Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D ¹H

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura de um peptídeo mimético da proteína chaperona Metallo complexado com cobre. Isso é feito preparando primeiro a amostra em um ambiente livre de oxigênio. O segundo passo é adquirir os dados de ressonância magnética nuclear ou espectroscopia de RMN mostrando interações entre átomos de hidrogênio.

Em seguida, as interações espaciais são mapeadas em um modelo de peptídeo linear. A etapa final é encontrar uma estrutura representativa de baixa energia que se ajuste aos dados. Em última análise, as estruturas derivadas de RMN são usadas para determinar o modo de ligação e realizar análises estruturais no complexo ligado ao cobre.

A principal vantagem dessa técnica sobre as técnicas existentes, como a cristalografia de raios-x, é que você pode usá-la para observar complexos de ligação semanais e também moléculas e complexos que não cristalizam. Embora este método possa fornecer informações sobre as proteínas de ligação ao cobre. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras placas de metal, para estudar como as proteínas permitem a entrega segura de íons metálicos essenciais, mas potencialmente tóxicos, no ambiente da linha celular.

Para começar a preparar amostras em um ambiente livre de oxigênio para evitar que o cobre oxide, para preparar a amostra APO, dissolva aproximadamente um a dois miligramas do peptídeo em 450 a 500 microlitros de solvente de grau NMR deuterado para a amostra reagida com cobre, dissolva a mesma quantidade que o peptídeo APO com uma quantidade molar EQU de sal metálico em 450 a 500. Microlitros do solvente de RMN filtram cada solução usando um papel de filtração de vidro central ou qualquer outra técnica que se adapte aos compostos sob investigação e não os absorva. Isso é essencial para remover quaisquer partículas metálicas, o que afetará a homogeneidade.

Transfira as soluções para tubos de RMN e feche as amostras nos tubos. Antes de sair do porta-luvas, retire as amostras do porta-luvas e feche-as. Registre os espectros de prótons unidimensionais do APO e amostras reagidas com cobre na máquina de RMN e compare.

O peptídeo APO é flexível e apresenta uma média de confirmações, mas ao reagir com o cobre, as amidas peptídicas ligadas têm uma estrutura mais rígida. Portanto, o espectro peptídico contendo cobre deve mostrar uma mudança significativa no deslocamento químico na região da amida, e os picos podem ser resolvidos. Configure experimentos de RMN otimizados, aconchegantes, intrometidos ou rosados sob condições idênticas às descritas no protocolo de texto e execute em sequência.

Execute experimentos unidimensionais entre cada experimento para garantir que a composição da amostra permaneça constante durante a aquisição de dados. Depois de processar os dados conforme discutido no protocolo de texto, prepare um conjunto de espectros aconchegantes e para sobrepostos ao espectro noea e rosado. Para atribuir todos os picos NOE no espectro.

Comece atribuindo picos que se sobrepõem aos sinais de toxis na região da impressão digital. Como isso facilitará as entradas subsequentes de atribuição de pico com o registro do programa Sparky, os picos atribuídos traduzem os valores de acoplamento de H alfa em amida em ângulos dedal. Traduza também picos em restrições de distância, integrando os picos de dentro do programa e traduzindo-os usando uma interação de distância conhecida.

Se os picos se sobrepõem ou os métodos de integração automática não podem ser usados, os picos podem ser rotulados como fortes, médios, fracos ou muito fracos por estimativa visual, e essas designações podem ser traduzidas em distâncias de até 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 angstroms, respectivamente. Importe as restrições de distância e os ângulos dedal com o formato correto para explorar. O Explore pesquisará o espaço de confirmação para encontrar estruturas que aderem à geometria química canônica.

Além das restrições de distância encontradas experimentalmente para gerar um conjunto no qual nenhum desses parâmetros é violado. Isso constituirá o conjunto inicial. Execute a primeira execução de determinação da estrutura sem usar nenhuma restrição ao metal para descobrir quais resíduos participam da ligação do metal sem qualquer viés.

Introduza as restrições gradualmente para facilitar a identificação de erros na atribuição, bem como na energia NOE e nos parâmetros de ajoelhamento simulados, conforme descrito no protocolo de texto, antes de minimizar as estruturas usando a minimização da energia do gradiente conjugado para 4.000 iterações, crie um conjunto final de geralmente 50 membros realizando a introdução de restrições de forma iterativa em todo o conjunto, relate o número de cada tipo de interação NOE encontrada. Por fim, crie um conjunto de estruturas que aderem à geometria química canônica e ao relatório de restrições empíricas derivadas de RMN. O número total de confirmações, o número delas que têm violações das restrições NM Rived e o RMSD de todo o conjunto, incluindo o backbone e todos os valores RMSD de átomos pesados.

Analise o conjunto de baixa energia e determine quais cadeias laterais residuais estão corretas próximas umas das outras para poder ligar o íon metálico. Uma vez determinados, repita a análise, incluindo os dados de ligação de cobre. Além das restrições de distância derivadas de RMN, agora adicione restrições de ligação de metal aos resíduos determinados.

