Name: Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D 1H (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Aprenda a determinar estruturas de complexos peptídeo-cobre usando espectroscopia de RMN 1D e 2D. Este protocolo detalhado permite analisar modos de ligação em ambientes livres de oxigênio.

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Agradecemos ao Human Frontier Science Program (Young investigator grant (RGY)0068-2006) pelo apoio financeiro.

1. Preparação da amostra
<ol>
	<li>Apo-amostra: Dissolva aproximadamente 1-2 mg do peptídeo em 450-500 μl de solvente de grau NMR deuterado (as soluções preferíveis para amostras biológicas são 10% D2O em água ou d6-DMSO 11-12 se a amostra não se dissolver em água ou reagir com ela).</li>
	<li>Amostra reagida com cobre: Dissolver aproximadamente 1-2 mg do peptídeo com uma quantidade equimolar de sal metálico em 450-500 μl do solvente NMR.</li>
	<li>Filtrar a solução utilizando um vidro de sinterização, papel de filtração ou qualquer outra técnica que se adapte aos compostos sob investigação e não os adsorva. Isso é essencial para remover quaisquer partículas metálicas, o que afetará a homogeneidade.</li>
	<li>Transfira a solução para um tubo de RMN e feche-o. Certifique-se de que a qualidade do tubo se ajusta à força do ímã usada (para mais detalhes, consulte a tabela de equipamentos).</li>
	<li>Se a amostra for sensível ao oxigênio, essas etapas devem ser feitas em um ambiente inerte e o tubo vedado para evitar a oxidação.</li>
</ol>
2. Coleta e processamento de dados de RMN13
<ol>
	<li>Registre espectros 1D 1H das amostras reagidas com apo e cobre e compare. O espectro peptídico contendo cobre deve mostrar uma mudança significativa de deslocamento químico na região da amida e os picos foram resolvidos, uma vez que o apopeptídeo é flexível e mostra uma média de conformações, mas ao reagir com o cobre, as amidas peptídicas ligadas têm uma única estrutura (Figura 2).
	<ol>
		<li>Se o espectro não for alterado, presume-se que a reação falhou.</li>
		<li>Se a amostra ficar verde, o cobre terá oxidado na atmosfera, o que pode alterar suas propriedades de ligação.</li>
		<li>Em ambos os casos, a amostra precisará ser refeita.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Encontre condições ideais de temperatura para as medições de RMN que forneçam sobreposição mínima dos resíduos de amida com larguras de linha estreitas.</li>
	<li>Configure os experimentos de RMN COSY14, TOCSY15 e NOESY16 ou ROESY17 em condições idênticas (temperatura, pH, etc.) e execute em sequência.
	<ol>
		<li>Os experimentos COSY (Figura 3) e TOCSY (Figura 4) detectarão interações de ligação de interações próton-próton adjacentes e vizinhas de longo alcance, respectivamente. O espectro COSY fornece informações sobre as correlações HN-Hα, enquanto o espectro TOCSY fornece, além disso, informações sobre HN e outros prótons alifáticos H de resíduos correlacionados.</li>
		<li>Os experimentos NOESY e ROESY (Figura 5) detectam a proximidade através do espaço sem dependência de ligações para fornecer informações estruturais. A escolha entre os dois é de acordo com o tamanho efetivo do composto e a intensidade do campo. Algumas dessas combinações fornecem sinais teóricos de zero (Figura 6) e um experimento ROESY terá que ser executado para detectar interações NOE10,18.</li>
		<li>Se a amostra estiver em água, os experimentos precisam ter um componente de supressão de água. Isso é realizado com mais eficiência usando gradientes19. Neste caso, é vantajoso executar novamente a amostra, uma vez atribuída, em D2O puro para obter interações com e entre os hidrogênios Hα.</li>
		<li>Otimize a duração dos tempos de mistura TOCSY e NOESY ou ROESY executando uma série de experimentos curtos para encontrar o acúmulo máximo de sinal com perda mínima para a difusão de spin. Certifique-se de que esta é a região linear da curva de acúmulo. Os valores comuns para peptídeos em campos de 600 MHz incluem tempos de mistura de cerca de 100 ms para TOCSY e 150 ms para experimentos NOESY ou ROESY.</li>
		<li>Execute experimentos 1D entre cada experimento para garantir que a composição da amostra permaneça constante durante a aquisição de dados (Figura 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Processe os espectros usando funções de apodização apropriadas para obter resolução máxima com perda mínima de intensidade do sinal, adicionando preenchimento zero na dimensão t1.
	<ol>
		<li>Corrija ainda mais a linha de base na dimensão F2 e depois F1 com uma função polinomial quadrática.</li>
		<li>Calibrar cuidadosamente o desvio químico dos espectros de acordo com os picos de água residual ou DMSO nos respetivos solventes, de acordo com o seu desvio em relação às normas conhecidas (TMSP ou TMS, respetivamente).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Atribuição e integração de pico usando SPARKY20
<ol>
