Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

O objetivo geral deste procedimento é estimar a constante de dissociação para uma interação de ligante de proteína. Isso é feito preparando primeiro misturas da proteína com diferentes concentrações do ligante junto com um corante indicador. O segundo passo é aquecer essas amostras enquanto registra a fluorescência do indicador para monitorar o desdobramento da proteína.

Em seguida, as curvas de desdobramento da proteína são convertidas em uma série de temperaturas de fusão. A etapa final é ajustar esses dados a um modelo apropriado para estimar a constante de dissociação. Em última análise, a fluorometria de varredura diferencial é usada para entender melhor a interação de uma proteína com seus ligantes.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como isotermia, titulação, calorimetria e ressonância de plasma de superfície, é que esse método pode ser concluído em poucas horas usando apenas quantidades moderadas de amostra em um instrumento que já está disponível na maioria dos institutos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da química de proteínas, como a afinidade dos ligantes pelas proteínas e a força relativa das interações. Geralmente, os indivíduos novos nesse método teriam dificuldades porque a escolha das amostras a serem usadas e a análise dos dados podem ser difíceis.

Antes de iniciar este procedimento, prepare as seguintes soluções. Uma mistura contendo os reagentes descritos neste quadro e as existências do ligante de interesse na concentração mais elevada disponível, bem como seis diluições dez vezes desta concentração. Se uma constante de dissociação aproximada for conhecida a partir de dados anteriores, preparar pelo menos duas concentrações acima e abaixo do kd.

Uma tabela de exemplo é mostrada aqui. Alíquota de 18 microlitros da mistura em cada um dos oito poços. Na placa A-Q-P-C-R, adicione dois microlitros de solvente ao primeiro poço para cada um dos sete poços restantes, adicione dois microlitros de cada membro da série de diluição do ligante.

Coloque a vedação A-Q-P-C-R sobre a placa para obter uma boa vedação da placa. Coloque um aplicador manual no meio da placa, alise a vedação para um lado e repita na outra metade da placa. Centrifugue a placa a 500 vezes G por dois minutos para remover as bolhas de ar.

Em seguida, coloque a placa em um instrumento QPCR da etapa um. Selecione a opção de curva de fusão dos filtros de rochas e escolha a velocidade de rampa rápida. Execute uma desnaturação térmica na conclusão da execução do instrumento.

Clique no botão analisar na tela. Salve o arquivo de resultado. Abra o software de mudança térmica de proteína.

Crie um novo estudo na guia de propriedades. Dê um nome a ele e, na guia de condições, detalhe os ligantes. Vá para a guia de arquivos de experimento e importe o arquivo de resultados salvo.

Defina o conteúdo de cada um. Bem, vá para a guia de análise e pressione o botão analisar para analisar os resultados. Verificar se a proteína na presença de solvente por si só dá um resultado semelhante ao indicado nesta figura.

Em seguida, examine as temperaturas de fusão observadas nos resultados da dor replicada. Certifique-se de que isso mostre um aumento claro na temperatura de fusão com o aumento da concentração de ligantes. Esses dados serão usados para fornecer um valor aproximado para a constante de dissociação, conforme descrito no artigo anexo.

Estas soluções são necessárias para o procedimento de determinação da constante de dissociação, uma mistura mestra conforme detalhado neste quadro e stocks do ligante em 15 concentrações diferentes, que serão diluídas dez vezes. No experimento final. Idealmente, inclua as concentrações de ligantes, pelo menos duas ordens de magnitude acima e abaixo do kd estimado, e centralize as concentrações no kd estimado.

Um exemplo de série de diluição é mostrado aqui. Concentre-se em sete dos pontos dentro de uma ordem de magnitude do KD estimado com outros quatro pontos de cada lado disso. Se houver uma escolha, inclua mais pontos em valores que estão saturando.

Adicione 120 microlitros da mistura principal a cada um dos oito poços em uma placa de 96 poços com fundo em U para atuar como um reservatório para distribuição conveniente da mistura principal. Em seguida, use uma pipeta de oito canais para dispensar 18 microlitros da mistura principal em uma coluna de uma placa de PCR. Repita por mais cinco colunas para dar um total de 48 poços preenchidos em um padrão de seis por oito na placa.

Em seguida, adicione 20 microlitros dos talos do ligante ou do solvente a cada um dos oito poços. Em outra placa de 96 poços com fundo em U Usando uma pipeta de oito canais, aspire dois microlitros de oito estoques ou solventes de ligantes diferentes e adicione-os a uma coluna da placa de PCR que foi preenchida com a mistura principal. Repita com os mesmos oito ligantes ou estoques de solvente.

