Determinação da estrutura e coordenação de complexos peptídeo-metal usando RMN 1D e 2D ¹H

O objetivo geral deste procedimento é determinar a estrutura de um peptídeo mimético de proteína chaperona metálica complexado com cobre. Isso é realizado primeiramente preparando a amostra em um ambiente livre de oxigênio. O segundo passo é adquirir os dados de ressonância magnética nuclear ou espectroscopia de RMN que mostrem as interações entre átomos de hidrogênio.

Em seguida, as interações espaciais são mapeadas em um modelo linear de peptídeo. O passo final consiste em encontrar uma estrutura representativa de baixa energia que se ajuste aos dados. Em última análise, estruturas derivadas de RMN são utilizadas para determinar o modo de ligação e para realizar análises estruturais sobre o complexo ligado ao cobre.

A principal vantagem desta técnica em relação às técnicas existentes, como a cristalografia de raios X, é que é possível utilizá-la para analisar complexos de ligação fraca, bem como moléculas e complexos que não cristalizam. Embora este método possa fornecer informações sobre proteínas que ligam cobre, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como outras metaloproteínas, para estudar como as proteínas permitem a entrega segura de íons metálicos essenciais, mas potencialmente tóxicos, no ambiente de linhagem celular.

Para começar, prepare as amostras em um ambiente livre de oxigênio para evitar a oxidação do cobre. Para preparar a amostra APO, dissolva aproximadamente um a dois miligramas do peptídeo em 450 a 500 microlitros de solvente deuterado de grau NMR. Para a amostra com cobre reagido, dissolva a mesma quantidade do peptídeo APO com uma quantidade molar EQU de sal metálico em 450 a 500 microlitros do solvente NMR. Filtre cada solução utilizando papel de filtração de vidro sinterizado ou qualquer outra técnica adequada aos compostos em estudo e que não os absorva. Isso é essencial para remover quaisquer partículas metálicas, as quais afetarão a homogeneidade.

Transfira as soluções para tubos de RMN e feche as amostras nos tubos. Antes de sair da caixa de luvas, retire as amostras da caixa de luvas e feche-as hermeticamente. Registre os espectros unidimensionais de prótons das amostras APO e reagidas com cobre na máquina de RMN e compare-os.

O peptídeo APO é flexível e apresenta uma média de conformações, mas ao reagir com cobre, as amidas do peptídeo ligado adquirem uma estrutura mais rígida. Portanto, o espectro do peptídeo contendo cobre deve mostrar uma mudança significativa no deslocamento químico na região da amida, e os picos podem tornar-se resolvidos. Configure experimentos de NMR otimizados, como cozy, tox, nosy ou rosy, em condições idênticas às descritas no protocolo textual e execute-os em sequência.

Execute experimentos unidimensionais entre cada experimento para garantir que a composição da amostra permaneça constante durante toda a aquisição de dados. Após o processamento dos dados conforme discutido no protocolo textual, prepare um conjunto de espectros cozy e to sobrepostos ao espectro noea e rosy. Para atribuir todos os picos NOE no espectro.

Inicie atribuindo picos que se sobrepõem a sinais toxis na região digital. Isso facilitará as entradas subsequentes de atribuição de picos no programa Sparky, registrando os picos atribuídos, traduzindo os valores de acoplamento de H alfa para amida de proteína em ângulos dedal. Além disso, traduza picos em restrições de distância integrando os picos dentro do programa e traduzindo-os usando uma interação de distância conhecida.

Se os picos se sobrepuserem ou se métodos de integração automática não puderem ser utilizados, os picos podem ser rotulados como fortes, médios, fracos ou muito fracos por estimativa visual, e essas designações podem ser traduzidas em distâncias de até 2,5, 3,5, 4,5 e 5,5 angstroms, respectivamente. Importe as restrições de distância e os ângulos diedros no formato correto para o Explore. O Explore pesquisará o espaço conformacional para encontrar estruturas que obedeçam à geometria química canônica.

Além das restrições de distância determinadas experimentalmente, gere um conjunto no qual nenhuma dessas restrições seja violada. Esse será o conjunto inicial. Realize a primeira rodada de determinação estrutural sem utilizar quaisquer restrições ao metal, a fim de identificar quais resíduos participam da ligação ao metal sem qualquer viés.

Introduza as restrições gradualmente para facilitar a identificação de erros na atribuição, bem como na energia de NOE e nos parâmetros de simulação de flexão descritos no protocolo do texto, antes de minimizar as estruturas por meio de minimização de energia por gradiente conjugado por 4.000 iterações. Crie um conjunto final, geralmente composto por 50 membros, realizando a introdução das restrições de forma iterativa em todo o conjunto e relate o número de cada tipo de interação NOE encontrada. Por fim, crie um conjunto de estruturas que respeitem a geometria química canônica e as restrições empíricas derivadas de RMN. Relate o número total de conformações, o número dessas que apresentam violações das restrições derivadas de RMN e o RMSD do conjunto inteiro, incluindo os valores de RMSD da cadeia principal e de todos os átomos pesados.

Analise o conjunto de baixa energia e determine quais cadeias laterais dos resíduos estão em proximidade correta umas em relação às outras para poderem ligar o íon metálico. Uma vez que esses resíduos tenham sido determinados, repita a análise, incluindo os dados de ligação de cobre. Além das restrições de distância derivadas da RMN, adicione agora restrições de ligação metálica aos resíduos identificados.

