Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A Trichoderma reesei Em Plantas de tabaco

O objetivo geral do experimento a seguir é expressar proteínas-alvo transitoriamente no tabaco para ter uma ideia sobre a viabilidade da expressão de enzimas à base de plantas em um curto espaço de tempo. Essa expressão transitória é obtida pela infiltração de folhas de tabaco com uma cepa de agrobacterium tumor fain, que contém um vetor que incorpora o gene de interesse como uma segunda etapa: Após a incubação, as folhas das plantas infiltradas são colhidas e os extratos de proteínas são parcialmente purificados para obter uma solução enzimática funcional. Em seguida, a análise de proteínas é realizada para avaliar os efeitos da expressão vegetal sobre a enzima e verificar sua atividade enzimática.

São obtidos resultados que mostram possíveis efeitos de glicosilação e atividade enzimática do tamanho da proteína com base em ensaios de western blotting, zy e degradação do substrato. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre a conversão de biomassa vegetal e também pode fornecer informações sobre a atividade das enzimas após serem expressas transitoriamente no tabaco. A demonstração visual deste método é crítica, pois as etapas de infiltração são difíceis de aprender devido às folhas serem facilmente danificadas pelas roupas de seringa e eu estarei realizando os experimentos em condições estéreis.

Transferir colónias individuais de agrobacterium toan para um erlenmeyer contendo 10 ml. Caldo de extrato de levedura com antibióticos. Em seguida, incubar o caldo inoculado por 36 a 40 horas a 26 graus Celsius com agitação de 180 RPM, em seguida, inocular 200 microlitros de cada cultura em 20 mililitros de caldo de extrato de levedura com os mesmos antibióticos de antes e incubar nas mesmas condições após 36 a 40 horas.

Induza as culturas com dois microlitros de acetofenona, 100 microlitros de solução de glicose a 40% e 200 microlitros de tampão MES de um molar em pH 5,6 e continue a incubar durante a noite. Agora pegue as plantas da estufa e use uma ponta de pipeta para cortar o lado axial AB da terceira à quinta folha do topo da planta para facilitar a infiltração. Em seguida, encha uma seringa com meio de infiltração e coloque-a em um dos cortes feitos anteriormente.

Apoie a seringa com um dedo no lado da folha axio e injete o meio cuidadosamente na zona intravenosa da folha. Para visualizar a fluorescência nas seções foliares que expressam a célula TR 5:00 AM, a cereja brilha as plantas com uma fonte de luz portátil que emite luz verde. Quando visto através de um filtro vermelho, a fluorescência da célula TR 5:00 AM cereja será claramente visível.

Para extrair as proteínas expressas, selecione as folhas de tabaco que foram infiltradas com AUM contendo a célula P track ERTR cinco A e corte-as em pedaços de um grama. Em seguida, coloque-os em uma argamassa pré-resfriada e adicione uma quantidade adequada de nitrogênio líquido às amostras. Moa as folhas em pó usando um pilão.

Repita o processo com folhas de tabaco não infiltradas para obter amostras de controle. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS contendo um fluoreto milimolar de fenil metil suen à matéria foliar moída e misture até que a maior parte da matéria foliar esteja em suspensão. Centrifugar o extracto a 15 000 GS durante 20 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, rejeitar o sedimento, célula TR cinco A parcialmente purificada, incubando a proteína que contém S natin a 55 graus Celsius durante 10 minutos e deixando-a repousar à temperatura ambiente durante mais 10 minutos. Em seguida, centrifugar um SNAT a 15 000 GS durante 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o pellet e use a proteína contendo snat para todos.

Outros ensaios. Realizar também o processo de purificação parcial para plantas não infiltradas para obtenção de amostras de controle. Neste procedimento, misture etilcelulose e água para obter uma solução a 1,5% e incube com agitação até dissolver.

Para fazer o gel de página ACMCSD, substitua um mililitro de 1,5% CMC por um mililitro de água em uma solução de mistura de gel de página SDS de 10 mililitros e despeje o gel normalmente em seguida, desnature as amostras fervendo-as na presença de SDS. Realize a eletroforese a 200 volts por 50 minutos até que a frente do corante atinja o fundo do gel. Agora execute no redobramento de proteína de gel no ponto 15% CMCSD gel de página.

Usando 1,5% de beta ciclodextrina em tampão de citrato de fosfato 20 milimolar em pH 6,5. Incube o gel nesta solução à temperatura ambiente com agitação suave por 15 minutos. Rejeitar a solução de beta-ciclodextrina e lavar brevemente o gel com água incubada à temperatura ambiente em tampão acetato de sódio a 50 milimolares a pH 4,8 durante mais 15 minutos.

