Captura Laser Microdissection - uma demonstração do Isolamento de Pessoa dopamina Neurônios e região ventral tegmental Entire

O objetivo geral deste procedimento é isolar os neurônios dopaminérgicos de seções de tecido em lâminas. Isso é feito seccionando primeiro o tecido do mesencéfalo ventral congelado em lâminas estilizadas ou lâminas de membrana de caneta. Em seguida, os neurônios dopaminérgicos são marcados com uma imuno-histoquímica fluorescente rápida.

Em seguida, o tecido é desidratado e carregado no microscópio de captura a laser. Em seguida, os neurônios dopaminérgicos marcados são ligados à tampa LCM usando o laser infravermelho e o RNA ou molécula de interesse é isolado. Os resultados demonstram que RNA de quantidade e qualidade suficientes pode ser obtido para medições quantitativas de PCR usando microscopia de captura a laser.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como dissecção macroscópica ou micro perfurações, é que as populações de células individuais podem ser isoladas ou regiões cerebrais muito discretas. Para se preparar para o mergulho de isolamento de RNA, lâminas de preparação de seline ou metilato de polietileno ou lâminas de vidro de membrana de caneta em solução de descontaminação e use água livre de RNAs para lavá-las três vezes usando uma série graduada de etanol livre de RNAs, desidrate as lâminas e seque a vácuo por 30 minutos com um criostato, corte seções de tecido com 10 mícrons de espessura e monte em RNAs preparados. As lâminas livres mantêm as amostras congeladas durante o seccionamento para preservar a qualidade do RNA.

Em seguida, para realizar a imuno-histoquímica. Use uma caneta hidrofóbica para delinear o tecido e deixe-o secar em uma solução de acetona e metanol um-para-um. Fixe o tecido a 20 graus Celsius negativos por 10 minutos Depois de remover o tecido do freezer, cubra as seções com 100 a 200 microlitros de anticorpo tirosina hidroxilase NPBS e 1% tritton por 10 minutos.

Em seguida, use PBS com 1% de tritton para enxaguar as lâminas antes de cobrir as seções com 100 a 200 microlitros de IgG anti-coelho de cabra, rotulado com Alexa Fluor 4 88, incubar por cinco minutos e, em seguida, usar PBS para enxaguar as lâminas duas vezes. Em seguida, desidrate as amostras integradas séries de RNAs de etanol livre por 30 segundos cada, conforme demonstrado anteriormente neste vídeo. Incube em xileno por um minuto e um segundo, lave por cinco minutos.

Remova as lâminas imediatamente antes de usar para LCM e deixe-as secar ao ar. Depois de carregar as tampas LCM e os slides e configurar o sistema LCM de acordo com o protocolo de texto, ajuste e aponte a captura de laser IR para obter força. Coloque a tampa em uma região da lâmina longe do tecido na barra de ferramentas do laser de captura.

Selecione ativar, ajuste o pulso de energia e o número de acertos do laser. Dispare o laser IR quando a tampa estiver sobre uma parte da lâmina sem tecido e verifique se o laser derrete suficientemente a membrana da tampa LCM. Depois de ajustar a intensidade do laser IR, clique com o botão direito e selecione o laser de captura aqui para apontar o laser para realizar LCM em neurônios dopaminérgicos individuais fora das lâminas de preparação do clino.

Comece movendo-se para a região de interesse para capturar as células para capturar células individuais de um lado de preparação do clino. Na barra de ferramentas de microdissecação, selecione a guia LCM e, em seguida, o ícone de ponto único. Em seguida, na barra de ferramentas do microscópio, use a guia do obturador para alternar entre fluorescência e campo claro com as guias de filtros fluorescentes para escolher os filtros apropriados e use as guias de objetivas para alterar a ampliação.

Quando as células de interesse estiverem visíveis na janela de vídeo ao vivo, ajuste o tamanho do ponto usado para marcar as células de interesse para o tamanho aproximado das células. Marque as células de interesse selecionando o ícone de ponto único e clicando nas células. Assim que as células estiverem marcadas na barra de ferramentas de microdissecação, selecione a guia ir cortar e capturar e o laser IR disparará automaticamente em todas as células marcadas selecionadas.

Afaste a tampa da seção e coloque-a em uma região aberta do slide para verificar se as células são capturadas na tampa do LCM. Quando terminar de coletar tecido, mova a tampa clicando com o botão direito do mouse na tampa e selecionando mover para e depois descarregar conforme descrito no protocolo de texto, use o slide processado para imuno-histoquímica como um guia para selecionar a região de interesse do tecido na membrana da caneta. Na barra de ferramentas de microdissecação, selecione a guia de corte e captura, selecione a guia da linha de corte e, usando a lâmina rotulada de imuno-histoquímica como guia, delineie a região de interesse sob a objetiva de 10 x.

Teste, dispare e aponte os lasers IR e UV conforme demonstrado anteriormente. Neste vídeo, na barra de ferramentas de microdissecação, selecione a guia Ir capturar e cortar. Em seguida, mova a tampa LCM para fora do tecido para determinar se o tecido foi removido da seção e prenda à tampa.

Quando terminar de coletar o tecido para remover a tampa, clique com o botão direito do mouse na tampa e selecione mover para descarregar as micrografias nessas figuras demonstram que o LCM é capaz de isolar neurônios dopaminérgicos imunorreativos individuais de tirosina hidroxilase usando o laser IR ou os lasers IR e UV porque o uso mais comum de células em tecidos isolados usando LCM é a análise de RNA. Os procedimentos apresentados foram otimizados para preservar a integridade do RNA, como visto por uma redução relativa na altura do pico RRNA 28 S em comparação com o pico 18 S, a qualidade do RNA foi reduzida em amostras LCM com menor integridade após imuno-histoquímica, seguida de fixação de acetona em comparação com o RNA cerebral inteiro. Para medir a quantidade de RNA obtida de neurônios adquiridos via L-C-M-R-N-A de neurônios dopaminérgicos da área ventral azul-petróleo da preparação salina As lâminas foram isoladas com base na curva padrão gerou um total de 17,3, 24,8 e 50,9 picogramas por microlitro de 5, 100 e 200 neurônios dopaminérgicos, respectivamente.

E usando QPCR para medir a qualidade do RNA, uma faixa de concentrações de RNA cerebral total e RNA dos neurônios dopaminérgicos foram transcritas reversas e o gene beta actina foi medido a partir dessas medições, concentrações de três vírgula 55, 6, 0,82 e 20 vírgula 58 picogramas por microlitro foram calculadas a partir de 5, 100 e 200 neurônios dopaminérgicos, respectivamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o microscópio de captura a laser para isolar neurônios dopaminérgicos individuais ou para isolar regiões de neurônios dopaminérgicos.