Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

O objetivo geral deste procedimento é determinar a afinidade de ligação entre uma proteína e um ligante sem purificar a proteína a partir de um lisado celular. Isso é realizado primeiramente expressando a proteína de interesse fundida à GFP em qualquer linhagem celular aderente. Após a preparação do lisado celular e das diluições do ligante, são preparadas misturas de lisado celular e ligante, que são então carregadas em capilares.

Em seguida, mede-se a termorresistência da proteína fusionada com GFP na presença de concentrações variáveis de ligante. O passo final é a análise dos dados de termoforese em microescala ou medições de MST. Em última instância, a termorresistência em microescala é utilizada para determinar as afinidades de ligação das interações entre proteínas fusionadas com GFP e diversos ligantes.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como titulação, calorimetria ou ressonância de plasmones de superfície, é que ela evita a purificação de proteínas, simplificando e acelerando significativamente a caracterização quantitativa de interações binárias. Este método apresenta vantagens significativas ao se trabalhar com proteínas difíceis de expressar e purificar, como proteínas de membrana e fatores de transcrição. Uma das maiores vantagens da termoforese em microescala é que ela funciona em uma variedade de tampões e tolera a presença de detergentes e micelas no sistema. Demonstrará a técnica Karen Stefka, bióloga do meu laboratório. Para começar, lave as células brevemente com solução salina tamponada com fosfato gelada, ou PBS, utilizando 10 mililitros de tampão por frasco T 75.

Mantenha as células no gelo por cinco minutos ou até que comecem a se desprender do frasco. Raspe as células com a espátula celular para promover a dessociação, se necessário. Re suspenda as células em 10 mililitros de PBS gelado e transfira para um tubo de centrífuga cônico de 14 mililitros pré-resfriado.

Centrifugue as células a 400 a 600 Gs e quatro graus Celsius durante cinco minutos para formar o pellet. Remova o sobrenadante e re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lise gelado. Transfira a suspensão para um tubo einor de 1,5 mililitro previamente resfriado para extração de proteínas citosólicas.

Coloque as células no gelo para minimizar o superaquecimento local e lisar as células com três pulsos de dez segundos de sonicação a 30% de amplitude. Utilizando uma ponteira pré-resfriada de dois a três milímetros, mantenha a ponteira abaixo da superfície para minimizar a formação de espuma. Omita este passo ao usar tampão contendo detergente e incube no gelo por 30 minutos.

Em vez disso, corrija a solução de lisado para conter uma concentração fisiológica de cloreto de sódio de 100 milimolar, se necessário, a partir de uma solução estoque de cinco molar de cloreto de sódio. Por fim, recolha os lisados por centrifugação a aproximadamente 25.000 ×g e quatro graus Celsius durante 10 minutos. Selecione a fonte de excitação por diodo emissor de luz ou LED com comprimento de onda igual a 470 nanômetros no instrumento de MST.

Carregue os capilares com extrato celular diluído duas e dez vezes com tampão MST e coloque-os no instrumento MST. Realize a operação de localização dos capilares no software de controle do instrumento MST. A faixa de fluorescência ideal no lisado diluído é de 400 a 1500 unidades de fluorescência.

Prossiga para determinar a faixa de concentração ótima do ligante conforme descrito no protocolo textual. Coloque uma grade de tubos com o número necessário de tubos de centrífuga de baixa ligação de 0,5 mililitro sobre gelo e pipete 25 microlitros de tampão MST no fundo de cada tubo, adicionando 25 microlitros da solução estoque do ligante ao primeiro tubo e realizando uma diluição seriada em duas dobras do ligante utilizando os demais tubos. Mantenha a grade com as amostras de ligante sobre gelo.

Calcule a diluição do lisado celular para obter o nível ideal da proteína-alvo fluorescente nas reações de ligação. A concentração final de proteína deve ser próxima da constante de dissociação esperada para a ligação ou inferior, e deve ser ajustada para alcançar o número necessário de contagens de fluorescência. Na solução final, prossiga com a diluição do lisado celular com Tampão MST.

