Name: Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Aprenda a isolar monócitos de sangue humano usando separação magnética de partículas CD14 e diferenciá-los em células dendríticas imaturas. Este método alcança 98-99% de pureza para estudos imunológicos avançados.

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Gostaríamos de agradecer à nossa técnica Karolin Thurnes, Divisão de Higiene e Microbiologia Médica, e à Dra. Annelies Mühlbacher e ao Dr. Paul Hörtnagl, do Instituto Central de Transfusão de Sangue e Departamento Imunológico, por sua valiosa ajuda e apoio em relação a este manuscrito. Agradecemos ao Austrian Science Fund por apoiar este trabalho (P24598 para DW, P25389 para WP).

declaração de ética: consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes doadores de sangue por parte do Instituto Central de Transfusão de Sangue &amp; Departamento de Imunologia, Innsbruck, Áustria. O uso de amostras de sobras anónimos para fins científicos foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Innsbruck Ética. 1. enriquecimento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) <ol><li> Concentração de PBMC por centrifugação. <ol><li> Abra o pacote de sangue e dividida em tubos de centrífuga de 50 ml estéreis de acordo com a quantidade de sangue recebida. </li><li> Se necessário, ajustar o volume a 50 ml por cada tubo com fosfato tamponado com solução salina estéril de Dulbecco (D-PBS). </li><li> Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min à temperatura ambiente (TA) sem travão. </li><li> Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando o boundary camada imperturbável. NOTA: Se plasma autólogo, em vez de FCS é usado para suplementar o meio de cultura, o plasma deve ser recolhido e inactivado pelo calor neste passo. </li><li> Recolher as células mononucleares (camadas de fronteira) a partir de dois de 50 ml tubos de centrífuga e transferi-los para um estéril tubo de 50 ml usando um estéril 10 ml pipeta sorológica. </li><li> Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo estéril usando D-PBS. </li><li> Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min à TA sem travão. </li><li> Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando a camada limite não perturbada. </li><li> Recolher as células mononucleares (camadas de fronteira) a partir das 50 ml tubos de centrífuga e transferi-los em dois tubos de 50 ml de coleta estéreis, utilizando uma agulha estéril 10 ml pipeta sorológica. </li><li> Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo com D-PBS estéril. </li></ol></li><li> Separaçãode PBMC por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 1). <ol><li> Prepare quatro tubos de 50 ml e pipeta de 15 ml de meio de gradiente de densidade para cada tubo. </li><li> -Se 25 ml de células agrupadas / sangue do tubo de coleta (passo 1.1.10) e sobrepor cuidadosamente o meio de gradiente de densidade. </li><li> Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 700 xg durante 30 min à TA sem travão. </li></ol></li><li> Recolha e purificação de PBMCs. <ol><li> Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando a camada de PBMC não perturbada. </li><li> Recolher o interfase PBMC de todos os tubos e reunir as células em duas estéreis tubos de 50 ml usando um estéril 25 ml pipeta sorológica. </li><li> Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo com D-PBS estéril. Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min a 4 ° C com o freio. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspender aem células estéril D-PBS. Reunir as células de ambos os tubos e ajustar o volume para 50 ml com PBS estéril D-. </li><li> Colocar os tubos no centrifugador e colocá-los a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em D-PBS estéril. Ajustar o volume para 50 ml com PBS estéril e D-pipeta 50 ul a um tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de D-PBS. </li><li> Vortex do tubo de 1,5 ml vigorosamente e contar as células em uma câmara de Neubauer ou qualquer outro instrumento de contagem de células. </li><li> Colocar os tubos de 50 ml no centrifugador e colocá-los a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento de monócitos CD14 por partículas magnéticas anti-humano <ol><li> Etiquetagem de PBMCs com partículas magnéticas. <ol><li> Ajustar a concentração de PBMC de 8 x 10 7 células / ml usando tampão de isolamento. </li><li> Vortex as partículas CD14 anti-humano magnéticos absoY e adicionar 50 ul de partículas por cada 1 x 10 7 PBMC. </li><li> Misture a suspensão de células-partículas bem e incubar-lo à TA durante 30 min. </li></ol></li><li> A separação das fracções positivas e negativas. <ol><li> Ajustar o volume até 12 ml usando tampão de isolamento. </li><li> Prepare seis tubos estéreis de fundo redondo e de pipeta 2 mL da suspensão de células-partículas em cada tubo. </li><li> Imediatamente coloque os tubos no ímã. Incubar-los durante 10 min à TA. </li><li> Mantenha os tubos no ímã e desenhar cuidadosamente o sobrenadante. O sobrenadante contém a fracção negativa. </li><li> Retire o tubo do ímã e adicionar 2 ml de tampão de isolamento. </li><li> Gentilmente re-suspender as células por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Colocar os tubos de volta ao ímã. Incubar durante 5 min à TA. </li><li> Mantenha os tubos no ímã e desenhar cuidadosamente o sobrenadante. O sobrenadante contém a fracção negativa. </li><li>Retirar os tubos do ímã e adicionar 2 ml de tampão de isolamento a cada tubo. Gentilmente re-suspender as células por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Transferir a fracção positiva para um tubo estéril de 50 ml e ajustar o volume para 50 ml usando estéril D-PBS. </li></ol></li></ol> 3. Estimulação de monócitos isolados com IL-4 e GM-CSF <ol><li> Colocar o tubo em a centrífuga e girá-lo a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio. </li><li> Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em 50 ml de D-PBS. </li><li> Pipetar 50 ul num tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de D-PBS. Vortex do tubo de 1,5 ml vigorosamente e contar as células numa câmara de Neubauer ou um outro instrumento de contagem de células. </li><li> Colocar o tubo de 50 mL para a centrífuga e girá-lo a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio. NOTA: Se a fração negativo, contendo linfócitos do sangue periférico (PBL), também é necessária, executar lavagem e contagem de passos semelhante ao tmangueira da fracção positiva (passos 3,1-3,5). </li><li> Ajustar a concentração de células de 1 x 10 6 / mL com meio de cultura pré-aquecido (meio RPMI 1640 suplementado com L-Glutamina solução de FBS inactivado por calor e 1% a 10%) e pipeta de 3 ml / poço em placas de 6 poços. NOTA: Se estiver usando plasma autólogo inativado pelo calor, substitua o FCS 10%, com 1-5% de plasma autólogo, de acordo com o conjunto experimental. </li><li> Estimular os monócitos com recombinante humano IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF humano recombinante (1000 U / mL) por pipetagem as citocinas directamente para o meio de cultura. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Re-estimular as células com IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF (1000 U / ml) após 48 h pipetando as citocinas directamente para o meio de cultura. NOTA: Se não houver qualquer sinal de acidificação mostrado pelo indicador de pH no meio, substituir metade do meio com meio de cultura de pré-aquecido. </li><li> Colheita células dendríticas imaturas no dia 5 paraa jusante experiências pipetando as células cultivadas para fora da placa de 6 poços e para um tubo de centrífuga de 50 ml após pipetagem do meio de cultura para cima e para baixo algumas vezes. </li><li> Contar as células e corar uma amostra de monócitos isolados com anticorpos anti-humanos contra CD11b, CD11c, e DC-SIGN / CD209, em conjunto com um corante de viabilidade celular. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos durante a coloração da superfície, a utilização do receptor de Fc ou reagentes de bloqueio de albumina do soro de bovino (BSA) tampões é altamente recomendável. </li><li> Analisar a amostra usando o corante de viabilidade celular, de acordo com o protocolo do fabricante, através da realização de citometria de fluxo para avaliar a pureza e viabilidade das iDCs gerados. </li></ol>

