida, recubra os poços da placa com 500 microlitros de laminina de camundongo a cinco microgramas por mililitro e incube por 30 minutos; após a incubação, lave os poços com PBS, aspire novamente e deixe-os secar na cabine de cultura de tecidos. Quatro dias após a repicagem das células, transfira os neuroesferas pequenas do frasco identificado para diferenciação para a placa de 24 poços recoberta.

Adicione uma densidade de cerca de 500 neuroesferas por poço após seis horas de incubação, quando as neuroesferas já tiverem aderido à placa. Remova o meio de proliferação e adicione o meio de diferenciação, composto por meio neurobasal, suplemento B27, NGF, BDNF, GDNF e ácido retinóico. Retorne a placa ao incubador. Após o cultivo de células progenitoras neurais em meio de diferenciação neuronal por duas semanas, obtém-se um cultivo rico em neurônios.

Lave os neurônios uma vez com PBS e, em seguida, fixe-os em paraformaldeído 4% por 30 minutos. Após a fixação, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, prepare as células para imunomarcação incubando-as com tampão permeabilizante à temperatura ambiente por 60 minutos.

Em seguida, adicione anticorpos policlonais e monoclonais em 3% BSA em PBS aos poços. Adicionando um par diferente de anticorpos em cada poço, incube-os durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador. Na manhã seguinte, lave as lamínulas três vezes com PBS e, então, incube-as com anticorpos secundários anti-coelho P SI três e anti-US fitzy, à temperatura ambiente e no escuro, por 90 minutos após a incubação.

Lave as lamínulas três vezes com PBS. Em seguida, coloque 10 microlitros de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro. Retire a lamínula da placa de cultura e posicione-a de cabeça para baixo sobre o meio de montagem.

Remova suavemente qualquer meio de montagem em excesso e selar as bordas com esmalte. Para preparar as células para microdissecção, primeiro diferencie células progenitoras neurais em uma cultura rica em neurônios sobre membrana PEN. Lâminas revestidas com poli-L-lisina e laminina.

Realize todos os passos subsequentes em condições livres de RNA. Em seguida, cora as culturas utilizando o corante histo gene para visualizar as células; o corante histo gene cora os núcleos de roxo e o citoplasma de rosa claro, facilitando a diferenciação entre neurônios e células gliais por suas morfologias distintas. Coloque a lâmina em etanol 75% e água estéril desionizada por 30 segundos.

Em seguida, coloque a lâmina sobre uma toalha de papel Kim. Adicione 200 microlitros de histo gene e aguarde 20 segundos. Depois, coloque a lâmina sequencialmente por 30 segundos cada em água estéril desionizada, etanol 75%, etanol 95% e etanol 100%.

Em seguida, coloque em xilol por cinco minutos e seque em um lenço Kim por cinco minutos. Em seguida, coloque um lâmina com membrana PEN sobre a lâmina comum e posicione-as no sistema de microdissecção com captura a laser Veritas ou LCM usando o software. Adquira uma imagem de referência para identificar as áreas com populações neuronais puras, livres de astrócitos.

Marque esses neurônios utilizando as ferramentas de desenho. Em seguida, realize a captura a laser dessas áreas usando precisão e automação controladas por computador em um processo de duas etapas. Primeiro, o infravermelho é disparado em múltiplos pontos com uma configuração de potência do laser de 70 miliwatts e um pulso de 2.500 microssegundos para fixar a membrana à tampa.

Em seguida, a área marcada é ressecada usando uma ferramenta de corte UV em um nível baixo de 10 milivolts. A combinação desses processos capta seletivamente as áreas marcadas nas tampas macro LCM. Quando um mínimo de 100 neurônios tiver sido capturado, utilize um microscópio para remover a membrana da tampa e colocá-la em um tubo.

Isole o RNA total de amostras de MCL usando um kit de isolamento de RNA P OPU e trate com DNAses. Em seguida, amplifique o RNA isolado utilizando um kit de amplificação de RNA por amplificação ribossomal, seguindo as instruções do fabricante. Por fim, realize a análise de R-T-P-C-R em tempo real utilizando sondas TAC MAN para detectar a cadeia pesada do neurofilamento humano.

Um cultivo rico em neurônios é obtido pela diferenciação de neuroesferas com quatro dias de idade, utilizando superfícies revestidas com poli-L-lisina e laminina, em combinação com fatores de crescimento específicos para diferenciação. Após duas semanas, obtém-se um cultivo rico em neurônios, como mostrado aqui, em áreas de baixa densidade. As células podem se diferenciar em astrócitos, como os observados aqui.

A diferenciação de astrócitos também pode ser direcionada utilizando o fator de crescimento CNTF, em vez dos utilizados para diferenciação neuronal. A diferenciação neuronal pode ser identificada por meio de anticorpos contra marcadores neuronais específicos, novo N e sinapsina, acetilcolinesterase e sinaptofisina, e BDNF e GAAP 43. A coloração positiva é evidência de que as células diferenciadas possuem características de neurônios primários. Além disso, astrócitos podem ser identificados por meio de coloração imunológica positiva para stat três e GAP.

A microdissecção a laser por captura de neurônios é realizada em células que foram diferenciadas em lâminas revestidas com poli-L-lisina e laminina. Aqui são mostradas lâminas com membrana PEN contendo neurônios corados com histo corante. Para visualizar as células, as células de interesse podem então ser delimitadas usando um laser, que derrete a membrana PEN, fazendo com que ela adira à tampa de captação posicionada acima. No final, diversas células podem ser delimitadas e capturadas na mesma tampa para análise de DNA ou RNA.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar neurônios utilizando microdissecção a laser.