Name: Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Aprenda a passivar superfícies de vidro com polietilenoglicol em duas etapas para microscopia de fluorescência de molécula única. Este protocolo reduz a ligação não específica e melhora a qualidade da imagem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SDC, ACH, e CJ foram apoiados por Começando Grants (ERC-STG-2012-309509), através do Conselho Europeu de Investigação. J.-MN foi apoiado pela Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) (2011-0018198) da Coreia; e do Programa Centro de Pesquisa Pioneer (2012-009586) através do NRF da Coréia financiado pelo Ministério da Ciência, TIC, e Planejamento Futuro (MSIP). Este trabalho também foi apoiado pelo Centro de Saúde BioNano-Guard financiado pela MSIP da Coréia como o Projeto Frontier Global (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL e J.-HH foram apoiados pelo Programa de Ciência da cidade de Seul, Coréia do Fellowship Seul. A proteína Rep rotulado foi uma generosa oferta do Dr. Suá Myong.

1. Deslize Preparação e Limpeza Uma câmara de microfluidos é composta por uma lâmina de quartzo e uma lamela. No tipo de prisma de reflexão interna total microscopia de fluorescência (TIRF), a superfície da lâmina de quartzo é fotografada. Portanto, é importante limpar uma lâmina de quartzo, cuidadosamente, com H 2 O, acetona, KOH, e soluções piranha. Th é de limpeza de multi-passo elimina moléculas orgânicas fluorescentes sobre uma superfície, que interferem com as medições de fluorescência de moléculas isoladas. Além disso, a gravura piranha torna a superfície hidrófila de quartzo através da geração de grupos hidroxilo. Os grupos hidroxilo livres são essenciais para a reacção de amino-silanização no Passo 3. <ol><li> Lâminas de perfuração de quartzo. Faça um par de buracos em um slide de quartzo com um bit 3/4 mm de perfuração de diamante (Figura 2a). Se vários canais são desejados, perfurar mais pairs dos orifícios (Figura 2b). Estes orifícios são usados ​​para a injecção de soluções para uma câmara de microfluidos no Passo 7. <ol><li> Manter a broca molhado em H2O durante a perfuração. H 2 O funciona como um lubrificante, o que aumenta o tempo de vida da broca. </li><li> Ocasionais limpando a ponta da broca ajuda a abertura de furos. </li><li> Após a abertura de furos, marque um lado da lâmina para facilitar a identificação durante o processo PEGylation. Os marcadores podem ser utilizados como referência, para evitar confusão mais tarde. Para a marcação, uma broca de diamante pode ser usado. Não utilize qualquer caneta desde que a tinta pode ficar na superfície. </li></ol></li><li> Limpeza com H 2 O. Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 as lâminas podem ser colocadas num recipiente. Lavar as lâminas com MilliQ H 2 O. Repita 3 vezes e sonicate os slides com MilliQ H2O por 5 min para remover a sujeira. Descarte a água e lave os slides de novo 3 vezes comMilliQ H 2 O. Note-se que 130 W é a energia de ultra-sons utilizado para este protocolo. Poder sonicação Superior pode diminuir a vida útil das lâminas de quartzo. </li><li> A limpeza com acetona. Substitua o MilliQ H2O com acetona. Sonicar as lâminas com acetona durante 20 minutos ou mais. </li><li> A lavagem com H 2 O. Descarte a acetona e enxaguar as lâminas com MilliQ H 2 O. Repita isso por três vezes, a fim de remover qualquer resíduo de acetona. </li><li> Limpeza com KOH. Substitua a água com 1 M KOH e sonicate os slides para 20 minutos ou mais. Corrosão excessiva (por exemplo, tratamento KOH overnight) irá melhorar a qualidade da superfície, mas vai apresentar arranhões, o que pode interferir com imagens de fluorescência. </li><li> A lavagem com H 2 O. Lavar as lâminas com MilliQ H2O por 3 vezes para remover vestígios de KOH. </li><li> Gravura Piranha. <ol><li> Transferir as lâminas para um suporte de slides Duran ou um titular de Teflon feito por encomenda e place-los num copo (1 L), que está localizada numa chaminé de química. </li><li> Encher o recipiente com 450 ml de H 2 SO 4. </li><li> Adicionar 150 ml de H 2 O 2 para relação de 3:1 entre H 2 SO 4 e H 2 O 2. Uma vez que a solução começa a ferver espontaneamente, a temperatura aumenta acima de 90 ° C. Certifique-se de que a solução de H 2 O 2 está à temperatura ambiente antes de iniciar a reacção. Caso contrário, a temperatura de ebulição da solução pode ser inferior a 90 ° C. </li><li> Agita-se a solução para uma mistura apropriada e permitir que o recipiente em repouso por 20 minutos. </li><li> Tome as lâminas da solução piranha, juntamente com o titular do slide, e colocá-los no porta-lâminas contendo MilliQ H 2 O. Enquanto isso, descartar a solução piranha em um frasco de resíduos designada uma vez que atinge a temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas três vezes com H 2 O. MilliQ Cuidado extra deve ser tomado em mais steps para evitar qualquer possível contaminação de slides. Continue na Etapa 3. Aconselha-se a proceder de imediato com os seguintes passos. * Atenção: A solução piranha é extremamente reativo. Ao manusear esta solução cuidado extra deve ser tomado. Além disso, quando por engano misturados com solventes orgânicos, tais como acetona, que pode provocar uma explosão. </li></ol></li></ol> 2. Limpeza Coverslip Uma câmara de microfluidos é composta por uma lâmina de quartzo e um lábio de cobertura s. Quando um TIRF microscópio do tipo prisma é utilizada, a superfície de uma lamela não é visualizada. Portanto, é suficiente para limpar uma lamela apenas com H 2 O e KOH. No caso de uma lamela deve ser trabalhada (por exemplo, através da microscopia TIRF tipo objectivo), recomenda-se a tratar as lamelas com solução piranha (Passo 1.7). Note que se PEGylation da superfície da lamela não é de alta qualidade, ele pode atuar como um dissipador de proteínas umad dar origem a variações na concentração de proteína. <ol><li> A lavagem com H 2 O. Colocar lamelas (24 x 30, 24 x 40, ou 24 x 50 mm 2) em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 lamelas podem ser colocados num único frasco. Lavar as lamelas 3 vezes com o MilliQ H 2 O. </li><li> Limpeza com KOH. Substitua a água com KOH 1M e sonicate as lamelas de 20 min ou mais. </li><li> A lavagem com H 2 O. Lavar as lamelas 3 vezes com MilliQ H 2 O para remover os vestígios de KOH. Continue na Etapa 3. </li></ol> 3. Amino-silanização de Slides e Lamelas Funcionalização da superfície das lâminas de quartzo e as lamelas com o grupo amina por meio da química amino-silanização. O metanol é usado como solvente e ácido acético como catalisador para a reacção de amino-silanização. <ol><li> A lavagem com metanol. Substitua o MilliQ H2O nos pratos de coloração (a partir de SPTE 1 e 2) com metanol. Mantenha os slides e as lamelas em metanol até Passo 3.3. Não armazenar as lâminas e as lamelas em metanol durante um tempo desnecessariamente longo período de tempo (por exemplo, várias horas) desde que as impurezas em metanol irá adsorver à superfície. </li><li> Preparar solução de amino-silanização. <ol><li> Lavar um balão de pirex várias vezes com metanol. Sonicar o frasco com metanol durante 5 minutos ou mais. É aconselhável ter um frasco dedicado que é mantido limpo. </li><li> Verter 100 mL de metanol, para o balão. </li><li> Adicionar 5 ml de ácido acético. </li><li> Adicionar 3 ml de APTES (3-aminopropil trimetoxissilano) e misture delicadamente por sacudi-la. </li></ol></li><li> Amino-silanização. Substituir o metanol nos pratos de coloração que contêm as lâminas