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<li>Kapsenberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell+control+of+pathogen-driven+T-cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization.</a> Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).</li>
<li>Mills, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+T+cell+activation+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent T cell activation in autoimmunity.</a> Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).</li>
<li>Banki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+as+an+endogenous+adjuvant+for+dendritic+cell-mediated+induction+of+retrovirus-specific+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs.</a> PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+attenuate+the+capacity+of+dendritic+cells+to+stimulate+HIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).</li>
<li>Posch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement-Opsonized+HIV-1+Overcomes+Restriction+in+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells.</a> PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).</li>
<li>Wilflingseder, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+T-Helper+17+Polarization+Upon+Triggering+CD11b%2Fc+on+HIV-Exposed+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells.</a> J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).</li>
<li>Grassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-derived+dendritic+cells+have+a+phenotype+comparable+to+that+of+dermal+dendritic+cells+and+display+ultrastructural+granules+distinct+from+Birbeck+granules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules.</a> J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Este protocolo descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) através do isolamento de monócitos humanos a partir de sangue anti-coagulado usando um ensaio baseado em nanopartícula magnética. Neste protocolo, os passos de centrifugação são realizados a montante do processo de isolamento de células, o que leva a um enriquecimento da fracção de PBMC. Embora as células são perdidas durante a centrifugação, para sobrepor o conteúdo de um saco de sangue inteiro no meio de gradiente de densidade exig...

As células dendríticas (CDs) são as células especializadas apresentadoras de antigénios mais importantes do nosso sistema imunitário. DCs imaturos (iDCs) residem na pele ou nos tecidos das mucosas e são, por conseguinte, entre as primeiras células imunes para interagir com os agentes patogénicos invasores. DCs representam a ponte entre o inato eo sistema imunitário adaptativo 1, uma vez que podem activar respostas T e de células B após a detecção de patógenos. Além disso, contribuem para as respostas imunitárias pró-inflamatórios devido à secreção de grandes quantidades de citocinas, tais como IL-1β, IL-6, e IL-12. DCs também activar as células NK e outras atrair células do sistema imunológico para o local da infecção por quimiotaxia. DCs pode ser dividido em células dendríticas imaturas (iDCs) e células dendriticas maduras (MDCs) 2 com base na sua morfologia e função. Após o reconhecimento de antigénios estranhos por um dos muitos receptores de reconhecimento de padrões (por exemplo, receptores de tipo Toll, C-tipolectinas, receptores ou complementar a) abundantemente expresso na superfície da célula, iDCs sofrer grandes alterações e começar a amadurecer. Durante este processo de maturação, receptores para captura de antigénios são regulados negativamente, enquanto que as moléculas essenciais para a apresentação de antígenos são up-regulada 3. DCs maduras sobre-regular os complexo principal de histocompatibilidade I e II (MHC I e II), moléculas co-estimuladoras tais como CD80 e CD86, que são essenciais para a apresentação de antigénios e a activação dos linfócitos T. Além disso, a expressão de receptor de quimioquina CCR7 na superfície da célula é induzida, o que permite a migração de DC a partir de tecidos periféricos para os nodos linfáticos. A migração é facilitada pela &quot;rolamento&quot; de DC ao longo de um ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) e o gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) para os nódulos linfáticos 4-6. Após migração, mDCs apresentar o antigénio processado a ingénuo células T CD4 + e CD8 +, assim initiating uma resposta imune adaptativa contra o agente patogénico invasor 7. Esta interacção com as células T em nódulos linfáticos, também está associada com a propagação do vírus 8. Outros estudos in vitro revelaram que DCs eficiente capturar e transferir HIV às células T e que esta resultados de transmissão de uma infecção vigorosa 9-12. Este estudo destacou que in vivo explora DCs HIV como shuttles da periferia para os gânglios linfáticos. Durante a apresentação de antigénio, as DCs segregam interleucinas chave que definem a diferenciação de células T auxiliares efectoras, e, portanto, o resultado de toda a resposta imunitária contra o micróbio é determinada nesta interacção muito. Além de tipo 1 (Th1) e tipo 2 (Th2) T efetoras, outros subconjuntos de células CD4 + T helper (por exemplo, tipo 17 (Th17) e Tipo 22 (células Th22) T) têm sido descritas, e sua indução e função foram investigadas exaustivamente. DCs são, além disso, envolvido ema geração de células T reguladoras (Tregs) 13,14. Estas células são imunossupressor e pode parar ou para baixo-regular indução ou proliferação de células T efetoras e são, portanto, crucial para o desenvolvimento de imunidade e tolerância. DCs convencionais Humanos (CDCs) compreendem vários subconjuntos de células com uma origem mielóide (isto é, células de Langerhans (LCS) e dérmica e DCs intersticiais) ou uma origem linfóide (isto é, as DCs plasmocitoides (PDCs)). Para as experiências in vitro ou estratégias de vacinação DC, DC derivadas de monócitos são rotineiramente utilizado como um modelo para as DCs dérmicos. Estas células apresentam semelhanças na fisiologia, morfologia e função às células dendríticas mielóides convencionais. Eles são gerados por meio da adição de interleucina 4 (IL-4) e de granulócitos-macrófagos fator estimulador de colónias (GM-CSF) para monócitos isolados a partir de dadores saudáveis, 12,15-18. As células dendríticas também podem ser directamente isolados a partir da derme ou da mucosa biópsias, ou pode até mesmo be desenvolvido a partir de células progenitoras hematopoiéticas isoladas a partir de amostras de sangue do cordão umbilical obtidos ex utero CD34 +. Aqui, demonstramos como monócitos são isolados e estimulados a partir de sangue humano anti-coagulado, depois de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de enriquecimento por centrifugação em gradiente de densidade. Após incubação durante 5 dias, monócitos humanos sob condições específicas são diferenciados em iDCs e estão prontos para os procedimentos experimentais em um ambiente não-clínico.