	<li>Preparar um conjunto de espectros COSY e TOCSY sobrepostos ao espectro NOESY ou ROESY (figura 8).</li>
	<li>Atribuir todos os picos NOE no espectro de acordo com a metodologia de atribuição sequencial desenvolvida por Wüthrich21.
	<ol>
		<li>Comece atribuindo picos que se sobrepõem aos sinais TOCSY na região da impressão digital, pois isso facilitará as entradas de atribuição de pico subsequentes com o programa SPARKY (Figura 9). Registre o deslocamento químico de atribuição (Figura 10) e os valores de 3JHNHα (Figura 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Traduza picos em restrições de distância e valores de 3JHNHα em ângulos diedros.
	<ol>
		<li>Isso pode ser feito integrando os picos de dentro do programa e traduzindo-os em restrições de distância usando uma interação de distância conhecida (como a distância entre dois prótons do grupo metileno ou átomos de hidrogênio aromáticos de um aminoácido aromático).</li>
		<li>Se os picos se sobrepõem e os métodos de integração não podem ser usados, eles podem ser rotulados como forte-médio-fraco-muito fraco por estimativa visual, e essas designações podem ser traduzidas em distâncias de até 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 Å, respectivamente. Isso é mais eficaz no trabalho com peptídeos.</li>
		<li>Os valores de 3 JHNHα são indicativos de ângulos diedros de acordo com a equação de Karplus, onde a maioria dos valores de acoplamento dados pode resultar de mais de um ângulo diedro. Estes podem ser indicativos de estrutura secundária (hélices ou folhas), bobina aleatória ou médias conformacionais das mesmas. Portanto, é importante usar as restrições com cuidado ou usá-las como confirmação de resultados conformacionais.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cálculos de mecânica molecular para gerar conjunto de estruturas usando XPLOR22
<ol>
	<li>Importe as restrições de distância e os ângulos diedros com o formato correto para XPLOR. (Figura 12, apenas restrições inter-residuais). O XPLOR pesquisará o espaço conformacional para encontrar estruturas que aderem a restrições químicas geométricas canônicas, como comprimentos de ligação, ângulos, quiralidade, etc., além das restrições de distância encontradas experimentalmente, para gerar um conjunto no qual nenhum dos parâmetros acima seja violado. Isso constituirá o conjunto inicial.</li>
	<li>A primeira execução de determinação da estrutura será sem o uso de nenhuma restrição para o metal. Isso mostrará quais resíduos participam da ligação do metal sem qualquer viés. Pule para a etapa 4.4.</li>
	<li>Além das restrições de distância derivadas de RMN, adicione restrições de ligação de metal aos resíduos determinados.
	<ol>
		<li>Adicione parâmetros apropriados para descrever o íon metálico e sua topologia.</li>
		<li>As informações físicas apropriadas (massa, comprimentos de ligação com outros átomos, ângulos e parâmetros de repulsão não ligantes) devem ser colocadas no arquivo de parâmetros.</li>
		<li>Adicione as informações de vinculação ao arquivo de topologia: Quais vínculos são formados e quebrados e quais encargos formais são alterados como resultado da vinculação.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie um pequeno conjunto de geralmente 10 membros.
	<ol>
		<li>Introduza as restrições gradualmente, começando com interações de backbone a backbone, depois backbone a sidechain, depois interações de sidechain a sidechain e passando de interações intra-residuais e sequenciais para interações de alcance cada vez mais longo. Isso facilita a identificação de erros na atribuição.</li>
		<li>Introduzir a energia NOE como um potencial de poço quadrado com uma constante de força constante de 50 kcal/mol•Å2. O recozimento simulado deve ser feito com 1.500 etapas de 3 segundos a 1.500 K e 3.000 etapas de 1 segundos durante o resfriamento a 500 K. Finalmente, minimize as estruturas usando a minimização de energia de gradiente conjugado para 4.000 iterações; essas são variáveis que podem ser alteradas no XPLOR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie um conjunto final de geralmente 50 membros. Execute as etapas da etapa 4.4 em todo o conjunto.
	<ol>
		<li>Relate o número de cada tipo de interação NOE que foram encontrados, conforme mostrado na Figura 13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Crie um conjunto de estruturas que aderem à geometria química canônica e às restrições empíricas derivadas de RMN.
	<ol>
		<li>Relate o número total de conformações, o número delas que têm violações das restrições derivadas de NMR e o RMSD de todo o conjunto, tanto o backbone quanto todos os valores RMSD de átomos pesados.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Análise de Estrutura
<ol>
	<li>O conjunto dissolvido representa o espaço conformacional adotado pelo peptídeo durante a medição da RMN. A flexibilidade local pode mudar em diferentes regiões da molécula e isso pode ser atribuído a razões estruturais ou funcionais (o objetivo da análise estrutural é determinar a base estrutural para a estabilidade e o mecanismo de ação).