e as lamelas de cobertura com a mistura de reacção aminosilanization. <ol><li> Incubar por 20-30 min. Durante a incubação, sonicar uma vez durante 1 min. </li></ol></li><li> A lavagem com metanol. Substitua a umminosilanization reacção com metanol. Descartar o metanol e adicionar uma solução de metanol fresco. Repita este procedimento três vezes. </li></ol> 4. Passivation superfície usando Polymer (A Primeira Rodada) Passivação da superfície revestida de amina de lâminas e lamelas de quartzo através da conjugação de NHS-éster de polietileno glicol (PEG). Esta reacção é levada a cabo com a concentração de saturação da solução de PEG a um pH de 8,5 durante a noite. <ol><li> Secagem lâminas e lamínulas. Secam-se as lâminas e as lamelas utilizando gás N2 e colocá-los em caixas de pipetas limpo, de tal maneira que o lado que não tem de ser tratado com PEG está virada para cima. A caixa de pipeta é parcialmente preenchido com MilliQ H 2 O. Esse ambiente úmido impede solução PEGylation sequem durante a incubação durante a noite. </li><li> Preparar tampão de reacção. Prepare a 0,1 M de tampão de fresco de bicarbonato de sódio (pH 8,5) por dissolução de 84 mg de bicarbonato de sódio em 10 ml deMilliQ H 2 O. Não há necessidade de ajustar o pH. Esta solução pode ser armazenado congelado para a próxima utilização (por exemplo, Passo 6.1). </li><li> Preparar solução PEGylation. <ol><li> Prepara-se uma mistura de PEG de 0,2 mg biotiniladas NHS-éster de PEG (5000 Da) e 13 8 mg de NHS-éster de mPEG (5000 Da), em um tubo de 1,5 ml. Quando se prepara o número N de lâminas, preparar N vezes maior quantidade da mistura de PEG num único tubo. </li><li> Adicionar 64 mL (ou N vezes 64 mL de N número de lâminas) do buffer recém-preparado (Passo 4.2). Pipetar para cima e para baixo a fim de dissolvê-los completamente. </li><li> Centrifugar com 16.100 xg por 1 min para remover as bolhas de ar. Não pipete depois. De outro modo, as bolhas de ar se formam, que interferem com a PEGilação no passo 4.4. </li></ol></li><li> PEGylation. <ol><li> Queda de 70 uL da mistura de PEGilação para uma lâmina de quartzo seca do Passo 4.1. Utilizar 90 mL, no caso de 24 x 50 mm 2 coverslip. </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela seco a partir do Passo 4.1 sobre a solução. </li><li> Para se ter uma alta qualidade uniforme e de PEGylation, tome cuidado para não introduzir bolhas de ar. Devido à tensão de superfície, a maior parte das bolhas de ar podem sair espontaneamente o volume de reacção dentro de cinco minutos, devido à tensão superficial. </li><li> Incubar as lâminas em um ambiente escuro e úmido. A meia-vida de NHS-éster de PEG que usamos a pH 8 é de cerca de uma hora. No mínimo, a incubar durante 2 horas. Incubação durante a noite conduz a uma maior qualidade de PEGilação (dados não mostrados). </li></ol></li></ol> 5. Armazenamento de longo prazo Armazenar as lâminas e lamínulas em N 2 PEGilados a -20 º C. <ol><li> Secagem lâminas e lamínulas. Desmontar cuidadosamente a lâmina ea lamínula, deslizando a lamela para um lado, lavá-los com MilliQ H 2 O, e seque-as com N 2. </li><li> Armazenar lâminas e lamínulas. For uso imediato, siga o procedimento para a segunda rodada de PEGylation (Passo 6). Para armazenar por um longo período de tempo, siga os seguintes passos. <ol><li> Coloque um par de lâmina e lamela em um tubo de 50 ml de tal forma que as superfícies estão PEGilados virada para fora um do outro. </li><li> Parcialmente fechar o tubo, o tubo de vácuo, em seguida, preenchê-lo com N 2. Estes passos ajudar a preservação da superfície PEGuilado por um longo período de tempo. Aperte o tubo bem e armazená-lo a -20 ° C. A qualidade das lâminas permanece bom por até 3 meses (Figura 3A, à direita). </li></ol></li></ol> 6. Passivation superfície usando Polymer (o segundo turno) Ronda adicional de PEGilação para tornar a camada mais densa de PEG e também para matar todos os restantes grupos amina sobre a superfície. O uso de moléculas de PEG de NHS de éster de curta duração (333 Da) pode ser eficaz no que penetra uma camada de PEG existente. É recommended fazer esta segunda rodada de PEGylation direita antes de usar um slide. <ol><li> Preparar tampão de reacção. Prepare a 0,1 M de tampão de bicarbonato de sódio fresco (pH 8,5). A solução congelada a partir do Passo 4.2, também podem ser usados. </li><li> Preparar solução PEGylation. Dissolve-se 7 ul de 250 mM MS4-PEG em 63 ul de tampão bicarbonato de sódio a. </li><li> PEGylation. Seguem o mesmo procedimento como no passo 4.4. Incubar por 30 min até durante a noite. </li><li> Secagem lâminas e lamínulas. Desmonte a par da lâmina ea lamínula, lavá-los com MilliQ H 2 O, seque-os com N 2, e mantê-los em uma caixa de pipeta limpa. Prossiga para a montagem de uma câmara microfluídicos no Passo 7. </li></ol> 7. Montar uma Câmara Microfluidic Montar uma câmara microfluídicos usando um par de um quartzo de slides peguilado e uma lamela. Fita adesiva dupla face é usado como um espaçador. A câmara é selada com cola epóxi e, assimluções são introduzidos através dos orifícios da corrediça de quartzo. <ol><li> Coloque uma lâmina de quartzo sobre uma superfície plana com a face voltada para cima da PEGuilado. </li><li> Fazer um canal (largura 5-7 mm) na diagonal na superfície de PEGuilado colocando fitas adesivas de dupla face sobre a lâmina. Certifique-se de que os orifícios estão posicionados no centro do canal. Tome cuidado para não estragar a superfície da PEGylated durante o processo de fabricação de uma câmara. É possível fazer um slide de multi-canal, colocando e aderindo as fitas adesivas de dupla face de forma diferente (ver Figura 2). </li><li> Delicadamente, coloque uma lamela PEGylated em cima para completar a câmara. O lado PEGylated deve estar voltado para baixo. </li><li> Selar a câmara pressionando a lamela sobre a área onde as fitas dupla face são colocados. Fazê-lo suavemente, mas cuidadosamente para que a câmara se torna água hermeticamente fechado. </li><li> Fechar as extremidades da câmara de cola epóxi. </li><li> Imobilizar estreptavidina ou neutravidina nabiotinilado camada de PEG pela adição de 50 ul de 0,1 mg / ml de solução de estreptavidina ou neutravidina em T50 (10 mM Tris-HCl [pH 8,0], tampão de NaCl 50 mM) usando uma pipeta de p200. Após 1 min de incubação, lavar com 100 mL de tampão T50. </li><li> Adicionar moléculas biológicas biotinilados para sua única molécula de imagem. </li></ol> 8. Deslize Reciclagem Reciclagem de lâminas de quartzo. Slides utilizados são reciclados por tirar as lamelas e as fitas adesivas de dupla face. <ol><li> Após o uso, guarde as câmaras na água da torneira. Incubação longo prazo na água facilita a desmontagem das câmaras. </li><li> Ferva as câmaras na água da torneira usando um microondas. Use uma proveta de Pyrex. Ferva por 10 minutos ou mais. </li><li> Tire as lamelas e as fitas adesivas de dupla face, usando uma lâmina de barbear. Não pressione um slide quartzo perpendicular ao seu plano. Caso contrário, ele quebra. Manter a lâmina de barbear para longe do canal. Otherwise, introduz riscos no canal. </li><li> Lavar as lâminas usando um detergente doméstico, esfregando-os com os dedos. </li><li> Colocar as lâminas em um frasco de vidro para coloração. Tipicamente, de 5 a 15 as lâminas podem ser colocadas num recipiente. Adicionar 10% de detergente doméstico e sonicate os slides para 20 minutos ou mais. Lavar as lâminas com uma grande quantidade de água da torneira. </li><li> Vá para o Passo 1.2. </li></ol>

