Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

O objetivo geral deste procedimento é determinar a afinidade de ligação de uma interação de ligante de proteína sem purificar a proteína de um lisado celular. Isso é feito expressando primeiro a proteína fundida GFP de interesse em qualquer linha celular aderente. Após a preparação do lisado celular e das diluições dos ligantes, as misturas de ligantes do lisado celular são preparadas e carregadas nos capilares.

Em seguida, a termorresina da proteína fundida com GFP na presença de concentrações variáveis de ligantes é medida. A etapa final é a análise de dados de medições de termoférese em microescala ou MST. Em última análise, a terresina em microescala é usada para determinar as afinidades de ligação das interações entre proteínas fundidas com GFP e vários ligantes.

A principal vantagem desta técnica de métodos existentes como titulação, calorimetria ou mono carbonização de plasma de superfície, é que ela evita a purificação de proteínas, simplificando e acelerando significativamente a caracterização quantitativa de interações binárias. Este método apresenta vantagens significativas ao trabalhar com proteínas difíceis de expressar e purificar, como proteínas de membrana e fatores de transcrição. Uma das maiores vantagens da termoférese em microescala é que ela funciona em uma variedade de tampões e tolera a presença de detergentes e minhas células no sistema Demonstrando a técnica estará Karen Stefka, uma bióloga do meu laboratório Para começar, lave as células brevemente com solução salina tamponada com fosfato gelado ou PBS usando 10 mililitros de tampão por frasco T 75.

Mantenha as células no gelo por cinco minutos ou até que comecem a se desprender do frasco. Raspe as células com o raspador de células para desconectar, se necessário. Suspenda novamente as células em 10 mililitros de PBS gelado e transfira para um tubo de centrífuga de fundo redondo de 14 mililitros pré-resfriado.

Pulverizar as células por centrifugação a 400 a 600 Gs e quatro graus Celsius durante cinco minutos. Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de lise gelada. Transferir a suspensão para um tubo einor de 1,5 mililitros pré-refrigerado para extracção de proteínas citosólicas.

Coloque as células no gelo para minimizar o superaquecimento local e ligue as células com três vezes dez segundos de pulsos de sonicação a 30% de amplitude. Usando uma ponta de pré-resfriamento de dois a três milímetros, mantenha a ponta abaixo da superfície para minimizar a formação de espuma. Omita esta etapa ao usar detergente contendo tampão e incube no gelo por 30 minutos.

Em vez disso, corrija a solução lisada para conter uma concentração fisiológica de sal de cloreto de sódio 100 milimolar, se necessário, a partir de uma solução-mãe de cloreto de sódio a cinco molares. Finalmente, colete os lisados por centrifugação a cerca de 25.000 Gs e quatro graus Celsius por 10 minutos. Selecione o diodo emissor de luz ou a fonte de excitação do LED com comprimento de onda igual a 470 nanômetros no instrumento MST.

Carregue os capilares com extrato celular diluído duas e 10 vezes com tampão MST e coloque-os no instrumento MST. Execute a operação de localização de capilares no software de controle do instrumento MST. A faixa de fluorescência ideal no lisado diluído é de 400 a 1500 unidades de fluorescência.

Prossiga para determinar a faixa de concentração ideal do ligante, conforme descrito no protocolo de texto. Coloque um rack de tubos com o número necessário de tubos de centrífuga de baixa ligação de 0,5 mililitro em pipeta de gelo 25 microlitros de tampão MST no fundo de cada tubo a 25 microlitros da solução estoque de ligante para o primeiro tubo e execute a diluição dupla em série do ligante usando o resto dos tubos. Mantenha o rack com amostras de ligante no gelo.

Calcule a diluição do lisado celular para produzir o nível ideal da proteína-alvo fluorescente nas reações de ligação. A concentração final de proteína deve estar próxima da constante de dissociação de ligação esperada ou inferior e deve ser ajustada para obter o número necessário de contagens de fluorescência. Na solução final, prossiga para diluir o lisado celular com MST Buffer.

Coloque tubos de baixa ligação de 0,5 mililitro no suporte de tubos em frente aos tubos com amostras de diluição serial de ligante. Adicione cuidadosamente 15 microlitros do lisado celular ao fundo de cada tubo. Tente não tocar nas paredes do tubo para evitar a perda de amostra.

