Passivação da superfície de Estudos de proteína única molécula
24 de abril de 2014
Descreve-se um método para passivação de uma superfície de vidro, usando polietilenoglicol (PEG). Este protocolo abrange limpeza de superfícies, funcionalização de superfície e revestimento PEG. Nós introduzimos uma nova estratégia para o tratamento da superfície com moléculas de PEG mais de dois rounds, que produz qualidade superior de passivação em relação aos métodos existentes.
O objetivo geral deste procedimento é produzir uma superfície de lâmina de quartzo de qualidade superior. Isso é feito limpando primeiro as lâminas de quartzo perfuradas e as lamínulas com água e acetona. Em seguida, a lâmina é gravada com hidróxido de potássio e a solução de piranha para melhorar a qualidade da superfície.
Em seguida, as lâminas e lamínulas são funcionalizadas com grupos amina seguidas por duas rodadas de superfície usando um polímero para tornar a superfície do vidro inerte. A etapa final é montar a câmara microfluídica a partir da lâmina e da lamínula com as superfícies revestidas ou peguiladas de polietilenoglicol voltadas uma para a outra. Em última análise, uma nova estratégia de tratar a superfície com moléculas de peg em duas rodadas melhora notavelmente a qualidade da passivação, conforme observado pela microscopia de fluorescência de molécula única.
A principal vantagem desta técnica ou das técnicas existentes, como o revestimento de polímero após a corrosão por óxido de potássio, é que esta técnica garante qualidade superior. As pessoas novas neste método terão dificuldades, pois vários tratamentos de serviço precisam ser realizados. Para começar a broca, o quartzo desliza conforme detalhado no protocolo de texto.
Limpe as lâminas colocando-as em um frasco de vidro para manchas. Normalmente, cinco a 15 lâminas podem ser colocadas em um único frasco. Em seguida, enxágue as lâminas com água UE após repetir o enxágue três vezes, sonice as lâminas com água UE por cinco minutos para remover a sujeira, descarte a água e enxágue as lâminas mais três vezes com água UE.
Em seguida, substitua a água UE por acetona e sonice as lâminas com acetona por 20 minutos ou mais, descarte a acetona e enxágue as lâminas com água Milli Q para remover qualquer resíduo de acetona. Em seguida, substitua a água por um hidróxido de potássio molar e sonice as lâminas por 20 minutos ou mais. A corrosão excessiva melhorará a qualidade da superfície, mas introduzirá arranhões que podem interferir na imagem de fluorescência.
Enxágue as lâminas com água Milli Q três vezes para remover vestígios de hidróxido de potássio para realizar a gravação de piranha. Transfira as lâminas para um suporte de lâminas Duran ou um suporte de Teflon feito sob medida e coloque-as em um copo de um litro localizado em um capuz químico. Encha o copo com 450 mililitros de ácido sulfúrico.
Em seguida, adicione 150 mililitros de peróxido de hidrogênio para uma proporção de três para um entre ácido sulfúrico e peróxido de hidrogênio. Agitar a solução para uma mistura adequada e deixar o copo intacto durante 20 minutos. Retire as lâminas da solução de piranha e coloque-as em um suporte de lâminas contendo água milieu.
Enquanto isso, descarte a solução de piranha em um frasco de lixo designado Quando atingir a temperatura ambiente, enxágue as lâminas três vezes com água UE após a limpeza da lamínula. Substitua a água UE nos pratos de coloração por metanol. Manter as lâminas e as lamínulas em metanol.
Enquanto isso, prepare a solução de ilhamento amino despejando 100 mililitros de metanol no frasco. Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido acético e três mililitros de três amino propil, trimetil e misture delicadamente agitando. Substituir o metanol nas placas de coloração que contêm as lâminas e as lamínulas pela mistura de reacção de aminossilização.
Incubar por 20 a 30 minutos durante a incubação sonicar uma vez por um minuto. Em seguida, substitua a reação de ilhagem amino por metanol. Em seguida, descarte o metanol e adicione uma solução de metanol nova.
Repetir este procedimento três vezes para a primeira ronda de superfície Utilizando primeiro o polímero, secar as lâminas e as lamínulas com gás azoto. Em seguida, coloque-os em caixas de pipeta limpas, parcialmente cheias de água mili Q, de forma que o lado que deve ser peguilado fique voltado para cima. Em seguida, adicione 64 microlitros do tampão de reação recém-preparado a uma solução de pino preparada.
Pipete a mistura para cima e para baixo para dissolver completamente. Em seguida, centrifugue a 16, 100 G durante um minuto. Para remover bolhas de ar, coloque 70 microlitros da mistura de peguilação em uma lâmina de quartzo seca.
Coloque delicadamente uma lamínula seca sobre a solução, incube as lâminas em um ambiente escuro e úmido por duas horas a durante a noite para armazenar as lâminas peguiladas e as lamínulas. Desmonte cuidadosamente a lâmina e a lamínula deslizando a lamínula para o lado e enxaguando-as com água UE antes de secá-las com gás nitrogênio. Coloque um par de lâminas e lamínulas em um tubo de 50 mililitros de forma que as superfícies peguiladas fiquem voltadas uma para a outra.
Feche parcialmente o tubo e aspire-o antes de enchê-lo com gás nitrogênio e apertar bem a tampa. Armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Essas etapas ajudam a preservar a superfície peguilada por um longo período de tempo.