<ol><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfaces+and+orientations%3A+much+to+FRET+about%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Surfaces and orientations: much to FRET about.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).</li>
<li>Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein-nucleic+acid+and+protein-protein+complexes%3A+surface+passivation+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization.</a> Methods. 52 (2), 192-200 (2010).</li>
<li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+system+for+single+molecule+fluorescence+measurements+of+surface-immobilized+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules.</a> J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).</li>
<li>Kingshott, P., Griesser, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+that+resist+biodegradation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Solid+St+M%22%5BJournal%5D)">Surface that resist biodegradation.</a> Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).</li>
<li>Elbert, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+treatments+of+polymers+for+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Mater+Sci%22%5BJournal%5D)">Surface treatments of polymers for biocompatibility.</a> Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).</li>
<li>Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-Molecule+Techniques%3A+A+Laboratory+Manual%22">Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+lipid+bilayers+and+DNA+curtains+for+high-throughput+single-molecule+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies.</a> Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).</li>
<li>Kenausis, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28L-lysine%29-g-Poly%28ethylene+glycol%29+layers+on+metal+oxide+surfaces%3A+attachment+mechanism+and+effects+of+polymer+architecture+on+resistance+to+protein+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption.</a> J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).</li>
<li>Groll, J., Star Moeller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((polymer+surface+passivation+for+single-molecule+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">polymer surface passivation for single-molecule detection.</a> Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).</li>
<li>Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyethylene+glycol+coatings+of+uptake+of+indocyanine+green+loaded+nanocapsules+by+human+spleen+macrophages+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro.</a> J Biomed Opt. 16 (5), (2011).</li>
<li>Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+enzymes+replicating+DNA+using+a+single-molecule+DNA+stretching+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay.</a> J Vis Exp. (37), e1689(2010).</li>
<li>Upadhyayula, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coatings+of+polyethylene+glycol+for+suppressing+adhesion+between+solid+microspheres+and+flat+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces.</a> Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).</li>
<li>Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+genomic+processes+at+the+single-molecule+level%3A+introducing+the+tools+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications.</a> Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).</li>
<li>Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+single-molecule+spectroscopy+to+macromolecular+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes.</a> Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318, 426-430 (2007).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

