Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula
24 de abril de 2014
Descreve-se um método para passivação de uma superfície de vidro, usando polietilenoglicol (PEG). Este protocolo abrange limpeza de superfícies, funcionalização de superfície e revestimento PEG. Nós introduzimos uma nova estratégia para o tratamento da superfície com moléculas de PEG mais de dois rounds, que produz qualidade superior de passivação em relação aos métodos existentes.
O objetivo geral deste procedimento é obter uma superfície de lâmina de quartzo funcionalizada de alta qualidade. Isso é realizado primeiramente limpando lâminas de quartzo perfuradas e lamínulas com água e acetona. Em seguida, a lâmina é atacada com hidróxido de potássio e com a solução piranha para melhorar a qualidade da superfície.
Em seguida, as lâminas e lamínulas são funcionalizadas com grupos amina, seguidas por duas rodadas de ativação da superfície utilizando um polímero para tornar a superfície de vidro inerte. O passo final consiste em montar a câmara microfluídica a partir da lâmina e da lamínula, com as superfícies revestidas com polietilenoglicol ou pegiladas voltadas uma para a outra. Em última análise, uma nova estratégia de tratamento da superfície com moléculas de peg em duas rodadas melhora notavelmente a qualidade da passivação, conforme observado por microscopia de fluorescência de molécula única.
A principal vantagem desta técnica ou das técnicas existentes, como o revestimento polimérico após a gravação com óxido de potássio, é que este método garante qualidade superior. Pessoas novas neste método terão dificuldades, já que diversos tratamentos devem ser realizados. Para começar a perfurar, as lâminas de quartzo conforme detalhado no protocolo do texto.
Limpe as lâminas colocando-as em um frasco de vidro para coloração. Normalmente, de cinco a quinze lâminas podem ser colocadas em um único frasco. Em seguida, enxágue as lâminas com água UE após repetir o enxágue três vezes, sonique as lâminas com água UE por cinco minutos para remover a sujeira, descarte a água e enxágue as lâminas três vezes adicionais com água UE.
Em seguida, substitua a água UE por acetona e sonique as lâminas com acetona por 20 minutos ou mais, descarte a acetona e enxágue as lâminas com água Milli Q para remover qualquer resíduo de acetona. Em seguida, substitua a água por hidróxido de potássio 1 M e sonique as lâminas por 20 minutos ou mais. A ataque excessivo melhorará a qualidade da superfície, mas introduzirá arranhões que podem interferir na imagem de fluorescência.
Lave as lâminas com água Milli Q três vezes para remover traços de hidróxido de potássio antes de realizar a gravação com piranha. Transfira as lâminas para um suporte Duran ou um suporte personalizado de teflon e coloque-as em um béquer de um litro localizado dentro de uma capela de exaustão química. Encha o béquer com 450 mililitros de ácido sulfúrico.
Em seguida, adicione 150 mililitros de peróxido de hidrogênio para obter uma proporção de três para um entre ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Agite a solução para uma mistura adequada e deixe o béquer em repouso por 20 minutos. Retire as lâminas da solução piranha e coloque-as em um porta-lâminas contendo água Millieu.
Enquanto isso, descarte a solução de piranha em um frasco designado para resíduos. Uma vez que atinja a temperatura ambiente, enxágue as lâminas três vezes com água UE após a limpeza das lamínulas. Substitua a água UE nos recipientes de coloração por metanol. Mantenha as lâminas e as lamínulas em metanol.
Enquanto isso, prepare a solução de silanização amino despejando 100 mililitros de metanol no frasco. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético e três mililitros de 3-aminopropil-trimetoxissilano e misture suavemente agitando. Substitua o metanol nos recipientes de coloração contendo as lâminas e as lamínulas pela mistura de reação de silanização amino.
Incube por 20 a 30 minutos e, durante a incubação, sonique uma vez por um minuto. Em seguida, substitua a reação de aminoilização por metanol. Descarte então o metanol e adicione uma solução fresca de metanol.