Execute uma segunda rodada de peguilação conforme descrito no protocolo de texto imediatamente antes de usar o slide para montar uma câmara microfluídica. Coloque uma lâmina de quartzo em uma superfície plana com o lado peguilado voltado para cima. Faça um canal diagonalmente na superfície peguilada, colocando fita adesiva dupla face sobre o slide.
Certifique-se de que os orifícios estejam posicionados no centro do canal. Em seguida, coloque delicadamente uma lamínula peguilada no topo para completar a câmara. Com o lado peguilado voltado para baixo.
Sele a câmara pressionando a lamínula sobre as áreas onde a fita dupla face é colocada. Faça isso com cuidado, mas completamente, para que a câmara fique selada à prova d'água. Por fim, feche as bordas da câmara com cola epóxi.
Prossiga para imobilizar estreptavidina ou neto e adicione moléculas biológicas biotiniladas para imagem de molécula única, conforme descrito no protocolo de texto, se a superfície tiver sido feita com sucesso, há menos de 10 proteínas não especificamente absorvidas por área de imagem observada. Quando uma a 10 proteínas marcadas com fluorescência nanomolar são adicionadas à câmara, quando qualquer uma das etapas de limpeza ou reação não foi realizada adequadamente, o número de proteínas não especificamente absorvidas aumenta significativamente. Por exemplo, se a gravação da piranha for ignorada, há 100 vezes mais absorção não específica observada.
A natureza superior da dupla peguilação é mostrada com destaque aqui. Observou-se que os sinais de fundo das moléculas fluorescentes e da solução eram muito mais fracos quando a dupla peguilação era usada, conforme mostrado no painel esquerdo. Isso indica que as proteínas são repelidas de forma mais eficaz pela camada duplamente peguilada.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em quatro horas se executada corretamente. Não se esqueça de que trabalhar com AYA pode ser extremamente perigoso, precauções como luvas, óculos e avental adequados devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.
Visão Geral
Este artigo descreve um novo método para passivar superfícies de vidro usando polietilenoglicol (PEG). O protocolo inclui limpeza da superfície, funcionalização e uma estratégia de revestimento de PEG em duas etapas que melhora a qualidade da passivação.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Passivação de superfície
- Microfluidos
- Microscopia de fluorescência
Fundamentos
- A passivação é crucial para reduzir a ligação não específica em imagens de fluorescência.
- Métodos tradicionais podem não fornecer qualidade de superfície ideal.
- PEG é conhecido por suas propriedades inertes, tornando-o adequado para esta aplicação.
- Tratamentos de superfície aprimorados podem melhorar os resultados experimentais.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para limpeza e passivação de superfícies de vidro.
- Demonstrar a eficácia de um tratamento de PEG em duas etapas.
- Fornecer um protocolo detalhado para os pesquisadores seguirem.
Métodos Utilizados
- Limpeza de lâminas de quartzo com água e acetona.
- Gravação com hidróxido de potássio e solução piranha.
- Funcionalização das superfícies com grupos amina.
- Aplicação de PEG em duas etapas para garantir uma passivação de alta qualidade.
Principais Resultados
- O tratamento de PEG em duas etapas melhora significativamente a passivação da superfície.
- A microscopia de fluorescência de molécula única mostra redução na ligação não específica.
- A execução adequada do protocolo produz resultados ideais.
- Falha na execução dos passos pode levar ao aumento da absorção de proteínas não específicas.
Conclusões
- O método descrito fornece uma alternativa superior para a passivação de superfícies de vidro.
- Os pesquisadores podem obter melhores resultados de imagem com este protocolo.
- A atenção aos detalhes no processo de limpeza e tratamento é essencial.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Surface passivation is a critical enabler for reliable single-molecule protein studies, directly impacting data quality in target interaction assays. Inadequate surface treatment introduces confounding non-specific binding, undermining mechanistic interpretation and increasing false-positive rates in early discovery. This protocol addresses a key technical bottleneck by delivering a robust, reproducible method to generate inert surfaces, thereby improving predictive confidence in downstream screening and validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific observation of protein-protein and protein-nucleic acid interactions by minimizing surface-induced artifacts.
- Operational Value: Provides a standardized surface preparation method that reduces variability across experiments and laboratories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay readiness by ensuring low background (<10 non-specifically absorbed proteins per imaging area) for accurate ligand binding measurements.
- Operational Value: The two-round PEGylation strategy improves coating consistency, enhancing reproducibility in high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise quantification of binding kinetics and affinities in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables long-term storage of passivated slides at -20°C, supporting batch preparation and workflow continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This surface passivation method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages by providing a reliable foundation for single-molecule imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through clean visualization of specific biomolecular interactions without surface interference.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts essential for comparing compound effects in primary and secondary screens.
- Analytics: Generates low-background fluorescence data that improves signal-to-noise ratio, facilitating accurate statistical analysis of binding events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that observed interactions reflect true biology rather than assay artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surface preparation platform applicable across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives from non-specific surface interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through a well-defined, step-by-step protocol with clear quality benchmarks.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by improving data reliability in early-stage target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing higher-quality mechanistic data for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy to execute multi-step treatments correctly.
- Dependent on access to piranha solution handling equipment and nitrogen gas for drying and storage.
- Necessitates standardized training to ensure consistent amine functionalization and double PEGylation across users.
- Must be adapted to different slide materials (e.g., quartz vs. standard glass) while maintaining PEG density and passivation quality.
- Limited by the hazardous nature of piranha solution, requiring strict safety protocols and waste management procedures.