	<ol>
		<li>Importe todas as conformações da estrutura para o programa MolMol23 para criar um conjunto inicial (Figura 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Examine o conjunto para determinar a estabilidade local da molécula.
	<ol>
		<li>Determine os valores de RMSD de backbone e sidechain selecionando regiões subsequentes de quatro resíduos ao longo da sequência e fazendo com que o programa calcule o RMSD para a estrutura de energia mais baixa ou a média.</li>
		<li>Determine quais regiões da molécula mostram estabilidade local (Figura 15) plotando o RMSD local em função da sequência.</li>
		<li>Sobreponha o conjunto ao longo desta região da molécula e use este conjunto para análise posterior (Figura 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escolha conformações de baixa energia que aderem às restrições derivadas de RMN (não violadas). Estes formarão o "conjunto de baixa energia".
	<ol>
		<li>Relate o número de conformações no conjunto, os critérios para escolhê-las e os valores RMSD conforme definido na etapa 4.6.1.</li>
		<li>Se o modo de encadernação de metal já tiver sido determinado, vá para a próxima etapa. Caso contrário: Analise o conjunto de baixa energia e determine quais cadeias laterais residuais estão corretas próximas umas das outras para poder ligar o íon metálico. Uma vez determinados, volte para a etapa 3.3 e refaça a análise incluindo os dados de ligação de cobre (Figura 17 para o conjunto e Figura 18 para o conformador de baixa energia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Examine o conjunto e determine a estrutura secundária local dentro da molécula usando os parâmetros de pesquisa padrão do programa MolMol. As estruturas secundárias são mantidas por ligações de hidrogênio e indicam regiões estáveis da molécula.
	<ol>
		<li>Determine a estrutura secundária de cada conformador (Figura 19).
		<ol>
			<li>Crie uma tabela da porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada estrutura secundária.</li>
			<li>Determine se as regiões da estrutura secundária se sobrepõem às regiões que foram determinadas como as regiões estáveis pelo local-RMSD. Este é frequentemente o caso.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determine distâncias e ligações de hidrogênio dentro da molécula.
	<ol>
		<li>Importe o conjunto para o Chimera24.</li>
		<li>Use o Chimera para determinar as distâncias intramoleculares entre átomos suspeitos de ligação de metal. Calcule as distâncias médias no conjunto.</li>
		<li>Use o Chimera para determinar as ligações de hidrogênio intramoleculares em cada conformador do conjunto (Figura 20), usando os parâmetros padrão de ligação de hidrogênio relaxado (em 20%) do programa.</li>
		<li>Crie uma tabela da porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada ligação de hidrogênio. As ligações de hidrogênio que se repetem na maioria das conformações indicam uma ligação estável que aumenta a estabilidade da estrutura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determine as interações eletrostáticas dentro da molécula.
	<ol>
		<li>Identifique interações entre sidechains carregadas.</li>
		<li>Crie uma tabela com a porcentagem de conformadores do conjunto que mostram cada interação eletrostática.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcule a distribuição de potencial eletrostático usando o campo de força Amber25 dentro do programa Delphi26.
	<ol>
		<li>Escolha uma única conformação representativa do conjunto no qual realizar os cálculos de potencial eletrostático.</li>
		<li>Derive o potencial eletrostático usando a equação de Poisson-Boltzman e um cálculo coulombiano completo. Os parâmetros necessários incluem a força iônica da solução, os valores dielétricos da solução (80 para água; 40 para DMSO); o peptídeo interno (geralmente em torno de 5,0); o tamanho da grade (geralmente 65'65'65 pontos); e a distância mínima entre o peptídeo e a borda da grade (10 Å). Os resultados são geralmente bastante robustos em relação a esses valores, pois o resultado principal é governado pelo próprio peptídeo (Figura 21).</li>
		<li>Examine o potencial eletrostático mapeado na superfície de Van der Waals do peptídeo (Figura 22).</li>
		<li>Examinar as iso-superfícies de potencial eletrostático, que descrevem posições com o mesmo potencial. Encontre iso-superfícies que sugiram relevância biológica, como superfícies positivas ou negativas estendidas que podem atrair ou repelir outras proteínas ou ligantes, ou distribuições que indicam significância, como distribuição anfipática ou manchas de propriedades diferentes (Figura 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Resuma todas as descobertas estruturais para ver como elas se reforçam mutuamente.</li>
	<li>Repita as etapas 4.3 a 5.7.4 quando relevante.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