As etapas críticas dentro deste protocolo É essencial para fazer a superfície hidrófila antes da reação amino-silanização. Isto foi conseguido através da gravura piranha que gera os grupos hidroxilo livres em uma superfície de vidro / quartzo. Recomenda-se não para manter a superfície atacada piranha expostas quer a H2O ou a ar durante um longo período de tempo desde que a hidrofilicidade da superfície diminui gradualmente. As moléculas de éster de NHS-PEG são reactivos. Aconselha-se a fazer alíquotas e armazená-los sob azoto, em -20 º C. O prazo de validade do produto químico APTES na temperatura ambiente é curto. Aconselha-se a substituí-lo por um novo a cada mês. Modificações deste protocolo Quando você não pode usar a gravura piranha por qualquer motivo prático, você pode gravar usando KOH por um longo período de tempo (por exemplo, overnight), o que também vai fazer grupos hidroxilo expostos. A armadilha de esta abordagem alternativa é a de que a lâmina torna-se inutilizável depois de algumas reciclagens devido a arranhões severos. Ele é muitas vezes praticada para queimar uma superfície de vidro / quartzo usando maçarico a gás, o qual é eficaz na eliminação de materiais orgânicos fluorescentes 7. Este procedimento não foi incluído neste protocolo, pois é redundante para o condicionamento piranha. Note-se que este procedimento irá potencialmente conduzir a oxidação dos grupos hidroxilo. Portanto, este procedimento não deve ser realizado uma vez por superfície foi gravado usando KOH ou solução piranha. Quando um tampão com pH inferior a 7 é usado para uma única molécula de imagem, a conformação de PEG muda de &quot;cogumelos&quot; a &quot;escova&quot;, o que reduz o grau de passivação. Portanto, quando o pH inferior a 7,0 é usado, é recomendável para passivar a superfície posterior utilizando tartarato de dissuccinimidilo &lt;sup&gt; 7. Perspectivas Este trabalho tem proporcionado um protocolo robusto para atingir alta qualidade de superfície de passivação. Este protocolo irá ser útil para estudos de fluorescência de moléculas individuais que estão envolvidos com as proteínas de 14, bem como complexos de proteína dentro de extractos de células e imunoprecipitados 15. Será amplamente utilizado para outras técnicas de molécula única, como a espectroscopia de força e espectroscopia de binário 16. Será também útil para prevenir a adsorção de células a partir de uma superfície 17. O protocolo fornecido neste trabalho é exigente para os seus procedimentos de várias etapas. Passivação superficial utilizando lípido PEG-8 e de poli-lisina PEG 9 estão disponíveis como uma abordagem alternativa. Desde então, eles não precisam de qualquer reação química é fácil de implementar. No entanto, o grau de passivação não é tão elevada como a conseguida através modif químicacação de uma superfície.