Em seguida, execute o CMC zy usando o gel de página 15% CMCSD de ponto redobrado, incubando o gel em tampão de acetato de sódio a 30 milimolares por 20 minutos a 50 graus Celsius. Para visualizar onde o CMC se degradou, core o gel por 10 minutos usando uma solução de vermelho Congo a 0,1% e detenha-o usando um cloreto de sódio molar por 30 minutos ou até que bandas claras sejam observadas no final, lave o gel com ácido acético a 0,3%. Para obter imagens mais nítidas imediatamente antes de executar o ensaio, prepare uma pipeta de quatro MUC e duas soluções de trabalho em X 100 microlitros de quatro MUC em poços separados de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cada amostra nos poços apropriados, executando cada amostra em triplicata usando um comprimento de onda de excitação de 360 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 465 nanômetros. Determine o ponto de tempo de zero minuto de quatro fluorescências mu por meio de espectroscopia fluorescente. Em seguida, incube as placas cobertas com tampas adesivas a 50 graus Celsius por 20 minutos.

Em seguida, pare a reação congelando. Depois disso, meça a fluorescência mu do ponto final usando os mesmos parâmetros do ponto de tempo de minuto zero. Subtraia o valor de fluorescência em zero minuto do valor de fluorescência em 20 minutos para determinar a mudança na fluorescência causada pela atividade enzimática imediatamente antes da execução do ensaio.

Prepare a solução de trabalho A-O-C-M-C dois X. Em seguida, combine 50 microlitros da amostra e 50 microlitros da solução de trabalho em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, incube as amostras por 20 minutos a 50 graus Celsius.

Pare a reação adicionando 250 microlitros de solução de precipitação. Em seguida, vórtice cada amostra vigorosamente por 10 segundos para garantir a mistura completa da amostra com a solução de precipitação. Em seguida, incubar as amostras à temperatura ambiente durante 10 minutos e voltá-las a vortex antes de as centrifugar a 1000 Gs durante 10 minutos.

Depois disso, transfira 200 microlitros do SNAT de cada amostra para uma placa de 96 poços sem perturbar. A atividade enzimática do pellet é mostrada por níveis mais altos de corante solubilizado. Meça isso usando espectroscopia absorvente em um comprimento de onda de 590 nanômetros.

Nesta etapa. Coloque círculos de papel de filtro em tubos de 1,5 ou dois mililitros. Adicione 100 microlitros de acetato de sódio 60 milimolar e 100 microlitros de amostras aos círculos de papel de filtro e incube por 20 horas a 50 graus Celsius com agitação de 300 RPM.

Além disso, incubar as amostras individuais sem papel de filtro como controlos imediatamente antes de executar o ensaio. Prepare uma solução de trabalho 1,5 x PABA contendo um mililitro de solução de PBA A e nove mililitros de solução de PABA B.Store no gelo até o uso. Em seguida, prepare as amostras em tubos termoestáveis de 0,5 mililitro.

As amostras são compostas por 45 microlitros de água, cinco microlitros de cada solução incubada com papel de filtro e 100 microlitros de solução de trabalho PABA. Depois disso, execute os controles de exemplo e cinco padrões preparados da mesma maneira. Em seguida, incube as amostras, controles e padrões por exatamente 10 minutos a 100 graus Celsius e resfrie em temperatura ambiente por mais 10 minutos.

Pipetar 100 microlitros da solução em uma placa de 96 poços um ensaio com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 410 nanômetros. Subtraia os valores individuais de controle da amostra dos valores da amostra de papel de filtro para determinar a quantidade de açúcares redutores liberados. Aqui está uma imagem mostrando a expressão, bem como a expressão de proteínas em plantas de tabaco.

É assim que uma folha de tabaco infiltrada aparece sob luz normal e sob luz verde com um filtro vermelho, onde a expressão da célula TR 5:00 AM cereja indicada pela cor vermelha é claramente visível aqui. A página SDS gel western lot e CMC zy que mostram o tamanho e a atividade da célula T cinco A. As proteínas solúveis totais foram separadas e podemos visualizá-las com coloração de azul de kumasi Western blotting contra a região hist tag da célula T cinco A confirma o tamanho da proteína e, além disso, a atividade da celulase contra CMC é mostrada por um xenoenxerto corado com vermelho Congo. O que pode ser visto aqui são as proteínas solúveis totais das folhas da planta de tabaco, onde a célula TR cinco A foi expressa transitoriamente antes e depois da purificação por precipitação térmica, onde a célula TR cinco A é a maior banda visível e também é visível no lote oeste e no gráfico CMCs.

Também vemos as proteínas solúveis totais de plantas de tabaco onde a célula T cinco A também não estava após a precipitação térmica e as proteínas de uma mistura comercialmente disponível de tresa celulase. Esta figura mostra a quantificação da atividade enzimática da célula TR cinco A A célula TR cinco A foi incubada com quatro MUC Azo CMC ou papel de filtro, e a degradação do substrato foi medida pela liberação do fluoro quatro quatro mu do corante azo, ou quantificando os açúcares redutores da mudança de cor do PBA Seguindo este procedimento. Outros métodos, como o direcionamento de proteínas, podem ser usados para fornecer informações adicionais sobre como a localização da proteína pode afetar a estabilidade e a atividade da enzima.

Depois de assistir a este vídeo, agora você deve ter uma compreensão clara de como expressar proteínas transitoriamente no tabaco, bem como alguns bons conhecimentos sobre como avaliar a atividade enzimática. Conversão de biomassa de celulose foro.