<table><tbody><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19</td><td>BD Biosciences</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e</td><td>BD Biosciences</td><td>551073</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag Anti-Human CD14 Partículas Magnéticas</td><td>BD Biosciences 557769</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Fração de Albumina V)</td><td>Carl Roth</td><td>EG-Nr 2923225</td><td></td></tr><tr><td>Placas de múltiplos poços tratadas com TC transparente Costar 6 Well</td><td>Costar</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Mídia gradiente de densidade: Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10&nbsp; ml Pipeta Sorológica</td><td></td><td>Corning 357551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25&nbsp; ml Pipeta Sorológica</td><td></td><td>Corning 357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50&nbsp; ml Tubo de centrífuga PP de alta clareza</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubos de fundo redondo</td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a</td><td>BD Biosciences</td><td>555339</td><td></td></tr><tr><td>Ghost Dye Violet 510 (Reagente de Viabilidade Celular)</td> <td>Tonbo biosciences</td><td>13-0870</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-862</td><td></td></tr><tr><td>FBS (soro bovino fetal) inativado por calor, aprovado pela UE Origem (América do Sul)</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>Hettich Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td>---</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 CC</td><td>PromoKine</td><td>C-61401</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de isolamento: BD IMag Buffer (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>solução de L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga, 1,5 ml, SuperSpin</td><td>VWR</td><td>211-0015</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2</td><td>BD Biosciences</td><td>555398</td><td></td></tr><tr><td>PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46</td><td>BD Biosciences</td><td>551265</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

As células dendríticas (DCs) reconhecem estruturas estranhas de diferentes patógenos, como vírus, bactérias e fungos, por meio de uma variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) expressos em sua superfície celular e, assim, ativam e regulam a imunidade. 
A principal função das DCs é a indução de imunidade adaptativa nos linfonodos, apresentando antígenos via moléculas de MHC I e MHC II para linfócitos T virgens. Portanto, as DCs precisam migrar da periferia para os linfonodos após o reconhecimento de patógenos nos locais de infecção. Para experimentos in vitro ou estratégias de vacinação DC, DCs derivadas de monócitos são usadas rotineiramente. Essas células mostram semelhanças em fisiologia, morfologia e função com as células dendríticas mieloides convencionais. Eles são gerados pela estimulação da interleucina 4 (IL-4) e do fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) de monócitos isolados de doadores saudáveis. Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados e estimulados a partir de sangue humano anticoagulado após o enriquecimento de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por centrifugação por gradiente de densidade. Os monócitos humanos são diferenciados em DCs imaturos e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico após 5 dias de incubação.

Após centrifugação do sangue anti-coagulado usando uma almofada de sacarose, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são enriquecidas numa interfase no topo do meio de gradiente de densidade (Figura 1). Após as PBMC são retirados, a análise FACS é realizada para caracterizar as diferentes populações de células dentro das CMSPs usando marcadores de linhagem (por exemplo, para os linfócitos T CD3, CD14 para monócitos, e CD19 para linfócitos B). <stro...