Ao efectuar um estudo de uma única molécula de proteína que é essencial para atingir uma elevada qualidade de passivação da superfície, de modo que a experiência é livre de qualquer mau funcionamento da proteína induzida à superfície ou a desnaturação de 1,2. Embora uma superfície de vidro tratado com surfactantes, tais como albumina do soro bovino, é vulgarmente utilizado para os estudos de ácido nucleico única molécula de 3, o seu grau de passivação não é suficientemente elevada para os estudos de proteína. A superfície de vidro revestido com polímero (polietilenoglicol, PEG) é superior no desempenho 4-6 passivação. Desse modo, tornou-se universalmente utilizado para estudos de proteína única molécula desde que foi apresentado a um estudo de fluorescência única molécula 7-10. O processo de revestimento de polímero requer vários tratamentos de superfície 7,11,12. Portanto, é difícil para acompanhar todo o processo sem instruções detalhadas. Muitas vezes, o grau de passivação da superfície varia de acordo com o protocolo is seguidas. Aqui apresentamos um protocolo robusto, com instruções passo-a-passo, que irá remover um dos principais gargalos de estudos de proteína única molécula. Veja a Figura 1 para uma descrição.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Preparação e limpeza da lâmina</forte></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>lamínulas</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 ( No.1&frac12;, Retangular)</td></tr><tr><td>Brocas diamantadas</td><td>MTN-Giethoorn, Países Baixos</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duran suporte de lâminas</td><td>LGS, Países Baixos</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>Pratos de coloração de vidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Boom</td><td>6233905</td><td>1 L, peróxido de hidrogênio 30%. Frascos abertos devem ser armazenados a 4 °C.</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Boom</td><td>80900627.9010</td><td>Ácido sulfúrico 95-98%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Hidróxido de potássio</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>Sigma 32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Limpador ultrassônico de mesa, 3510</td></tr><tr><td>Lâminas de quartzo</td><td>Finkenbeiner</td><td></td><td>1" x 3", 1 mm de espessura</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>2. Limpeza de lamínula</td></tr><tr><td>Duran suporte de lâminas</td><td>LGS, Holanda</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>30603</td><td>Sonicador de hidróxido de potássio</td></tr><tr><td></td><td>Branson</td><td></td><td>Limpador ultrassônico de mesa, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">3. Amino-silanização de lâminas e lamínulas</forte></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma</td><td>320099-500ML</td><td>Ácido acético, glacial</td></tr><tr><td>APTES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-100ML</td><td>3-aminopropil trimetoxissilano. Conservar à temperatura ambiente sob N2. Substitua uma vez por mês.</td></tr><tr><td>Balão (200 ml)</td>Balão <td>VWR</td><td>(200 ml)</td><td>Balão de pirex. Ter um balão dedicado à aminossilanização.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td></td><td>Limpador ultrassônico de mesa, 3510</td></tr><tr><td colspan="4">4. Passivação de superfície usando polímero (a primeira rodada)</td></tr><tr><td>Biotina-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotina-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotina-PEG-SVA, MW 5.000&nbsp;Da. Armazene alíquotas de 1-2 mg (o suficiente para 10 lâminas) a -20 &deg; C em N2.</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-succinimidil valerato (SVA), MW 5.000 Da. Armazene alíquotas de 80 mg (o suficiente para 10 lâminas) a -20 &deg; C em N2.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">5. Passivação de superfície (a segunda rodada)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>Dimethylsulfoxide BioReagent, para biologia molecular, &ge; 99,9%</td></tr> <tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>Tartarato de disuccinimidila</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>PEG NHS-éster curto, MW 333 Da. Dissolver 100 mg MS4-PEG em 1,1 ml de DMSO. Loja 20 &micro; l alíquotas a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">6. Montagem de uma câmara microfluídica</td></tr><tr><td>Double sticky tape</td><td>Scotch</td><td></td><td>10 mm de largura</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 minute epoxy</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>Cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Pierce</td><td>31000</td><td>ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O em 4 &deg; C.</td></tr><tr><td>Estreptavidin</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>Estoque 5 mg / ml em H2O ou T50 a 4 ° C.</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>Tris</td></tr></tbody></table>

passivação da superfície de estudos de proteína única molécula

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

Espectroscopia de fluorescência de moléculas individuais provou ser fundamental para a compreensão de uma ampla gama de fenômenos biológicos em nanoescala. Exemplos importantes do que esta técnica pode render às ciências biológicas são as idéias mecanicistas sobre proteína proteína e proteína-interações ácido nucleico. Quando as interacções de proteínas são sondadas no nível de uma única molécula, as proteínas ou os seus substratos são frequentemente imobilizado sobre uma superfície de vidro, o que permite uma observação a longo prazo. Este esquema de imobilização pode introduzir artefatos superficiais indesejáveis. Portanto, é essencial para passivar a superfície do vidro para tornar inerte. Revestimento de superfícies utilizando polietileno glicol (PEG) destaca-se por sua alta performance na prevenção de proteínas de interagir não especificamente com uma superfície de vidro. No entanto, o procedimento de revestimento de polímero é difícil, devido a uma complicação que resulte de uma série de tratamentos de superfície e a exigência rigorosa que uma superfície precisaestar isento de quaisquer moléculas fluorescentes, no final do procedimento. Aqui, nós fornecemos um protocolo robusto, com instruções passo-a-passo. Abrange limpeza de superfícies, incluindo decapagem piranha, funcionalização de superfície com grupos amina e, finalmente, revestimento PEG. Para se obter uma elevada densidade de uma camada de PEG, que introduzem uma nova estratégia para o tratamento de superfície com moléculas de PEG em duas voltas, o que melhora notavelmente a qualidade de passivação. Nós fornecemos resultados representativos, bem como conselhos práticos para cada passo crítico para que qualquer pessoa pode alcançar a superfície passivation alta qualidade.