A contribuição da informação estrutural para entender os mecanismos de ligação é bem aceita. Os peptídeos são úteis como modelos para ligação e interações de proteínas; no entanto, eles não são passíveis do principal método de determinação da estrutura, a cristalografia de raios-X. A RMN é particularmente útil para esses sistemas, uma vez que as estruturas podem ser facilmente resolvidas em solução. Isso é especialmente para o caso de metalochaperonas-miméticos que adicionalmente requerem determinação da estrutura em um ...

Os peptídeos são amplamente utilizados como modelos de proteínas, potenciais fármacos e agentes terapêuticos por direito próprio. No entanto, seu pequeno tamanho e alto grau de flexibilidade muitas vezes impedem a determinação da estrutura por raios-X devido a dificuldades na cristalização.
A ressonância magnética nuclear (RMN) pode ser usada para determinar estruturas e interações peptídicas. O método pode fornecer informações sobre a estrutura local e geral, interações de ligação e menor afinidade, e é aplicável a amostras difíceis, pois pode ser feito no estado de solução.
O transporte de cobre em sistemas biológicos é obtido por proteínas metalochaperonas de cobre intracelulares que se ligam especificamente aos íons (I) e os entregam às suas proteínas-alvo por meio de uma série de interações proteína-proteína, para proteger os íons da oxidação e evitar a liberação de cobre tóxico2-5. O sítio de ligação é caracterizado pela sequência conservada, MXH/TCXanyXanyC, que demonstrou tanto por RMN quanto por cristalografia ligar o (I) pelos ligantes tiolato moles dos dois resíduos de cisteína, embora um ligante externo adicional também tenha sido proposto6-8. A relação estrutura-função dessas proteínas tem sido objeto de intensa pesquisa9.
No estudo aqui apresentado, um modelo de peptídeo que inclui a sequência conservada de metalochaperonas de cobre foi sintetizado e reagiu com (I) em ambiente inerte. O protocolo apresentado descreve as etapas de determinação da estrutura por RMN, incluindo preparação da amostra, coleta de dados, processamento de dados, geração de estrutura e análise estrutural. A análise foi feita em duas etapas: Primeiro as estruturas foram geradas sem informações sobre o modo de ligação do peptídeo ao íon cobre. Uma vez que o modo de ligação foi estabelecido empiricamente, essas restrições foram introduzidas para fornecer uma estrutura de alta resolução. O modo de ligação é o ponto essencial no modelo e, portanto, foi determinado de maneira imparcial.
A determinação estrutural de RMN de peptídeos modelo é uma técnica extremamente valiosa que é frequentemente usada por químicos e biólogos. Pode ser aplicado com relativa facilidade a diferentes peptídeos sob diferentes condições e, portanto, pode lançar luz sobre mecanismos relevantes10. A compreensão do processo de elucidação da estrutura fornece uma melhor compreensão dos pontos fortes e fracos das estruturas propostas.