Adicione 15 microlitros da amostra de ligante com a maior concentração ao tubo correspondente. Número um, com o lisado celular. Misture bem e troque a ponta da pipeta.

Repita esta etapa com o restante dos tubos, exceto o último, que não deve conter ligante. Adicione 15 microlitros de tampão MST ao último tubo e misture. Encha aproximadamente dois terços do primeiro capilar com a mistura de ligação do tubo número um.

Incline-o para mover a solução em direção ao centro e coloque o capilar na bandeja capilar para a posição. Número um, repita esta etapa com o resto dos capilares. As extremidades capilares podem ser tampadas com cera para experimentos mais longos.

Coloque a bandeja dentro do instrumento MST e feche a porta do instrumento. Em seguida, selecione a fonte de excitação do LED com comprimento de onda igual a 470 nanômetros. No instrumento MST, execute o comando localizar capilares para permitir que o instrumento encontre as posições exatas dos capilares e meça a fluorescência das amostras com base na intensidade do sinal fluorescente.

Ajuste a potência do LED para colocá-lo no intervalo de 400 a 1500 unidades. Clique no botão Iniciar para realizar o Experimento de Thermo Resis. Mais de uma potência de laser infravermelho pode ser escolhida para o experimento.

Para encontrar o gradiente de temperatura ideal para o sistema específico, leva de 10 a 12 minutos para executar um conjunto de 16 capilares. Colete dados de duas a três execuções para o mesmo conjunto de capilares para garantir a reprodutibilidade das medições. Para iniciar a análise de dados, abra o software de análise e carregue a pasta do projeto.

Nas informações exibidas, execute a seleção do visualizador coletada em uma curva térmica de potência de laser IR específica. Havia a opção de abrir todos os traços termirreticos coletados sob várias condições de uma só vez e, em seguida, escolher quaisquer curvas para análise, ligando-as e desligando-as. Na janela do gráfico de pontos de avaliação, selecione a termorresina ou termoférese com T salte linhas azuis e vermelhas.

Defina duas regiões das curvas experimentais que são selecionadas manualmente para a análise pelo software. Certifique-se de que as linhas azul e vermelha estejam posicionadas corretamente para fornecer a mudança máxima no Thermo Resis. Para obter a média de pontos com desvios padrão, selecione usar média ou distinguir ensaios para ensaios separados.

Para plotar um ajuste constante de dissociação, selecione usar média, insira e fixe o valor da concentração da molécula rotulada e ajuste a curva. A constante de dissociação de ligação ou valor KD com seu desvio padrão aparece em uma janela pop-up de informações separada. Salve os dados de ajuste médio em um arquivo de texto e transfira para Excel.Heck.

2 9 3 células expressando STAT 3G FP foram usadas como fonte de stat três marcado com fluorescência. Para um ensaio de ligação ao DNA, a ligação de oligonucleotídeos altamente carregados resultou em mudanças significativas na mobilidade do STAT três. No gradiente de temperatura.

O sinal termo-retórico é representado graficamente em função da concentração de oligonucleotídeos. Cada ponto de dados representa a média de três medições. O software de análise nanotemporal foi usado para ajustar e determinar os valores aparentes de KD.

As constantes de dissociação aparentes foram 37,9 mais ou menos 1,0 micromolar para ligação ao motivo gasoso, e 23,3 mais ou menos 0,6 micromolar para ligação ao oligonucleotídeo rico em s mais 100. Surpreendentemente, as sequências s mais 100 exibiram uma ligação ligeiramente mais forte do que o gás. Em três repetições de medição, a substituição de A por G resultou em uma diminuição dramática na afinidade do mutante s mais 100.

Enquanto o s mais 100 mutante dois não mostrou ligação detectável, confirmando assim a ligação seletiva de sequência de STAT três a s mais 100 Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de duas horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as condições ideais para a extração de proteínas de membrana serão diferentes para diferentes proteínas e geralmente requerem otimização. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar a afinidade de ligação de uma proteína a uma elegante sem purificar a proteína da célula. Lisado.