Um Método para o cultivo embrionário

O objetivo geral deste procedimento é dissociar e cultivar in vitro células embrionárias de *Caenorhabditis elegans*. Isso é realizado primeiramente cultivando grandes quantidades de animais adultos. Em seguida, os ovos são isolados dos adultos.

Em seguida, os ovos são tratados com quitinase para dissolver a casca do ovo. Por fim, as células são dissociadas manualmente e semeadas para cultivo. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram a expressão de marcadores específicos de células por meio de técnicas de imunofluorescência, microscopia, eletrofisiologia e imageamento de cálcio.

Demonstrará o procedimento rel ti, um pós-doutorando do laboratório mal. Após cultivar pelo menos quatro placas de sea elegance até o estágio adulto GR e preparar os meios e soluções de acordo com o protocolo descrito no texto. Inicie o isolamento de ovos primeiramente descongelando um tubo de solução estoque de lectina de amendoim previamente preparada.

Coloque lamínulas autoclavadas nas cavidades de uma placa de 24 poços e adicione 200 microlitros de lectina de amendoim a cada lamínula; incube por pelo menos uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução e use água estéril para lavar as cavidades. Remova completamente todos os vestígios de lectina de amendoim para evitar agregação celular.

Em seguida, utilizando água estéril de autoclave, lave os adultos de GR das placas de ágar e colete a suspensão em dois tubos cónicos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos sobre gelo por até cinco minutos para permitir que os vermes sedimentem no fundo. Com uma pipeta de transferência, remova a água e substitua por água estéril de autoclave fresca. Centrifugue os vermes a 200 ×g durante 10 minutos.

Após a última lavagem, re-suspenda os vermes em água estéril fresca e transfira-os para um tubo cônico estéril de 15 mililitros antes de centrifugar novamente a 200 ×g por 10 minutos. Se os vermes não forem completamente sedimentados, coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Uma vez que os vermes estejam completamente sedimentados, remova a água e adicione de cinco a seis mililitros de solução de lise.

Em seguida, agite suavemente a suspensão por cinco a 10 minutos e, a cada dois a três minutos, coloque uma gota da suspensão sobre uma lamínula e verifique a lise ao microscópio estereoscópico. Quando 72 a 80% dos vermes estiverem lisados, interrompa a reação de lise adicionando nove mililitros de tampão para ovos; a partir desse momento, acenda um bico de Bunsen e mantenha-o aceso para evitar recontaminação dos ovos, remova cuidadosamente o sobrenadante e use o tampão para ovos para lavar completamente o pellet três a quatro vezes até que a solução fique límpida. Em seguida, após remover o sobrenadante final para separar os ovos das carcaças dos animais, ressuspenda o pellet em dois mililitros de tampão estéril para ovos e adicione dois mililitros de sacarose a 60% em tampão para ovos.

Misture bem os ovos na solução antes de centrifugar por 20 minutos. A 200 G, retire cuidadosamente os tubos da centrífuga. Os ovos estarão flutuando na parte superior da solução.

Portanto, utilize um pipetador e ponteiras estéreis de um mililitro para transferir os ovos para um novo tubo cônico estéril de 15 mililitros. Use tampão estéril para ovos para lavar os ovos três vezes, trabalhando sob uma cabine de fluxo laminar. Para evitar a introdução de contaminação bacteriana, ressuspenda os ovos em pellet em um mililitro de quinase a dois miligramas por mililitro e transfira-os para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Agite o tubo por 10 a 30 minutos à temperatura ambiente, dependendo da frescura da enzima, até que aproximadamente 80% das cascas dos ovos sejam digeridas. Centrifugue os ovos a 900 ×g por três minutos. Após remover cuidadosamente o sobrenatante, adicione três mililitros de meio L 15, transfira os ovos para uma placa com diâmetro de seis centímetros e inicie a dissociação manual usando uma seringa estéril de 10 mililitros com agulha de 18 gauge.

Para monitorar o grau de dissociação, coloque uma gota da suspensão em uma nova placa de Petri e observe ao microscópio. Continue até que aproximadamente 80% das células estejam dissociadas. Para remover agregados celulares, ovos não digeridos e larvas eclodidas, filtre suavemente a suspensão através de um filtro de cinco mícrons e passe mais quatro a cinco mililitros do meio L 15 pelo filtro para recuperar as células e cultivá-las.

Após centrifugar o filtrado a 900 ×g por três minutos, ressuspenda as células em meio L 15 completo, adicionando um mililitro por poço, e armazene as placas em uma câmara selada e úmida a 20 graus Celsius em ar ambiente. Para diferenciar, as células isoladas de elegans devem aderir a um substrato. O processo de diferenciação começa cerca de duas a três horas após a semeadura e continua por aproximadamente 24 horas.

As características morfológicas in vitro são notavelmente semelhantes às in vivo. Por exemplo, como mostrado aqui, neurônios sensoriais LM e PLM desenvolvem apenas dois processos neuronais, sendo um mais longo que o outro, tal como ocorre in vivo. Isso sugere que pelo menos alguns dos mecanismos moleculares que impulsionam a diferenciação em células de elegans são autônomos em relação à célula e, portanto, podem ser recapitulados.

Os marcadores proteicos in vitro e as modificações pós-traducionais específicas de células também podem ser observados in vitro. Por exemplo, a alfa tubulina é acetilada apenas em neurônios táteis de ouriço-do-mar, conforme mostrado aqui, nos processos in vitro de neurônios táteis que se coram com um anticorpo produzido contra a alfa tubulina acetilada. Além disso, como visto neste painel, neurônios táteis cultivados expressam o canal mutante tóxico MEC quatro D, que causa a morte dos neurônios táteis in vivo.

Neurônios que expressam GFP preparados a partir de uma linhagem MEC quatro DPE 4G FP estão inicialmente presentes em cultura, mas posteriormente degeneram. No entanto, assim como in vivo, as células podem ser resgatadas da morte por meio do tratamento com um IDE e dantrolene, conforme mostrado aqui. Técnicas de patch clamp são utilizadas para estudar canais dependentes de potássio iônicos, não seletivos e dependentes do transportador de dopamina em células cultivadas de elgãs marinhas.

Devido ao pequeno tamanho da célula, as pipetas de vidro devem ter uma ponta fina e, em seguida, um cone largo para compensar o aumento da resistência de entrada. Além disso, obtém-se maior sucesso ao aplicar um impulso de alta voltagem na membrana sob a ponta da pipeta, em vez de obter acesso à célula inteira por sucção, o que pode danificar a célula. Nesta figura, para estudar o papel dos canais de cálcio ativados por voltagem, o ION four é usado para perfurar a membrana e calibrar neurônios sensoriais que expressam a proteína indicadora de cálcio chameleon YC two point 12, na ausência ou presença de cálcio.

Além disso, determinou-se que a concentração média de cálcio livre em neurônios táteis é de 200 nanomolar. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar células embrionárias de C. elegans in vitro.