Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Este procedimento localiza espacialmente vários lipídios endógenos dentro de uma lente bovina. Usando a técnica de ionização de dessorção a laser assistida por matriz, imagem por espectrometria de massa. Primeiro, prepare uma seção fina de tecido de lente bovina e aplique um multi matrixx, depois adquira um conjunto de dados espectrais de massa maldi.

Processe o conjunto de dados em uma representação visual dos lipídios detectados na seção de tecido do cristalino. Juntos, esses resultados podem determinar a localização e a abundância relativa dos lipídios dentro de uma lente bovina e produzir uma representação visual dessa distribuição Em comparação com outros métodos, como extração de lipídios seguida de análise LCMS, a imagem por espectrometria de massa maldi permite a visualização de vários lipídios simultaneamente sem perder sua localização espacial. Remova as amostras de tecido congeladas rapidamente do armazenamento de 80 graus Celsius negativos.

Remova a cápsula da superfície da lente para fixar uma seção inteira da lente de bezerro bovino. Coloque uma ou duas gotas de água no estágio de corte de tecido de um criostato. Coloque rapidamente a lente na água antes que ela solidifique quando o criostato estiver equilibrado até a temperatura ideal.

Corte o tecido equatorialmente em seções de 20 mícrons de espessura. Descarte as primeiras seções de tecido e use apenas fatias próximas ou adicionadas ao plano equatorial para obter imagens do tecido da lente ocular. Adicione 1,5 microlitros de ácido fórmico para pré-umedecer a superfície de uma lâmina de vidro revestida com ITO.

Em seguida, transfira cuidadosamente as seções de tecido para a lâmina dentro do criostato. Em seguida, liofilize as lâminas por 15 minutos antes da aplicação da matriz maldi. Usando uma caneta de fluido corretivo, adicione três marcas de ensino na superfície não condutora da lâmina de vidro revestida com ITO.

Agora tire uma imagem óptica da lâmina de tecido usando um scanner de mesa e salve-a em um formato apropriado, como TIFF ou jpeg. Primeiro, cubra as bordas da superfície frontal das lâminas de vidro revestidas com ITO com fita adesiva para que a matriz não cubra as bordas da lâmina. Preparar a matriz a utilizar num solvente adequado.

Em seguida, aplique soluções de matriz nas superfícies das seções de tecido. Cubra a lâmina de vidro usando 20 ciclos de revestimento de matriz. Alternativamente, um pulverizador de aerógrafo assistido pneumaticamente pode ser usado para aplicar as matrizes se um solvente for incompatível com o pulverizador de matriz eletrônica.

Para a solução de calibração de massa, dilua a solução padrão da mistura de sintonia ES por um fator de um a 200 em 60% O isopropanol introduziu dois microlitros por minuto da solução diluída da mistura de sintonia ES na fonte de íons de ionização por eletrospray de modo duplo no instrumento por quatro ms de ressonância ciclotron de íons de transformação. Opere o instrumento FTIC no modo ESI de íons positivos com detecção de banda larga e um tamanho de aquisição de dados de 1024 kilobytes por segundo. Normalmente defina os parâmetros ESI de 3, 900 volts de tensão de eletropulverização capilar.

Uma tensão de proteção de pulverização de 3.600 volts de fluxo de gás nitrogênio do nebulizador a dois litros por minuto. Fluxo de gás nitrogênio seco a quatro litros por minuto e temperatura de 200 graus Celsius. Defina também o skimmer em um voltage para 15 volts.

Tempo de vôo para 0,01 segundos, fluxo de gás argônio de colisão para 0,4 litros por segundo, tempo de acumulação de íons de fonte para 0,1 segundo e o tempo de acumulação de íons da célula de colisão para 0,2 segundos. Agora ajuste os parâmetros de operação F-T-I-C-R para maximizar a sensibilidade analítica na faixa de massa da relação de massa para carga de 200 a 1400, mantendo bons sinais de decaimento por indução livre no domínio do tempo. Em seguida, adquira os espectros de massa ESI e calibre o instrumento usando as massas de referência dos compostos padrão na solução de mistura de ajuste E es.