Repita este procedimento três vezes para a primeira rodada de funcionalização da superfície. Usando primeiro o polímero, seque as lâminas e as lamínulas com gás nitrogênio. Em seguida, coloque-as em caixas limpas para pipetas parcialmente preenchidas com água Milli-Q, de modo que o lado que deve ser pegilado fique voltado para cima. A seguir, adicione 64 microlitros do tampão de reação recém-preparado a uma solução de peg preparada.
Pipete a mistura para cima e para baixo para dissolver completamente. Em seguida, centrifugue a 16.100 ×g por um minuto. Para remover bolhas de ar, adicione 70 microlitros da mistura de pegilação sobre uma lâmina de quartzo seca.
Coloque suavemente uma lamínula seca sobre a solução, e incube as lâminas em ambiente escuro e úmido por duas horas até a noite toda para armazenar as lâminas e lamínulas funcionalizadas com PEG. Desmonte cuidadosamente a lâmina e a lamínula deslizando a lamínula para o lado e enxaguando-as com água UE antes de secá-las com gás nitrogênio. Coloque um par de lâmina e lamínula em um tubo de 50 mililitros de modo que as superfícies funcionalizadas com PEG fiquem voltadas uma para longe da outra.
Feche parcialmente o tubo e submeta-o a vácuo antes de preenchê-lo com gás nitrogênio e apertar bem a tampa. Armazene-o a menos 20 graus Celsius. Esses passos ajudam a preservar a superfície pegilada por um longo período de tempo.
Realize uma segunda rodada de pegilação conforme descrito no protocolo textual imediatamente antes de usar a lâmina para montar uma câmara microfluídica. Coloque uma lâmina de quartzo sobre uma superfície plana com o lado pegilado voltado para cima. Faça um canal em diagonal na superfície pegilada colocando fita adesiva dupla face sobre a lâmina.
Certifique-se de que os orifícios estejam posicionados no centro do canal. Em seguida, coloque suavemente uma lamínula com revestimento pegilado por cima para completar a câmara, com o lado pegilado voltado para baixo.
Selar a câmara pressionando a lamínula sobre as áreas onde a fita dupla face está colocada. Faça isso suavemente, mas de forma completa, para que a câmara fique hermeticamente selada. Por fim, feche as bordas da câmara com cola de epóxi.
Prossiga para imobilizar estreptavidina ou neutravina e adicione moléculas biológicas biotiniladas para imagem de molécula única conforme descrito no protocolo textual. Se a funcionalização da superfície foi realizada com sucesso, observa-se menos de 10 proteínas absorvidas não especificamente por área de imagem. Quando uma a 10 nanomolares de proteína marcada com fluoróforo são adicionados à câmara, caso qualquer uma das etapas de limpeza ou reação não tenha sido adequadamente realizada, o número de proteínas absorvidas não especificamente aumenta significativamente. Por exemplo, se a etapa de ataque com piranha for omitida, observa-se 100 vezes mais absorção não específica.
A natureza superior da dupla pegilização é claramente demonstrada aqui. Os sinais de fundo provenientes de moléculas fluorescentes e da solução foram observados como muito mais fracos quando foi utilizada a dupla pegilização, conforme mostrado no painel esquerdo. Isso indica que as proteínas são repelidas de maneira mais eficaz pela camada duplamente pegilada.
Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro horas se for executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com AYA pode ser extremamente perigoso; precauções como luvas apropriadas, óculos de proteção e avental devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.
Visão Geral
Este artigo descreve um novo método para a passivação de superfícies de vidro utilizando polietileno glicol (PEG). O protocolo inclui limpeza da superfície, funcionalização e uma estratégia de revestimento com PEG em duas etapas que melhora a qualidade da passivação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Passivação de superfície
- Microfluídica
- Microscopia de fluorescência
Antecedentes
- A passivação é essencial para reduzir a ligação não específica em imagens de fluorescência.
- Métodos tradicionais podem não fornecer qualidade ideal da superfície.
- O PEG é conhecido por suas propriedades inertes, tornando-o adequado para esta aplicação.
- Tratamentos superficiais aprimorados podem melhorar os resultados experimentais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para limpeza e passivação de superfícies de vidro.
- Demonstrar a eficácia de um tratamento com PEG em duas etapas.
- Fornecer um protocolo detalhado para que os pesquisadores possam seguir.