<table><tbody><tr><td>Espectrômetro Avance DMX 600 MHz</td><td>Tubos</td> de amostra de RMN Bruker<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Caixa de luvas <td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>benchtopK</td><td></td></tr><tr><td>Peptide</td><td>BioChemia</td><td>Feito sob medida</td><td>>95% de pureza</td></tr><tr><td>Cloreto de cobre (1)</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimetilsulfóxido</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando rmn 1d e 2d 1h

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

A ligação do cobre (I) por proteínas de transporte de metalochaperona evita a oxidação do cobre e a liberação dos íons tóxicos que podem participar de reações redox prejudiciais. O complexo (I) do modelo peptídico de uma proteína metalochaperona ligante a (I), que inclui a sequência MTCSGCSRPG (sublinhado é conservado), foi determinado em solução sob condições inertes por espectroscopia de RMN.
A RMN é uma técnica amplamente aceita para a determinação de estruturas de solução de proteínas e peptídeos. Devido à dificuldade na cristalização para fornecer cristais únicos adequados para cristalografia de raios-X, a técnica de RMN é extremamente valiosa, especialmente porque fornece informações sobre o estado da solução e não sobre o estado sólido. Aqui, descrevemos todas as etapas necessárias para determinações completas da estrutura tridimensional por RMN. O protocolo inclui preparação de amostras em um tubo de RMN, coleta e processamento de dados 1D e 2D, atribuição e integração de picos, cálculos de mecânica molecular e análise de estrutura. É importante ressaltar que a análise foi conduzida pela primeira vez sem ligações metal-ligante predefinidas, para garantir uma determinação confiável da estrutura de maneira imparcial.

Como parte de um estudo contínuo sobre modelos de proteínas ligadoras de cobre, a estrutura da sequência conservada MT/HCXXC dentro do peptídeo linear MTCSGCSRPG foi determinada por RMN em estado de solução. O peptídeo foi reagido com CuCl em ambiente inerte e o pH foi medido em aproximadamente 3,0 por meio de um papel indicador universal. A região das amidas do peptídeo mostrou uma expansão após a reação com cobre, de 6,7-8,5 para 6,6-9,0 ppm (Figura 2). O alargamento de linha devido à leve oxidação do ...

A estrutura da solução de RMN de um peptídeo modelo de metalochaperona com (I) foi determinada, e um protocolo detalhado desde a preparação da amostra e coleta de dados 1D e 2D até uma estrutura tridimensional é descrito.

Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D 1H

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura de um peptídeo mimético de proteína chaperona metálica complexado com cobre. Isso é realizado primeiramente preparando a amostra em um ambiente livre de oxigênio. O segundo passo é adquirir os dados de ressonância magnética nuclear ou espectroscopia de RMN que mostrem as interações entre átomos de hidrogênio.Em seguida, as interações espaciais são mapeadas em um modelo linear de peptídeo. O passo final consiste em encontrar uma estrutura representativa de baixa energia que se ajuste aos dados. Em última análise, estruturas derivadas de RMN são utilizadas para determinar o modo de ligação e para realizar análises estruturais sobre o complexo ligado ao cobre.A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como a cristalografia de raios X, é que é possível utilizá-la para analisar complexos de ligação fraca, bem como moléculas e complexos que não cristalizam. Embora este método possa fornecer informações sobre proteínas que ligam cobre, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras metaloproteínas, para estudar como as proteínas permitem a entrega segura de íons metálicos essenciais, mas p

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Química

Determinação da Estrutura e Coordenação de Complexos Peptídeo-Metal Utilizando RMN 1D e 2D de 1H

Este protocolo descreve o uso de reacções de acoplamento de amida do ácido isonicotínico e diaminoalcanos para formar ponte ligandos adequados para utilização na síntese de complexos de platina multinucleadas, que combinam os aspectos dos fármacos anticancerígenos BBR3464 e picoplatin.