Adicione parâmetros apropriados para descrever o íon metálico e sua topologia. Insira as informações físicas apropriadas, como comprimentos de ligação de massa com outros átomos, ângulos e parâmetros de repulsão não ligantes no arquivo de parâmetros. Adicione as informações de associação ao arquivo de topologia.

Essas informações incluem quais títulos são formados e quebrados e quais encargos formais são alterados como resultado da vinculação. Finalmente, adquira um conjunto de estruturas como antes o conjunto resolvido representa o espaço de confirmação adotado pelo peptídeo. Durante a medição de RMN, importe todas as confirmações da estrutura para o programa Mal Mall para criar um conjunto inicial.

Examine o conjunto para determinar a estabilidade local da molécula. Determine os valores de RMSD da espinha dorsal e da cadeia lateral selecionando quatro regiões residuais subsequentes ao longo da sequência e fazendo com que o programa calcule o RMSD para a estrutura de energia mais baixa ou a média, determine quais regiões da molécula mostram estabilidade local plotando o RMSD local em função da sequência, sobreponha o conjunto ao longo desta região da molécula e use este conjunto para análise posterior. Escolha confirmações de baixa energia que sigam as restrições derivadas de NMR.

Estes formarão o registro do conjunto de baixa energia e relatarão o número de confirmações no conjunto, os critérios para escolhê-las e os valores RMSD. Se o modo de ligação de metal ainda não foi determinado, analise o conjunto de baixa energia e determine quais cadeias laterais residuais estão incorretas. Proximidade um do outro para poder ligar o íon metálico.

Use KYMERA para determinar distâncias intramoleculares entre átomos suspeitos de ligação de metal. Calcule as distâncias médias no conjunto depois de determinadas. Repita a análise incluindo os dados de ligação de cobre.

Examine o conjunto e determine a estrutura secundária local dentro da molécula usando os parâmetros de pesquisa padrão do programa MAL mall. Em seguida, importe o conjunto para kymera. As estruturas secundárias são mantidas por ligações de hidrogênio e indicam regiões estáveis da molécula.

Determine a ligação de hidrogênio usando a ferramenta kymera. Continue a análise estrutural conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, some todas as descobertas estruturais para revelar como elas se reforçam mutuamente Para estudar modelos de proteínas de ligação ao cobre, a estrutura da sequência de ligação conservada de uma proteína dentro do peptídeo linear derivado foi determinada por RMN em estado de solução, a região amida do peptídeo de 6,7 a 8,5.

PP M mostrou uma expansão após a reação com cobre para 6,6 a 9,0 PP M. O alargamento da linha devido à ligeira oxidação do cobre é evidente na linha de base. Aqui é mostrada uma sobreposição das regiões de impressão digital de Roy Toxi e espectros aconchegantes do peptídeo ligado ao cobre. A amostra foi estável com o tempo e os espectros foram bem resolvidos e deram 81 interações NOE que foram adquiridas por um experimento róseo.

Como a molécula deu interações NOE próximas de zero no experimento NO C, o conjunto do peptídeo derivado para a amostra reagida, mas sem restrições ao metal, deu 47 de 50 não estruturas com um valor RMSD de 1,44 e 2,07 angstroms na espinha dorsal e átomos pesados, respectivamente. Destes, 13 conformadores de baixa energia foram escolhidos para análise posterior com valores de RMSD de 0,25 e 0,61 angstroms na espinha dorsal e átomos pesados, respectivamente. O gráfico RMSD local apresentou uma região de estabilidade entre os resíduos três e sete Além da região terminal C rígida, incluindo um resíduo de prolene, esta região é encontrada em uma confirmação de curvatura entre os resíduos quatro e sete em todas as confirmações.

A confirmação da dobra é estabilizada por ligações de hidrogênio entre doadores e aceptores de backbone glicina cinco e três anina dois, bem como cisteína seis e cisteína três. Essa curvatura também é evidente na cistina três e no seno sete pelos valores reduzidos de acoplamento nessa região. As confirmações foram sobrepostas a essa região e analisadas quanto a possíveis resíduos de ligação ao considerar cistina três, cistina seis e metionina um como potenciais resíduos de ligação.

A menor distância entre o enxofre e o átomo de enxofre foi aquela entre os grupos folato de cisteína três e cisteína seis, a ligação de cobre foi introduzida e o cálculo foi repetido para fornecer o conjunto usado para análise. O conjunto de baixa energia do peptídeo ligado ao cobre mostra que a amina terminal final está próxima ao cobre ligado. Aqui é mostrada a isossuperfície de distribuição de potencial eletrostático com potencial positivo mostrado em azul e potencial negativo mostrado em vermelho.

O resíduo de arginina se estende da espinha dorsal do peptídeo formando um lóbulo positivo de potencial eletrostático, enquanto os rendimentos de carbono da espinha dorsal são dispostos em uma linha formando um potencial eletrostático negativo menos proeminente Uma vez dominado, uma determinação estrutural pode ser feita em cerca de uma semana de tempo de RMN e mais alguns dias de investigação, a fim de obter um conjunto de confirmações que podem ser usadas para análise estrutural. Seguindo este procedimento, outros mutantes peptídicos e diferentes condições podem ser analisados para responder a perguntas adicionais que abordam as condições necessárias para diferentes graus de ligação e liberação do íon cobre.