Expressão da proteína recombinante a partir da celulase Cel5A

O objetivo geral do seguinte experimento é expressar proteínas-alvo de forma transitória em tabaco, a fim de obter uma ideia sobre a viabilidade da expressão enzimática baseada em plantas em um curto espaço de tempo. Essa expressão transitória é obtida por meio da infiltração das folhas de tabaco com uma cepa de *Agrobacterium tumefaciens*, que contém um vetor incorporando o gene de interesse como segundo passo. Após a incubação, as folhas de plantas infiltradas são colhidas e os extratos proteicos são parcialmente purificados para obter uma solução enzimática funcional. Em seguida, é realizada uma análise proteica para avaliar os efeitos da expressão baseada em plantas sobre a enzima e para verificar sua atividade enzimática.

Os resultados obtidos mostram o tamanho da proteína, possíveis efeitos de glicosilação e atividade enzimática com base em ensaios de western blotting, zy e de degradação de substrato. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a conversão de biomassa vegetal e também pode fornecer informações sobre a atividade de enzimas após sua expressão transitória em tabaco. A demonstração visual deste método é essencial, pois os passos de infiltração são difíceis de aprender, devido às folhas serem facilmente danificadas pela seringa, roupas de proteção e eu realizarei os experimentos em condições estéreis.

Transfira colônias individuais de agrobactérias para um frasco erlenmeyer contendo 10 mililitros de caldo extrato de levedura com antibióticos. Incube então o caldo inoculado por 36 a 40 horas a 26 graus Celsius com agitação de 180 RPM. Em seguida, inocule 200 microlitros de cada cultura em 20 mililitros de caldo extrato de levedura com os mesmos antibióticos utilizados anteriormente e incube nas mesmas condições por 36 a 40 horas.

Induza as culturas com dois microlitros de acetofenona, 100 microlitros de solução de glicose a 40% e 200 microlitros de tampão MES um molar em pH 5,6 e continue a incubar durante a noite. Agora, retire as plantas do viveiro e use a ponteira de uma pipeta para fazer um pequeno corte no lado axial AB da terceira à quinta folha a partir do topo da planta para facilitar a infiltração. Em seguida, encha uma seringa com o meio de infiltração e posicione-a em um dos cortes previamente feitos.

Apóie a seringa com um dedo no lado do folíolo e injete cuidadosamente o meio na zona foliar intravenosa. Para visualizar a fluorescência nas secções foliares que expressam TR cell 5:00 AM cherry, ilumine as plantas com uma fonte luminosa portátil que emita luz verde. Quando observada através de um filtro vermelho, a fluorescência proveniente de TR cell 5:00 AM cherry será claramente visível.

Para extrair as proteínas expressas, selecione folhas de tabaco que tenham sido infiltradas com AUM contendo P track ERTR célula cinco A e corte-as em pedaços de um grama. Em seguida, coloque-as em um almofariz previamente resfriado e adicione uma quantidade apropriada de nitrogênio líquido às amostras. Triture as folhas até obter um pó usando um pistilo.

Repita o processo com folhas de tabaco não infiltradas para obter amostras controle. Em seguida, adicione dois mililitros de PBS contendo um milimolar de fenil metil sulfonil fluoreto ao material foliar moído e misture até que a maior parte do material foliar esteja em suspensão. Centrifugue o extrato a 15.000 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, despreze o precipitado, parcialmente purificado TR célula cinco A, incubando o SNAT contendo proteína a 55 graus Celsius por 10 minutos e deixe repousar à temperatura ambiente por mais 10 minutos. Em seguida, centrifugue o SNAT a 15.000 ×g por 10 minutos à temperatura ambiente. Descarte o precipitado e utilize o SNAT contendo proteína para todos.

Ensaios adicionais. Realize também o processo de purificação parcial para plantas não infiltradas, a fim de obter amostras controle. Neste procedimento, misture etilcelulose e água para obter uma solução de 1,5% e incube sob agitação até dissolução.

Para preparar o gel de eletroforese A-C-M-C-S-D-S, substitua um mililitro de CMC 1,5% por um mililitro de água em uma solução mista de gel de eletroforese SDS-PAGE de 10 mililitros e despeje o gel normalmente. Em seguida, desnature as amostras fervendo-as na presença de SDS. Realize a eletroforese a 200 volts durante 50 minutos, até que a frente do corante alcance a base do gel. Agora, realize o refolding de proteínas no gel em um gel de eletroforese C-M-C-S-D-S a 15%.

Utilizando 1,5% de beta ciclodextrina em tampão fosfato-citrato 20 milimolar, pH 6,5. Incube o gel nesta solução à temperatura ambiente com agitação suave durante 15 minutos. Descarte a solução de beta ciclodextrina e lave brevemente o gel com água, seguido por incubação à temperatura ambiente em tampão acetato de sódio 50 milimolar, pH 4,8, por mais 15 minutos.

