Um Método para o cultivo embrionário C. elegans Células

O objetivo geral deste procedimento é dissociar e cultivar células in vitro, embrionárias e elegantes do mar. Isso é conseguido primeiro cultivando grandes quantidades de animais graves. Em seguida, os ovos são isolados dos adultos.

Em seguida, os ovos são tratados com quitinase para dissolver a casca do ovo. Finalmente, as células são dissociadas manualmente e plaqueadas para cultura. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a expressão de marcadores específicos de células por meio de imunofluorescência, microscopia, eletrofisiologia e técnicas de imagem de cálcio.

Demonstrando o procedimento estará relacionado, um laboratório de pós-doutorado. Depois de cultivar pelo menos quatro placas de elegância do mar até o estágio adulto de GR e preparar meios e soluções de acordo com o protocolo de texto. Comece o isolamento do ovo primeiro hawing um tubo de solução de estoque de lectina de amendoim previamente preparada.

Coloque lamínulas de autoclave nos poços de uma placa de 24 poços e adicione 200 microlitros de lectina de amendoim a cada lamínula incubar por pelo menos uma hora em temperatura ambiente. Em seguida, aspire a solução e use água estéril para lavar os poços. Depois de remover todos os vestígios de lectina de amendoim para evitar a aglomeração celular.

Em seguida, usando água de autoclave estéril, lave os adultos GR das placas de ágar e recolha a suspensão em dois tubos cônicos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos no gelo por até cinco minutos para permitir que os vermes se depositem no fundo Com uma pipeta de transferência, remova a água e substitua-a por uma centrífuga de água em autoclave fresca e estéril. Os vermes a 200 G por 10 minutos.

Após a lavagem final, suspenda os vermes em água fresca estéril e transfira-os para um tubo cônico estéril de 15 mililitros antes de girar novamente a 200 G por 10 minutos. Se os vermes não estiverem completamente peletizados, coloque o tubo no gelo por cinco minutos. Quando os vermes estiverem completamente assentados, remova a água e adicione cinco a seis mililitros de solução de lise.

Em seguida, balance suavemente a suspensão por cinco a 10 minutos e, a cada dois ou três minutos, coloque uma gota de suspensão em uma lamínula e verifique se há lise em um microscópio estéreo. Quando 72 80% dos vermes forem lisados, pare a reação de lise adicionando nove mililitros de tampão de ovo antes de girar deste ponto para frente, acenda um bico de bunsen e mantenha-o ligado para evitar a recontaminação dos ovos, remova cuidadosamente o sobrenadante e use tampão de ovo para lavar completamente o pellet três a quatro vezes até que a solução esteja limpa. Em seguida, após remover o sobrenadante final para separar os ovos das carcaças de animais resus, suspenda o pellet em dois mililitros de tampão de ovo estéril e adicione dois mililitros de sacarose a 60% no tampão de ovo.

Misture bem os ovos na solução antes de centrifugar por 20 minutos. A 200 G, remova cuidadosamente os tubos da centrífuga. Os ovos estarão flutuando no topo da solução.

Portanto, use uma pipetadora e pontas estéreis de um mililitro para transferir os ovos para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Use tampão de ovo estéril para lavar os ovos três vezes enquanto trabalha sob uma capa de fluxo laminar. Para evitar a introdução de contaminação bacteriana, suspenda os ovos peletizados em um mililitro de dois miligramas por mililitro de quinase e transfira-os para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Balance o tubo por 10 a 30 minutos em temperatura ambiente, dependendo do frescor da enzima quando aproximadamente 80% das cascas dos ovos são digeridas. Centrifugue os ovos a 900 G durante três minutos. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, adicione três mililitros de meio L 15, transfira os ovos para uma placa de seis centímetros de diâmetro e inicie a dissociação manual usando uma seringa estéril de 10 mililitros com uma agulha de calibre 18.

Para monitorar o grau de dissociação, coloque uma gota de suspensão em uma placa de Petri fresca e veja ao microscópio. Continue até que aproximadamente 80% das células estejam dissociadas. Para remover nódulos celulares, ovos não digeridos e larvas eclodidas, filtre suavemente a suspensão através de um filtro de cinco mícrons e passe mais quatro a cinco mililitros de meio L 15 pelo filtro para recuperar as células para cultivar as células.

Depois de centrifugar o filtrado a 900 G por três minutos, suspender as células em meio L 15 completo jogado um mililitro por poço e armazenar as placas em uma câmara úmida selada a 20 graus Celsius em ar ambiente. Para diferenciar as células elegan embrionárias isoladas, as células devem aderir a um substrato. O processo de diferenciação começa cerca de duas a três horas após o revestimento e continua por cerca de 24 horas.

As características morfológicas in vitro são notavelmente semelhantes às in vivo. Por exemplo, como mostrado aqui, um neurônio de toque LM e PLM desenvolve apenas dois processos neuronais com um mais longo que o outro, como fazem in vivo. Isso sugere que pelo menos alguns dos mecanismos moleculares que impulsionam a diferenciação nas células elegan são autônomos e, portanto, podem ser recapitulados.

Marcadores proteicos in vitro e modificações pós-traducionais específicas da célula também podem ser observados in vitro. Por exemplo, a tubulina alfa é um saciado apenas em neurônios de toque em sea elgan, como mostrado aqui in vitro processos de neurônios de toque coram com um anticorpo levantado contra uma tubulina alfa saciada. E, além disso, como visto neste painel, os neurônios de toque cultivados expressam o canal mutante tóxico MEC quatro D, que causa a morte de neurônios de toque in vivo.

Os neurônios que expressam GFP preparados a partir de uma cepa MEC quatro DPE 4G FP estão inicialmente presentes em cultura, mas depois degeneram. No entanto, assim como in vivo, as células podem ser resgatadas da morte por tratamento com IDE e dantroleno, como mostrado aqui. Técnicas de patch clamp são usadas para estudar canais de potássio crônico, crônico, não seletivo e dependente de transportadores de dopamina em células cultivadas de elgan do mar.

Devido ao tamanho pequeno da célula, as pipetas de vidro devem ter uma ponta pequena e, em seguida, um cone largo para compensar o aumento da resistência de entrada. Além disso, um maior sucesso é alcançado aplicando um impulso de alta tensão ao remendo de membrana sob a ponta da pipeta em vez de obter acesso a toda a célula por meio de sucção que pode danificar a célula. Nesta figura para estudar o papel dos canais de cálcio dependentes de voltagem, o ION quatro é usado para permanenteizar a membrana e calibrar os neurônios de toque que expressam o camaleão YC dois pontos 12 para imagens de cálcio na ausência ou presença de cálcio.

Além disso, foi determinado que a concentração média de cálcio livre nos neurônios de toque é de 200 nanomolares molares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e cultivar in vitro. Veja elegância, células embrionárias.