Para mais duas colunas, aspirar dois microlitros dos oito estoques de ligantes ou solventes restantes e adicioná-los a uma quarta coluna na placa. Repita isso para mais duas colunas. Isso dará amostras triplicadas para todas as 16 amostras de ligantes e solventes.

Coloque a vedação A-Q-P-C-R sobre a placa. Centrifugar a placa a 500 vezes G durante dois minutos. Coloque a placa no instrumento QPCR e execute uma desnaturação térmica usando os parâmetros especificados anteriormente na conclusão da execução do instrumento.

Clique no botão analisar na tela. Salve o arquivo de resultado. Abra o software de mudança térmica de proteína.

Crie um novo estudo na guia de propriedades. Dê um nome a isso e, na guia de condições, detalhe os ligantes. Vá para a guia de arquivos de experimento, importe o arquivo de resultados salvos e defina o conteúdo de cada um.

Bem, vá para a guia de análise e pressione o botão analisar. Escolha a guia replicates no menu do lado esquerdo da tela para mostrar os resultados. Como triplicados.

Avalie a confiabilidade dos dados com base em quão apertados são os triplicados. Os triplicados devem apresentar baixa reprodutibilidade. Examine os dados brutos de perto.

Analise os dados usando os métodos boltman ou derivativo. Para avaliar a temperatura de fusão, selecione a guia replicar resultados e, no gráfico replicar resultados, alterne o gráfico por botão entre tm, boltzmann e TM derivado. Selecione o método que dá a maior reprodutibilidade para a amostra.

Para amostras que mostram várias transições, quase sempre é melhor usar o método derivado no modo de fusão múltipla. Exporte os resultados para uma investigação mais aprofundada com o Excel usando a guia de exportação. Comece esta análise criando uma tabela no Excel das concentrações de ligantes e da temperatura de fusão.

Abra o software de prisma GraphPad e crie uma tabela XY. Insira os dados usando a coluna X para as concentrações de ligante e a coluna Y para os resultados da temperatura de fusão. Na guia de análise, selecione a opção de ajuste da curva de regressão não linear.

Para inserir o modelo correto, selecione novo e crie uma nova equação. Insira a equação apropriada como ligação de ligante de sítio único. Selecione a caixa regras para valores iniciais e insira regras para valores iniciais.

Restrinja o parâmetro P como constante igual a entrar na concentração final de proteína. Selecione analisar para executar a análise, análise adicional para ajustar dados a um modelo cooperativo ou para ajustar dados a curvas. Mostrando mudanças binárias na temperatura de fusão são descritas no texto do protocolo que acompanha.

Este método foi usado para medir a interação da hexoquinase com a glicose. Uma triagem inicial sugere uma provável DK de 0.2 a 1.7 milimolar. Os resultados de uma tela maior mostram um bom ajuste ao modelo para um único evento de ligação com um KD de 1,2 mais ou menos 0,1 milimolar, o putativo HETO SQUA L transferase WCBM mostra uma forte mudança térmica na ligação ao GTP.

Uma triagem inicial sugeriu um DK de 200 a 500 micromolares. Um experimento detalhado sugere um DK aparente de 120 mais ou menos 20 micromolares. No entanto, quando uma escala logarítmica é usada para o eixo X, há uma discrepância significativa entre o modelo e a análise de dados dos mesmos dados com um modelo cooperativo mostra um excelente ajuste aos dados, o que implica que o WCBM é anticooperativo em sua ligação ao GTPA um resultado bastante incomum é observado com o PIB putativo 60, oxy Beta D mano, Heur dois oh, ACE WCBI.

Sem ligante, e em altas concentrações de ligante, observa-se um padrão de fusão monofásico simples. No entanto, em concentrações intermediárias de ligantes, dois picos de fusão distintos são observados. A transição entre os dois conjuntos de picos depende da dose em toda a gama de modelagem de concentrações da fusão bifásica.

Como a soma de uma proporção do ligante, os resultados de ligantes livres e altos fornecem um bom ajuste aos dados. Esse ajuste é melhorado extrapolando o resultado observado para alta concentração de ligantes para ocupação total. Os dados obtidos para a proporção de WCBI ligado ao ligante mostram um excelente ajuste a um modelo de ligação simples.

Com um KD de 58 mais ou menos dois micromolares Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita em quatro ou cinco horas, incluindo repetições se for realizada corretamente Após este procedimento. Outros métodos, como fluorescência de veias tiptop e calorimetria de titulação isotérmica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como dependência de temperatura e geometria STA. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como determinar uma estimativa para a constante de dissociação de uma interação usando a gripe de varredura diferencial.