Para ajustar o instrumento para operação MALDI, dissolva várias alíquotas de um microlitro de uma solução padrão mista de turina e INE na solução de matriz a uma concentração de um micromolar cada e coloque essas soluções diretamente em uma das seções de tecido da amostra. Coloque a lâmina em um adaptador de lâmina de tecido e carregue o adaptador do lado MALDI na fonte dupla de íons de maldi ESI. Em seguida, otimize os parâmetros operacionais MALDI apropriados para a potência do laser e o número de disparos de laser para o acúmulo de sinal MALDI para cada varredura em massa.

Depois de ajustar, calibrar e otimizar o instrumento para experimentos maldi MSI, alinhe a localização física de uma seção de tecido a ser fotografada com sua imagem óptica gravada no software de imagem. Alinhe as três marcações do fluido de correção usando um método de triangulação de três pontos. Em seguida, inicie uma operação ESI MALDI simultânea para que cada espectro de massa contenha os picos de massa de referência da solução de mistura de ajuste E ES para calibração de massa interna pós-aquisição.

Primeiro, atenue o sinal ESI diminuindo a tensão capilar até que os sinais MALDI dominem os espectros, enquanto os sinais de calibre ESI ainda são altos o suficiente para calibração de massa interna. Em seguida, configure um método de rasing automatizado para laser de radiação. Usando uma análise de ponto aleatório.

Defina as regiões de tecido a serem fotografadas e defina o tamanho apropriado do passo de RA do laser. Calibre os espectros de massa MALDI usando calibração interna para a comparação inicial e selecione picos para MSMS de isótopo e selecione os picos mono isotópicos usando um script VBA personalizado e exporte as listas de picos mono isotópicos resultantes. Insira os valores medidos de massa para razão de carga nos bancos de dados de metaboloma Melin nine e/ou HMDB para correspondência de massa com as entradas da biblioteca.

Em seguida, gere imagens maldi para todas as entidades lipídicas detectadas em toda a seção do tecido usando um software de imagem com uma largura de filtro de massa de uma parte por milhão no ápice máximo. Uma vez que as imagens tenham sido geradas para todos os valores de razão massa/carga que correspondem às entradas do banco de dados, gere imagens para todos os outros picos, bem como para procurar padrões de distribuição exclusivos que possam ser investigados posteriormente para alguns tecidos específicos, como o cristalino bovino. O rasgo extenso do tecido é frequentemente observado quando a montagem direta de descongelamento é usada.

O preço da lâmina IT OAS com etanol ou ácido fórmico ajuda a manter a integridade das seções de tecido durante a montagem do tecido. Tanto a escolha da matriz quanto a seleção do solvente são fatores importantes que influenciam a qualidade dos espectros MANDI. Esses exemplos comparam um espectro produzido com um solvente de matriz eficiente com uma má escolha de solvente de matriz para diol.

Uma vez que o conjunto de espectros de massa de um experimento Maldi MSI tenha sido adquirido, a imagem para cada um dos íons detectados pode ser gerada. Com cada pixel representando um ponto de irradiação de laser da superfície de uma seção de tecido. As concentrações relativas dos analitos podem ser detalhadas nas diferentes porções da seção de tecido.

Na maioria dos experimentos, os dados são normalizados a corrente total de íons dentro de cada espectro. Sem essas áreas de normalização com melhor matriz de analitos, a cristalização de COC poderia causar sinais mais fortes para os analitos, e isso distorceria os dados. A preparação do tecido também pode alterar drasticamente a imagem gerada.

Se a amostra estiver muito úmida, os analitos se deslocarão no tecido e grande parte da informação espacial será perdida. Esta demonstração de um experimento de imagem de tecido em lente ocular usou diol como um multi Matrixx para determinar a distribuição espacial de lipídios por F-T-I-C-R-M-S. A imagem de lipídios em diferentes tipos de tecido pode ser realizada usando diol ou outra matriz de maneira semelhante.