Após a montagem de câmara de microfluídica (Passo 7,1-7,6) e antes da realização de Passo 7.7, é aconselhável realizar o controle da superfície PEGylated qualidade. Se a passivação da superfície foi feita com sucesso, existem menos do que 10 não especificamente proteínas adsorvidas por área de imagem (25 mm x 25 mm) quando observada 1-10 nM de proteína marcada por fluorescência é adicionado para dentro da câmara (Figura 3a, à esquerda). Quando qualquer uma das etapas de limpeza ou de reação não foi devidamente realizado, o número de não especificamente adsorvido proteínas aumenta significativamente, ea tela do CCD pode ser saturada por sinais de fluorescência. Por exemplo, se o condicionamento piranha é ignorada, não é 100 vezes maior quantidade de adsorção não-específica observada (Figura 3a; comparar deixou com meio). Quando o segundo passo de PEGuilação é ignorada, houve cerca de 3 horasa maior quantidade de adsorção não-específica observada (Figura 3b). Um baixo grau de PEGilação é observada quando os produtos químicos no fim (por exemplo, APTES armazenado à temperatura ambiente durante vários meses) são utilizadas (dados não apresentados). A qualidade da superfície também cai quando uma quantidade significativa de tempo já passou por uma vez que foi PEGuilado (figura 3a, comparar esquerda com direita). Para o nosso melhor conhecimento, é a primeira vez que as duas rodadas de PEGylation são introduzidos para estudos de moléculas individuais. As duas rodadas de PEGylation garantir a mais alta qualidade de formação da camada PEG (Figura 3b). A natureza superior da dupla PEGylation está proeminentemente mostrado nos filmes (Compare 1a filme com 1b Filme). Nestes filmes, os sinais de fundo de moléculas fluorescentes em solução são observados para ser muito mais fraco do que o dobro PEGilação<html> utilizado, o que indica que as proteínas são repelidos mais eficazmente pela camada duplamente peguilado. Embora este processo de duas etapas é altamente recomendável, a segunda etapa PEGylation pode ser ignorada se a experiência é tolerável para passivação não ideal. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Esquemática dos tratamentos de superfície (a) uma lâmina de microscópio é limpa com acetona, KOH, e soluções piranha. Ele é funcionalizado com APTES e PEGuilado com NHS-éster de PEG. (B) Uma lamela são limpas com KOH, bem como com a solução piranha se necessário. Ele é funcionalizado com APTES e PEGuilado com NHS-éster de PEG. &quot;width =&quot; 500 fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figura 2:. Câmara microfluídicos (a) A câmara de canal único. A lâmina de microscópio tem dois furos. É montado com uma lamela usando duas fatias de uma fita adesiva dupla face. (B) Uma câmara de três canais. A lâmina de microscópio tem seis furos. É montado com uma lamela usando quatro fatias de uma fita adesiva dupla face. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: imagens CCD tiradas com as proteínas marcadas com corante em solução. (A) imagens CCD foram tiradas por microscopia de fluorescência total de reflexão interna do tipo prisma usando uma lente objetiva de 60X com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. (Esquerda) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (Média) A superfície foi prepaseguindo o protocolo neste artigo vermelho, mas piranha gravura foi ignorada. (Direita) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo e armazenados durante 3 meses a -20 ° C sob azoto. (B) imagens CCD tiradas com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. (Esquerda) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (Direita) A superfície foi preparada seguindo o protocolo neste artigo, mas a segunda rodada de PEGylation foi ignorada. Barra de escala = 5 um. Filme 1: filmes CCD tiradas com as proteínas marcadas com corante em solução. Filmes CCD foram tiradas por microscopia de fluorescência total de reflexão interna do tipo prisma usando uma lente objetiva de 60X com 10 nM Cy3-labeld Rep em solução. O tempo de resolução é de 100 ms. (A) A superfície foi preparado seguindo o protocolo neste artigo. (B) A superfície foi preparada seguindo o protocolo neste artigo, mas a segunda rodada de PEGylção foi ignorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">Clique aqui</a> para ver 1a filme e <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">clique aqui</a> para ver 1b Filme.

Descreve-se um método para passivação de uma superfície de vidro, usando polietilenoglicol (PEG). Este protocolo abrange limpeza de superfícies, funcionalização de superfície e revestimento PEG. Nós introduzimos uma nova estratégia para o tratamento da superfície com moléculas de PEG mais de dois rounds, que produz qualidade superior de passivação em relação aos métodos existentes.

Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

O objetivo geral deste procedimento é obter uma superfície de lâmina de quartzo funcionalizada de alta qualidade. Isso é realizado primeiramente limpando lâminas de quartzo perfuradas e lamínulas com água e acetona. Em seguida, a lâmina é atacada com hidróxido de potássio e com a solução piranha para melhorar a qualidade da superfície. Em seguida, as lâminas e lamínulas são funcionalizadas com grupos amina, seguidas por duas rodadas de ativação da superfície utilizando um polímero para tornar a superfície de vidro inerte. O passo final consiste em montar a câmara microfluídica a partir da lâmina e da lamínula, com as superfícies revestidas com polietilenoglicol ou pegiladas voltadas uma para a outra. Em última análise, uma nova estratégia de tratamento da superfície com moléculas de peg em duas rodadas melhora notavelmente a qualidade da passivação, conforme observado por microscopia de fluorescência de molécula única.A principal vantagem desta técnica ou das técnicas existentes, como o revestimento polimérico após a gravação com óxido de potássio, é que este método garante qualidade superior. Pessoas novas neste método terão dificuldades, já que diversos tratamentos devem ser realizados. Para começar a perfurar, as lâminas de quartzo conforme detalhado no protocolo do texto.Limpe as lâminas colocando-as em um frasco de vidro para coloração. Normalmente, de cinco a quinze lâminas podem ser colocadas em um único frasco. Em seguida, enxágue as lâminas com água UE após repetir o enxágue três vezes, sonique as lâminas com água UE por cinco minutos para remover a sujeira, descarte a água e enxágue as lâminas três vezes adicionais com água UE.Em seguida, substitua a água UE por acetona e sonique as lâminas com acetona por 20 minutos ou mais, descarte a acetona e enxágue as lâminas com água Milli Q para remover qualquer resíduo de acetona. Em seguida, substitua a água por hidróxido de potássio 1 M e sonique as lâminas por 20 minutos ou mais. A ataque excessivo melhorará a qualidade da superfície, mas introduzirá arranhões que podem interferir na imagem de fluorescência.Lave as lâminas com água Milli Q três vezes para remover traços de hidróxido de potássio antes de realizar a gravação com piranha. Transfira as lâminas para um suporte Duran ou um suporte personalizado de teflon e coloque-as em um béquer de um litro localizado dentro de uma capela de exaustão química. Encha o béquer com 450 mililitros de ácido sulfúrico.Em seguida, adicione 150 mililitros de peróxido de hidrogênio para obter uma proporção de três para um entre ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Agite a solução para uma mistura adequada e deixe o béquer em repouso por 20 minutos. Retire as lâminas da solução piranha e coloque-as em um porta-lâminas contendo água Millieu.Enquanto isso, descarte a solução de piranha em um frasco designado para resíduos. Uma vez que atinja a temperatura ambiente, enxágue as lâminas três vezes com água UE após a limpeza das lamínulas. Substitua a água UE nos recipientes de coloração por metanol. Mantenha as lâminas e as lamínulas em metanol.Enquanto isso, prepare a solução de silanização amino despejando 100 mililitros de metanol no frasco. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético e três mililitros de 3-aminopropil-trimetoxissilano e misture suavemente agitando. Substitua o metanol nos recipientes de coloração contendo as lâminas e as lamínulas pela mistura de reação de silanização amino.Incube por 20 a 30 minutos e, durante a incubação, sonique uma vez por um minuto. Em seguida, substitua a reação de aminoilização por metanol. Descarte então o metanol e adicione uma solução fresca de metanol.Repita este procedimento três vezes para a primeira rodada de funcionalização da superfície. Usando primeiro o polímero, seque as lâminas e as lamínulas com gás nitrogênio. Em seguida, coloque-as em caixas limpas para pipetas parcialmente preenchidas com água Milli-Q, de modo que o lado que deve ser pegilado fique voltado para cima. A seguir, adicione 64 microlitros do tampão de reação recém-preparado a uma solução de peg preparada.Pipete a mistura para cima e para baixo para dissolver completamente. Em seguida, centrifugue a 16.100 ×g por um minuto. Para remover bolhas de ar, adicione 70 microlitros da mistura de pegilação sobre uma lâmina de quartzo seca.Coloque suavemente uma lamínula seca sobre a solução, e incube as lâminas em ambiente escuro e úmido por duas horas até a noite toda para armazenar as lâminas e lamínulas funcionalizadas com PEG. Desmonte cuidadosamente a lâmina e a lamínula deslizando a lamínula para o lado e enxaguando-as com água UE antes de secá-las com gás nitrogênio. Coloque um par de lâmina e lamínula em um tubo de 50 mililitros de modo que as superfícies funcionalizadas com PEG fiquem voltadas uma para longe da outra.Feche parcialmente o tubo e submeta-o a vácuo antes de preenchê-lo com gás nitrogênio e apertar bem a tampa. Armazene-o a menos 20 graus Celsius. Esses passos ajudam a preservar a superfície pegilada por um longo período de tempo.Realize uma segunda rodada de pegilação conforme descrito no protocolo textual imediatamente antes de usar a lâmina para montar uma câmara microfluídica. Coloque uma lâmina de quartzo sobre uma superfície plana com o lado pegilado voltado para cima. Faça um canal em diagonal na superfície pegilada colocando fita adesiva dupla face sobre a lâmina.Certifique-se de que os orifícios estejam posicionados no centro do canal. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula com revestimento pegilado por cima para completar a câmara, com o lado pegilado voltado para baixo.Selar a câmara pressionando a lamínula sobre as áreas onde a fita dupla face está colocada. Faça isso suavemente, mas de forma completa, para que a câmara fique hermeticamente selada. Por fim, feche as bordas da câmara com cola de epóxi.Prossiga para imobilizar estreptavidina ou neutravina e adicione moléculas biológicas biotiniladas para imagem de molécula única conforme descrito no protocolo textual. Se a funcionalização da superfície foi realizada com sucesso, observa-se menos de 10 proteínas absorvidas não especificamente por área de imagem. Quando uma a 10 nanomolares de proteína marcada com fluoróforo são adicionados à câmara, caso qualquer uma das etapas de limpeza ou reação não tenha sido adequadamente realizada, o número de proteínas absorvidas não especificamente aumenta significativamente. Por exemplo, se a etapa de ataque com piranha for omitida, observa-se 100 vezes mais absorção não específica.A natureza superior da dupla pegilização é claramente demonstrada aqui. Os sinais de fundo provenientes de moléculas fluorescentes e da solução foram observados como muito mais fracos quando foi utilizada a dupla pegilização, conforme mostrado no painel esquerdo. Isso indica que as proteínas são repelidas de maneira mais eficaz pela camada duplamente pegilada.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com AYA pode ser extremamente perigoso; precauções como luvas apropriadas, óculos de proteção e avental devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