Em seguida, realize a zimografia de CMC utilizando o gel de eletroforese C-M-C-S-D-S com ponto de reenovelamento, incubando o gel em tampão de acetato de sódio 30 milimolar por 20 minutos a 50 graus Celsius. Para visualizar onde a CMC foi degradada, corar o gel por 10 minutos usando uma solução de vermelho de congolês 0,1% e deter com cloreto de sódio 1 molar por 30 minutos ou até que bandas nítidas sejam observadas; ao final, lavar o gel com ácido acético 0,3%. Para uma imagem mais nítida imediatamente antes da realização do ensaio, preparar uma solução de trabalho 4 MUC duas X e pipetar 100 microlitros da solução de trabalho 4 MUC em poços separados de uma placa de 96 poços.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cada amostra nas respectivas poças, realizando cada amostra em triplicata, utilizando um comprimento de onda de excitação de 360 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 465 nanômetros. Determine o ponto de tempo zero da fluorescência de quatro µ através de espectroscopia fluorescente. A seguir, incube as placas cobertas com tampas adesivas a 50 graus Celsius por 20 minutos.

Posteriormente, interrompa a reação por congelamento. Em seguida, meça a fluorescência final em unidades de fluorescência utilizando os mesmos parâmetros usados para o ponto temporal de zero minuto. Subtraia o valor de fluorescência no minuto zero do valor de fluorescência aos 20 minutos para determinar a variação na fluorescência causada pela atividade enzimática imediatamente antes da realização do ensaio.

Prepare a solução de trabalho A-O-C-M-C dois X. Em seguida, combine 50 microlitros da amostra e 50 microlitros da solução de trabalho em um tubo de 1,5 mililitro. A seguir, incube as amostras por 20 minutos a 50 graus Celsius.

Interrompa a reação adicionando 250 microlitros de solução de precipitação. Em seguida, vortexe cada amostra vigorosamente por 10 segundos para garantir a mistura completa da amostra com a solução de precipitação. Incube então as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos e vortexe-as novamente antes de centrifugá-las a 1000 Gs por 10 minutos.

Em seguida, transfira 200 microlitros do SNAT de cada amostra para uma placa de 96 poços sem perturbar. A atividade enzimática do pellet é indicada por níveis mais altos do corante solubilizado. Meça isso utilizando espectroscopia de absorvência no comprimento de onda de 590 nanômetros.

Nesta etapa, coloque círculos de papel de filtro em tubos de 1,5 ou dois mililitros. Adicione 100 microlitros de acetato de sódio 60 milimolar e 100 microlitros das amostras aos círculos de papel de filtro e incube por 20 horas a 50 graus Celsius com agitação de 300 RPM.

Além disso, incube as amostras individuais sem papel filtro como controles imediatamente antes de realizar o ensaio. Prepare uma solução trabalhadora de PABA 1,5 x contendo um mililitro da solução A de PBA e nove mililitros da solução B de PABA. Mantenha na gelo até o uso. Em seguida, prepare as amostras em tubos térmicos estáveis de 0,5 mililitro.

As amostras são compostas por 45 microlitros de água, cinco microlitros de cada solução incubada com papel filtro e 100 microlitros da solução de trabalho de PABA. Em seguida, analise os controles das amostras e cinco padrões preparados da mesma forma. Incube então as amostras, controles e padrões exatamente por 10 minutos a 100 graus Celsius e resfrie à temperatura ambiente por mais 10 minutos.

Pipete 100 microlitros da solução em uma placa de 96 poços e realize o ensaio com um espectrofotômetro em um comprimento de onda de 410 nanômetros. Subtraia os valores dos controles individuais das amostras dos valores das amostras de papel filtro para determinar a quantidade de açúcares redutores liberados. Abaixo há uma imagem mostrando os cassetes de expressão, bem como a expressão proteica em plantas de tabaco.

É assim que uma folha de tabaco infiltrada aparece sob luz normal e sob luz verde com filtro vermelho, onde a expressão da célula TR 5:00 AM cherry, indicada pela coloração vermelha, é claramente visível aqui. A eletroforese em gel SDS-PAGE, o western blot e o zimograma CMC mostram o tamanho e a atividade da célula T cinco A. As proteínas solúveis totais foram separadas e podemos visualizá-las por coloração com azul de Comassie; o western blot contra a região com marcação de histidina da célula T cinco A confirma o tamanho da proteína, e adicionalmente a atividade de celulase contra CMC é demonstrada por um zimograma corado com vermelho de Congo. O que pode ser observado aqui são as proteínas solúveis totais extraídas das folhas da planta de tabaco onde a célula TR cinco A foi expressa de forma transitória, antes e após a purificação por precipitação térmica, na qual a célula TR cinco A é a banda mais intensa visível e também é detectável no western blot e no zimograma CMC.

Também observamos as proteínas solúveis totais de plantas de tabaco nas quais a Tcell cinco A não foi submetida à precipitação térmica, bem como as proteínas de uma mistura comercialmente disponível de celulase tresa. Esta figura mostra a quantificação da atividade enzimática da TR cell cinco A: a TR cell cinco A foi incubada com quatro MUC Azo CMC ou papel filtro, e a degradação do substrato foi medida pela liberação do corante azo fluoro quatro quatro mu, ou pela quantificação dos açúcares redutores provenientes da mudança de cor do PBA, seguindo este procedimento. Outros métodos, como o direcionamento proteico, podem ser utilizados para fornecer informações adicionais sobre como a localização da proteína pode afetar a estabilidade e a atividade enzimática.

Depois de assistir a este vídeo, você agora deverá ter uma compreensão clara de como expressar temporariamente proteínas no tabaco, bem como um bom conhecimento sobre como avaliar a atividade enzimática. Para a conversão da biomassa de celulose.