Métodos Utilizados
- Limpeza de lâminas de quartzo com água e acetona.
- Gravação com hidróxido de potássio e solução piranha.
- Funcionalização das superfícies com grupos amina.
- Aplicação de PEG em duas etapas para garantir uma passivação de alta qualidade.
Resultados Principais
- O tratamento com PEG em duas etapas melhora significativamente a passivação da superfície.
- A microscopia de fluorescência de molécula única mostra redução na ligação não específica.
- A execução adequada do protocolo produz resultados ótimos.
- A falha em seguir os passos pode levar ao aumento da absorção não específica de proteínas.
Conclusões
- O método descrito fornece uma alternativa superior para a passivação de superfícies de vidro.
- Os pesquisadores podem obter melhores resultados de imagem com este protocolo.
- É essencial a atenção aos detalhes no processo de limpeza e tratamento.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O passivação da superfície é um fator essencial para estudos confiáveis de proteínas em nível de molécula única, impactando diretamente a qualidade dos dados em ensaios de interação com alvos. Um tratamento inadequado da superfície introduz ligações não específicas que dificultam a análise, comprometendo a interpretação mecanicista e aumentando as taxas de falsos positivos na descoberta inicial. Este protocolo aborda um gargalo técnico fundamental ao fornecer um método robusto e reprodutível para gerar superfícies inertes, melhorando assim a confiabilidade preditiva nos fluxos de trabalho subsequentes de triagem e validação.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação específica de interações proteína-proteína e proteína-ácido nucleico ao minimizar artefatos induzidos pela superfície.
- Valor Operacional: Fornece um método padronizado de preparação de superfície que reduz a variabilidade entre experimentos e laboratórios.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Apoia a prontidão do ensaio ao garantir fundo baixo (<10 proteínas absorvidas não especificamente por área de imagem) para medições precisas de ligação de ligantes.
- Valor Operacional: A estratégia de PEGilação em duas etapas melhora a uniformidade do revestimento, aumentando a reprodutibilidade em formatos de triagem de alto conteúdo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao permitir a quantificação precisa da cinética de ligação e das afinidades em sistemas relevantes para doenças.
- Valor Operacional: Permite o armazenamento prolongado de lâminas passivadas a -20°C, apoiando a preparação em lotes e a continuidade do fluxo de trabalho.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de passivação da superfície insere-se na fase inicial da descoberta, apoiando especificamente as etapas de validação de alvo e desenvolvimento de ensaios, ao fornecer uma base confiável para a imagem de molécula única.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses por meio da visualização clara de interações biomoleculares específicas, sem interferência da superfície.
- Triagem: Permite leituras quantitativas e reprodutíveis, essenciais para comparar os efeitos de compostos em triagens primárias e secundárias.
- Análise: Gera dados de fluorescência com fundo reduzido, melhorando a relação sinal-ruído e facilitando a análise estatística precisa de eventos de ligação.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica, garantindo que as interações observadas reflitam a biologia real e não artefatos do ensaio.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma padronizada de preparação de superfícies, aplicável a múltiplos projetos e classes de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir falsos positivos decorrentes de interações superficiais inespecíficas.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de um protocolo bem definido, passo a passo, com parâmetros claros de qualidade.
- Valor Estratégico: Apoia decisões mais assertivas de avanço ou interrupção do projeto ao melhorar a confiabilidade dos dados na avaliação inicial do alvo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco ao fornecer dados mecanicistas de maior qualidade para a seleção de compostos líderes.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em química de superfície e microscopia de fluorescência para executar corretamente os tratamentos em múltiplas etapas.
- Depende do acesso a equipamentos para manipulação da solução piranha e gás nitrogênio para secagem e armazenamento.
- Necessita treinamento padronizado para garantir a funcionalização com amina e a dupla PEGilação consistentes entre diferentes usuários.
- Deve ser adaptado a diferentes materiais de lâminas (por exemplo, quartzo versus vidro comum), mantendo a densidade de PEG e a qualidade da passivação.
- Limitado pela natureza perigosa da solução piranha, exigindo protocolos rigorosos de segurança e procedimentos de gerenciamento de resíduos.