Acoplamento de amida de reacção para a síntese de ligandos baseados em Bispyridine e sua complexação com platina como agentes anticancerígenos dinucleares

Este artigo descreve a construção de uma série de aglomerados supramoleculares de ligação de hidrogênio em cristais usando trifenilacetato de amônio primário Essa construção seletiva dos clusters supramoleculares leva a estudos simétricos sistemáticos eficazes sobre uma correlação entre os clusters supramoleculares e seus componentes.

Construção e sistemática simétricas Estudos de uma série de Supramoleculares Clusters com binários ou ternários Triphenylacetates Amônio

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

Rica em cisteína peptídeos dobram em distintas estruturas tridimensionais dependendo sua conectividade de dissulfeto. Síntese alvo de isómeros de bissulfeto individual é necessária quando oxidação de reserva não implica que a conectividade de bissulfeto desejado. O protocolo lida com a síntese seletiva de peptídeos 3-bissulfeto-ligado e sua análise estrutural usando estudos NMR e MS/MS.

Síntese e determinação da estrutura de µ-conotoxina PIIIA isômeros com bissulfeto diferentes conetividades

Um novo catalisador de metal do grupo IV para a metátese de imina é preparado por enxertia o complexo metálico de amina na sílica desidroxilada. Fragmentos metálicos de superfície são caracterizados usando FT-IR, microanálise elementar e espectroscopia de RMN de estado sólido. A superfície de polarização nuclear dinâmica mais adicional realçou experiências da espectroscopia de RMN complementa a determinação da esfera da coordenação.

Metathesis de imine por catalisadores sílica-apoiados usando a metodologia da química organometálica de superfície

A mobilidade do íon-espectrometria maciça e as técnicas de modelagem molecular podem caracterizar o desempenho quelante do metal seletivo de peptídeos metal-obrigatórios projetados e do methanobactin Copper-Binding do peptide. O desenvolvimento de novas classes de peptídeos quelantes metálicos ajudará a levar a terapêutica para doenças associadas ao desbalanceamento de íons metálicos.

Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica

A preparação de complexos de cobalto pincer SNS (II) de álcool hepático desidrogenase é apresentada aqui. Os complexos podem ser preparados reagindo ao precursor do ligante com CoCl2·6H2O e podem então ser recristalizados permitindo que o éter dietil se difunde lentamente em uma solução de acetonitrilo que contém o complexo de cobalto.

Preparação de Complexos modelo sns cobalto(ii) de álcool hepático desidrogenase

Este artigo foca no uso de espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica para sondar e quantificar a termodinâmica de(II) vinculando-se a peptídeos e proteínas.

Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

A análise da forma da linha dos espectros de RMN coletados em uma faixa de temperaturas serve como um guia para o rearranjo de átomos da esfera de coordenação interna em um complexo de polihidreto de rênio(V) quiral, de oito coordenadas, ReH5(PPh3)2(sec-butil amina). A análise da forma da linha também é usada para determinar os parâmetros de ativação ΔH‡, ΔS‡ e ΔG‡ para esses rearranjos de átomos.

Análise da Forma da Linha de Espectros Dinâmicos de RMN para Caracterização de Rearranjos de Esferas de Coordenação em um Complexo de Polihidreto de Rênio Quiral

Um método para a síntese de titânio e vanádio anticancerígenos agentes sensíveis ao ar é descrito, juntamente com a avaliação da sua actividade citotóxica no sentido de linha de células de cancro humano por o Ensaio MTT.

Anticâncer metal Complexos: Síntese e Avaliação de citotoxicidade pelo ensaio MTT

Aprenda a determinar estruturas de complexos peptídeo-cobre usando espectroscopia de RMN 1D e 2D. Este protocolo detalhado permite analisar modos de ligação em ambientes livres de oxigênio.

Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D ¹H

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