surface-passivation-for-single-molecule-protein-studies

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Neste artigo vamos descrever como obtemos FRET traços de moléculas individuais de DNA imobilizado em uma superfície usando um microscópio de varredura confocal automatizado.

Sistema automatizado para medições única molécula de fluorescência de Superfície-imobilizada Biomoléculas

Um método de usar solid-state nanoporos para monitorar a adsorção não-específica de proteínas em uma superfície inorgânica é descrita. O método emprega o princípio de pulso-resistivo, permitindo a adsorção a ser sondado em tempo real e ao nível de moléculas individuais. Porque o processo de adsorção de proteínas é única longe do equilíbrio, propomos o emprego de matrizes paralelas de nanoporos sintéticos, permitindo que para a determinação quantitativa da taxa de reação aparente de primeira...

Monitoramento adsorção de proteínas com Solid-state Nanoporos

O protocolo apresentado descreve a análise do transporte mediado por proteínas de membrana no nível do transportador único usando bicamadas lipídicas livres de solvente que abrangem os poros. Isso é alcançado pela criação de chips de matriz de nanoporos produzidos em massa, combinados com aquisição e análise de dados altamente paralelas, permitindo o estabelecimento futuro de telas efetoras de proteínas de membrana.

Membrane Transport processos analisados ​​por um Sistema Nanopore Chip altamente paralelos na resolução Protein Individual

Este protocolo demonstra um ensaio de alongamento de fluxo única molécula simples, robusta e de alta taxa de transferência para estudar a difusão unidimensional (1D) moléculas ao longo do DNA.

Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

Descrevemos os procedimentos detalhados e estratégias para medir as propriedades mecânicas e mecânicas vias desdobramento de moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica. Também mostramos resultados representativos como uma referência para a seleção e a justificativa de gravações de molécula de proteína única boa.

Espectroscopia de força das moléculas de proteína único, usando um microscópio de força atômica

Este protocolo descreve a imobilização covalente de proteínas com um heterobifunctional agente de acoplamento silano para superfícies de óxido de silício projetado para a espectroscopia de força força atômica microscopia com base única molécula que é exemplificado a interação de RrgA (adesina pilus-1 ponta de S. pneumoniae) com fibronectina.

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

Aqui, apresentamos um protocolo para conjugar o monômero proteico por enzimas que formam polímero de proteína com uma sequência controlada e imobilizá-lo na superfície para estudos de espectroscopia de força de molécula única.

Síntese Enzimática Mediada oOAEP1 e Imobilização de Proteína Polimerizada para Espectroscopia de Força De Molécula Única

O presente protocolo descreve a preparação da amostra e a análise de dados para quantificar a fosforilação proteica usando um ensaio de recuo de molécula única (SiMPull).

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Este estudo apresenta um procedimento detalhado para realizar experimentos de transferência de energia de ressonância de fluorescência de molécula única (smFRET) em receptores acoplados à proteína G (GPCRs) usando marcação site-specific via incorporação de aminoácidos não naturais (UAA). O protocolo fornece um guia passo a passo para a preparação de amostras smFET, experimentos e análise de dados.

Visualizando a dinâmica conformacional de receptores de membrana usando FRET de molécula única

Muitas proteínas intrinsecamente desordenadas têm demonstrado participar na formação de condensados biomoleculares altamente dinâmicos, um comportamento importante para inúmeros processos celulares. Aqui, apresentamos um método baseado em imagem de molécula única para quantificar a dinâmica pela qual as proteínas interagem entre si em condensados biomoleculares em células vivas.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Este artigo fornece uma descrição detalhada de como criar amostras para rastreamento de proteína única em bicamadas lipídicas suportadas por sólidos. Também explica um microscópio de fluorescência simples, com sensibilidade a molécula única e taxa de quadros rápida. Por fim, descrevemos o procedimento para extrair trajetórias de proteína única.

Rastreamento de proteínas individuais em bicamadas lipídicas usando microscopia de fluorescência

Aprenda a passivar superfícies de vidro com polietilenoglicol em duas etapas para microscopia de fluorescência de molécula única. Este protocolo reduz a ligação não específica e melhora a qualidade da imagem.

Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula

Explorar mais vídeos