Adicione parâmetros apropriados para descrever o íon metálico e sua topologia. Insira as informações físicas adequadas, como massa, comprimentos de ligação com outros átomos, ângulos e parâmetros de repulsão não ligantes, no arquivo de parâmetros. Adicione as informações de ligação ao arquivo de topologia.

Essas informações incluem quais ligações são formadas e rompidas, e quais cargas formais são alteradas como resultado da ligação. Por fim, obtenha um conjunto de estruturas como anteriormente, pois o conjunto resolvido representa o espaço conformacional adotado pelo peptídeo. Durante a medição de RNM, importe todas as conformações da estrutura para o programa Mal Mall para criar um conjunto inicial.

Examine o conjunto para determinar a estabilidade local da molécula. Determine os valores de RMSD do esqueleto e das cadeias laterais selecionando regiões subsequentes de quatro resíduos ao longo da sequência e fazendo com que o programa calcule o RMSD em relação à estrutura de menor energia ou à média; identifique quais regiões da molécula apresentam estabilidade local ao traçar o RMSD local em função da sequência. Sobreponha o conjunto ao longo dessa região da molécula e utilize este conjunto para análises posteriores. Escolha conformações de baixa energia que respeitem as restrições derivadas da RMN.

Estes formarão o registro do conjunto de baixa energia e relatarão o número de conformações no conjunto, os critérios para selecioná-las e os valores de RMSD. Se o modo de ligação ao metal ainda não tiver sido determinado, analise o conjunto de baixa energia e identifique quais cadeias laterais dos resíduos estão incorretas. A proximidade entre si para poder ligar o íon metálico.

Utilize o KYMERA para determinar as distâncias intramoleculares entre átomos suspeitos de ligação ao metal. Calcule as distâncias médias no conjunto após essas terem sido determinadas. Repita a análise incluindo os dados de ligação do cobre.

Examine o conjunto e determine a estrutura secundária local dentro da molécula utilizando os parâmetros de busca padrão do programa MAL mall. Em seguida, importe o conjunto para o kymera. As estruturas secundárias são mantidas por ligações de hidrogênio e indicam regiões estáveis da molécula.

Determine a ligação com hidrogênio utilizando a ferramenta kymera. Continue a análise estrutural conforme detalhado no protocolo textual. Em seguida, some todos os achados estruturais para revelar como eles se reforçam mutuamente. Para estudar modelos de proteínas com ligação ao cobre, a estrutura da sequência conservada de ligação de uma proteína dentro do peptídeo linear derivado foi determinada por RMN em estado de solução, na região das amidas do peptídeo entre 6,7 e 8,5.

PP M mostrou uma expansão durante a reação com cobre, de 6,6 a 9,0 PP M. O alargamento das linhas, devido à leve oxidação do cobre, é evidente na linha de base. Aqui é mostrada uma sobreposição das regiões digitais dos espectros de Roy Toxi e cozy do peptídeo ligado ao cobre. A amostra foi estável ao longo do tempo e os espectros foram bem resolvidos, fornecendo 81 interações NOE que foram obtidas por um experimento rosy.

Como a molécula apresentou interações NOE próximas de zero no experimento NOE, o conjunto de conformações do peptídeo derivado da amostra reagida, mas sem restrições ao metal, resultou em 47 das 50 estruturas com valor de RMSD de 1,44 e 2,07 angstroms nos átomos da cadeia principal e nos átomos pesados, respectivamente. Dentre essas, 13 conformações de baixa energia foram selecionadas para análise adicional, com valores de RMSD de 0,25 e 0,61 angstroms nos átomos da cadeia principal e nos átomos pesados, respectivamente. O gráfico de RMSD local mostrou uma região de estabilidade entre os resíduos três e sete. Além da região rígida do terminal C, incluindo um resíduo de prolina, essa região se encontra em uma conformação de dobra entre os resíduos quatro e sete em todas as conformações.

A confirmação da curva é estabilizada por ligações de hidrogênio entre doadores e aceptores da cadeia principal da glicina cinco e da alanina três, bem como da cisteína seis e da cisteína três. Essa curva também é evidente na cistina três e na serina sete pelos valores reduzidos de acoplamento nesta região. As conformações foram sobrepostas nesta região e analisadas quanto a resíduos de ligação possíveis, considerando a cistina três, a cistina seis e a metionina um como resíduos de ligação potenciais.

A menor distância entre átomos de enxofre foi aquela entre os grupos de folato da cisteína três e da cisteína seis; em seguida, foi introduzida a ligação com cobre e o cálculo foi repetido para gerar o conjunto utilizado na análise. O conjunto de baixa energia do peptídeo ligado ao cobre mostra que a amina terminal está próxima ao cobre ligado. É mostrada aqui a isosuperfície da distribuição do potencial eletrostático, com o potencial positivo representado em azul e o potencial negativo em vermelho.

O resíduo de arginina se estende a partir da cadeia principal do peptídeo, formando um lobo positivo de potencial eletrostático, enquanto os rendimentos de carbono da cadeia principal são dispostos em linha, formando um potencial eletrostático negativo menos acentuado. Após dominar o método, uma determinação estrutural pode ser realizada em cerca de uma semana de tempo de RMN e mais alguns dias de processamento, a fim de obter um conjunto de conformações que possa ser utilizado para análise estrutural. Após este procedimento, outros mutantes peptídicos e diferentes condições podem ser analisados para responder perguntas adicionais sobre as condições necessárias para diferentes graus de ligação e liberação do íon cobre.