Coloque tubos de baixa ligação de 0,5 mililitro na grade de tubos, posicionados em frente aos tubos com amostras de diluição seriada do ligante. Adicione cuidadosamente 15 microlitros do lisado celular no fundo de cada tubo. Evite tocar as paredes dos tubos para prevenir perda da amostra.

Adicione 15 microlitros da amostra do ligante com a maior concentração ao tubo correspondente. Número um, com o lisado celular. Misture bem e troque a ponteira da pipeta.

Repita este passo com os demais tubos, exceto o último, que não deve conter ligante. Adicione 15 microlitros de tampão MST ao último tubo e homogeneíze. Encha aproximadamente dois terços da primeira capilar com a mistura de ligação do tubo número um.

Incline-o para mover a solução em direção ao centro e coloque o capilar na bandeja de capilares na posição número um; repita este passo com os demais capilares. As extremidades dos capilares podem ser tampadas com cera para experimentos mais longos.

Coloque a bandeja dentro do instrumento MST e feche a porta do instrumento. Em seguida, selecione a fonte de excitação LED com comprimento de onda igual a 470 nanômetros. No instrumento MST, execute o comando encontrar capilares para permitir que o instrumento localize as posições exatas dos capilares e meça a fluorescência das amostras com base na intensidade do sinal fluorescente.

Ajuste a potência do LED para levá-la ao intervalo de 400 a 1500 unidades. Clique no botão iniciar para realizar o Experimento de Resistência Térmica. Mais de uma potência de laser infravermelho pode ser escolhida para o experimento.

Para encontrar o gradiente de temperatura ideal para o sistema específico, leva de 10 a 12 minutos para executar um conjunto de 16 capilares. Colete dados de duas a três execuções para o mesmo conjunto de capilares para garantir a reprodutibilidade das medições. Para iniciar a análise dos dados, abra o software de análise e carregue a pasta do projeto.

No visualizador de execução de informações exibido, selecione as curvas termorreticas coletadas em uma potência específica do laser de IR. Havia a opção de abrir todos os traçados termorreticos coletados sob diversas condições de uma vez, e depois escolher quaisquer curvas para análise ativando ou desativando-as. Na janela do gráfico de pontos de avaliação, selecione a termorresistência ou termoforese com as linhas azul e vermelha de salto de T.

Defina duas regiões das curvas experimentais que são selecionadas manualmente para a análise pelo software. Certifique-se de que as linhas azul e vermelha estejam posicionadas corretamente para proporcionar a maior variação na Resistência Térmica. Para obter os pontos médios com desvios padrão, selecione usar média ou diferenciar execuções para execuções separadas.

Para traçar um ajuste da constante de dissociação, selecione usar média, insira e fixe o valor da concentração da molécula marcada e ajuste a curva. A constante de dissociação de ligação ou valor de KD com seu desvio padrão aparecerá em uma janela pop-up separada de informações. Salve os dados do ajuste médio em um arquivo de texto e transfira para o Excel.Heck.

Células 293 expressando STAT3-GFP foram utilizadas como fonte de stat três fluorescentemente marcado. Para um ensaio de ligação ao DNA, a ligação de oligonucleotídeos altamente carregados resultou em mudanças significativas na mobilidade do STAT três. No gradiente de temperatura.

O sinal térmico é representado em função da concentração do oligonucleotídeo. Cada ponto de dados representa a média de três medições. O software de análise temporal nano foi utilizado para ajustar os dados e determinar os valores aparentes de KD.

As constantes aparentes de dissociação foram de 37,9 ± 1,0 micromolar para a ligação ao motivo gas e de 23,3 ± 0,6 micromolar para a ligação ao oligonucleotídeo rico em A-T s mais 100. Surpreendentemente, as sequências s mais 100 exibiram ligação ligeiramente mais forte do que gas. Em três repetições das medições, a substituição de A por G resultou em uma diminuição acentuada na afinidade do mutante s mais 100 um.

Embora o mutante s mais 100 dois não tenha mostrado ligação detectável, confirmando assim a ligação seletiva de sequência do STAT três ao s mais 100. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de duas horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as condições ideais para extração de proteínas de membrana diferirão para diferentes proteínas e geralmente exigem otimização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar a afinidade de ligação de uma proteína a um elemento sem precisar purificar a proteína do lisado celular.