Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Este procedimento localiza espacialmente múltiplos lipídios endógenos dentro de uma lente bovina. Utilizando a técnica de ionização por dessorção a laser assistida por matriz, com imageamento por espectrometria de massas. Primeiro, prepare uma seção fina de tecido de lente bovina e aplique uma multimatriz, então adquira um conjunto de dados espectrais de massas maldi.

Processe o conjunto de dados para obter uma representação visual dos lipídios detectados no corte de tecido da lente. Juntos, esses resultados podem determinar a localização e a abundância relativa dos lipídios dentro de uma lente bovina e produzir uma representação visual dessa distribuição. Em comparação com outros métodos, como a extração de lipídios seguida de análise por LCMS, a espectrometria de massas por maldi com imagem permite a visualização simultânea de múltiplos lipídios sem perder sua localização espacial. Remova as amostras de tecido congeladas rapidamente do armazenamento a menos 80 graus Celsius.

Remova a cápsula da superfície da lente para fixar uma seção inteira de lente de bezerro bovino. Coloque uma ou duas gotas de água no estágio de corte de tecidos de um criostato. Coloque rapidamente a lente na água antes que ela solidifique, quando o criostato atingir a temperatura ideal.

Corte o tecido em secções de 20 mícrons de espessura no plano equatorial. Descarte as primeiras secções do tecido e utilize apenas fatias próximas ou que incluam o plano equatorial para a imagem do tecido da lente ocular. Adicione 1,5 microlitros de ácido fórmico para pré-umedecer a superfície de uma lâmina de vidro revestida com ITO.

Em seguida, transfira cuidadosamente as secções de tecido para a lâmina dentro do criostato. A seguir, liofilize as lâminas por 15 minutos antes da aplicação da matriz MALDI. Usando uma caneta de tinta corretiva, adicione três marcas de alinhamento na superfície não condutora da lâmina de vidro revestida com ITO.

Agora, obtenha uma imagem óptica da lâmina de tecido utilizando um scanner de mesa e salve-a em um formato apropriado, como TIFF ou jpeg. Primeiro, cubra as bordas da superfície frontal das lâminas de vidro revestidas com ITO usando fita, para que a matriz não recubra as bordas da lâmina. Prepare a matriz para ser usada em um solvente apropriado.

Em seguida, aplique soluções de matriz às superfícies das seções de tecido. Revesta a lâmina de vidro utilizando 20 ciclos de revestimento com a matriz. Alternativamente, um pulverizador pneumático pode ser usado para aplicar as matrizes, caso um solvente seja incompatível com o pulverizador eletrônico de matriz.

Para a solução de calibração de massa, dilua a solução padrão de mistura de ajuste ES em um fator de um para 200 em 60% de isopropanol. Introduza dois microlitros por minuto da solução diluída de mistura de ajuste ES na fonte de ionização por eletrosspray em modo dual do instrumento para espectrometria de ressonância ciclotrônica de íons com transformada de Fourier. Opere o instrumento F-T-I-C-R no modo ESI de íons positivos com detecção ampla e um tamanho de aquisição de dados de 1024 kilobytes por segundo. Geralmente, ajuste os parâmetros ESI para uma tensão de eletrosspray na cápsula de 3.900 volts.

Uma tensão de 3.600 volts para o escudo de pulverização, fluxo de gás nitrogênio nebulizador a dois litros por minuto. Fluxo de gás nitrogênio seco a quatro litros por minuto e temperatura de 200 graus Celsius. Ajuste também a tensão do skimmer um para 15 volts.

Tempo de voo de 0,01 segundos, fluxo de gás argônio de colisão de 0,4 litros por segundo, tempo de acumulação de íons na fonte de 0,1 segundo e tempo de acumulação de íons na célula de colisão de 0,2 segundos. Ajuste agora os parâmetros de operação do F-T-I-C-R para maximizar a sensibilidade analítica na faixa de massa de relação massa/carga de 200 a 1400, mantendo bons sinais de decaimento por indução livre no domínio do tempo. Em seguida, adquira os espectros de massa por ESI e calibre o instrumento utilizando as massas de referência dos compostos padrão na solução de mistura de ajuste E es.

Para calibrar o instrumento para operação MALDI, dissolva várias alíquotas de um microlitro de uma solução padrão mista de turina e INE na solução de matriz numa concentração de um micromolar cada e aplique essas soluções diretamente sobre uma das seções de tecido amostral. Coloque a lâmina em um adaptador para lâminas de tecido e insira o adaptador, pelo lado MALDI, na fonte iônica dual ESI-MALDI. Em seguida, otimize os parâmetros operacionais apropriados do MALDI para a potência do laser e o número de disparos a laser para a acumulação do sinal MALDI em cada varredura de massa.

Após ajustar, calibrar e otimizar o instrumento para experimentos de IMS MALDI, alinhe a localização física de uma seção de tecido a ser imageada com sua imagem óptica registrada dentro do software de imageamento. Alinhe as três marcações de corretivo líquido utilizando um método de triangulação de três pontos. Em seguida, inicie uma operação simultânea de ESI MALDI para que cada espectro de massas contenha os picos de massa de referência da solução de mistura de ajuste E ES para calibração interna de massa pós-aquisição.

Primeiro, atenue o sinal ESI diminuindo a tensão do capilar até que os sinais MALDI dominem os espectros, enquanto os sinais de calibração de massa interna do ESI ainda estiverem suficientemente altos. Em seguida, configure um método automatizado de aumento da radiação a laser. Utilizando uma análise em pontos aleatórios.

Defina as regiões do tecido a serem imageadas e ajuste o tamanho apropriado do passo do RA do laser. Calibre os espectros de massa MALDI utilizando calibração interna para a comparação inicial e selecione os picos para desisotopia em MS/MS e selecione os picos mono-isotópicos usando um script personalizado em VBA e exporte as listas resultantes de picos mono-isotópicos. Insira os valores medidos da razão massa/carga nos bancos de dados de metabolômica Melin nine e/ou HMDB para correspondência de massas com as entradas da biblioteca.

Em seguida, gere imagens MALDI para todas as entidades lipídicas detectadas em toda a seção do tecido utilizando um software de imageamento com largura de filtro de massa de uma parte por milhão no ápice do pico. Após gerar imagens para todos os valores de razão massa/carga que correspondam às entradas do banco de dados, gere também imagens para todos os demais picos a fim de identificar padrões de distribuição únicos que possam ser investigados posteriormente em tecidos específicos, como o cristalino de bovino. Frequentemente observa-se extenso rasgo do tecido quando é utilizada a montagem por descongelamento direto.

O pré-tratamento do lâmina IT OAS com etanol ou ácido fórmico ajuda a manter a integridade das seções de tecido durante a montagem do tecido. Tanto a escolha da matriz quanto a seleção do solvente são fatores importantes que influenciam a qualidade dos espectros MALDI. Esses exemplos comparam um espectro produzido com um solvente de matriz eficiente com uma escolha inadequada de solvente de matriz para diol.

Uma vez que o conjunto de espectros de massa de um experimento de IMS por MALDI tenha sido adquirido, a imagem de cada um dos íons detectados pode ser gerada, com cada pixel representando um ponto de irradiação a laser da superfície de uma seção de tecido. As concentrações relativas dos analitos podem ser detalhadas nas diferentes porções da seção de tecido.

Na maioria dos experimentos, os dados são normalizados pela corrente iônica total dentro de cada espectro. Sem essa normalização, áreas com melhor matriz analítica, como a cristalização de COC, poderiam gerar sinais mais intensos para os analitos, o que distorceria os dados. A preparação do tecido também pode alterar drasticamente a imagem gerada.

Se a amostra estiver muito úmida, os analitos se delocalizarão no tecido e grande parte da informação espacial será perdida. Esta demonstração de um experimento de imageamento de tecidos em lente ocular utilizou diol como uma matriz múltipla para determinar a distribuição espacial de lipídios por F-T-I-C-R-M-S. O imageamento de lipídios em diferentes tipos de tecidos pode ser realizado usando diol ou outra matriz de maneira semelhante.