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

O objetivo geral desta técnica de separação de esferas magnéticas CD14 é isolar monócitos do sangue para sua posterior diferenciação em células dendríticas ou macrófagos in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre o reconhecimento, processamento e apresentação de patógenos ou antígenos por células dendríticas. A principal vantagem deste procedimento de isolamento é que a população de monócitos 98 a 99% puros pode ser obtida.Demonstrando o procedimento estará Karolin Thurnes, técnica do nosso grupo de trabalho. Comece dividindo o volume da bolsa de sangue entre os tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros de acordo com a quantidade de sangue recebida. Ajuste o volume final em cada tubo para 50 mililitros com PBS estéril de Dulbecco conforme necessário e centrifugue as amostras.Usando uma pipeta sorológica estéril de um mililitro conectada a uma bomba de vácuo de laboratório, remova as camadas de plasma e plaquetas, deixando as camadas limite intactas. Em seguida, use uma nova pipeta de 25 mililitros para combinar as camadas limite de células mononucleares de dois dos tubos no novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Em seguida, adicione 15 mililitros de meio de gradiente de densidade a cada um dos tubos cônicos de 450 mililitros e, pipetando lenta e cuidadosamente, sobreponha 25 mililitros de células sanguíneas agrupadas no gradiente de densidade em cada tubo.Separe as células por centrifugação. Em seguida, aspire as camadas superiores de plasma e plaquetas e transfira as interfases do PBMC para novos tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Lave os PBMCs duas vezes com até 50 mililitros de DPBS estéril, puxando as células após a primeira centrifugação e ressuspendendo o pellet em 50 mililitros de DPBS fresco após a segunda.Após a contagem, coletar as células por centrifugação para isolamento de partículas magnéticas de monócitos. Para purificar os monócitos por isolamento de partículas magnéticas, ajuste a concentração de PBMC para oito vezes 10 elevado às 7ª células por mililitro de tampão de isolamento. Em seguida, vortex as partículas magnéticas CD14 anti-humanas completamente e misture 50 microlitros de partículas para cada um vezes 10 ao 7º PBMCs nas células e transfira a solução de grânulo celular para um tubo estéril de 15 mililitros.Após 30 minutos à temperatura ambiente, ajuste o volume total para 12 mililitros de tampão de isolamento e transfira dois mililitros da suspensão de partículas celulares para cada um dos seis tubos de fundo redondo estéreis. Coloque imediatamente os tubos no ímã de separação de células por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenadante contendo os linfócitos do sangue periférico de cada tubo.Remova os tubos do ímã e adicione dois mililitros de tampão de isolamento novo a cada amostra de célula. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células e partículas e retorne os tubos ao ímã por mais cinco minutos. No final da incubação, remova o sobrenadante novamente e ressuspenda as células em dois mililitros de tampão de isolamento novo, como acabamos de demonstrar.Em seguida, puxe as frações celulares contendo monócitos CD14 positivos para um novo tubo de 50 mililitros e aumente o volume final do tubo para 50 mililitros em DPBS estéril. Para diferenciar os monócitos purificados em células dendríticas, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 50 mililitros de DPBS. Após a contagem, gire as células novamente e ressuspenda o pellet em uma concentração de uma vez 10 elevado a 6 células por mililitro e meio de cultura pré-aquecido.Transfira três mililitros de células para cada poço de uma placa de seis poços e adicione interleucina humana recombinante quatro e GMCSF a cada poço para uma incubação de 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No segundo dia de cultivo, reestimule as células com citocinas frescas e retorne a placa à incubadora. No quinto dia, puxe os sobrenadantes e pipete suavemente o meio fresco nos poços várias vezes para colher as células dendríticas imaturas.Após a separação do gradiente de densidade, uma fração típica de PBMC é composta por cerca de 4% de linfócitos B, 28% de monócitos e 68% de outras células. 44% dos quais são linfócitos T. Após a separação das partículas magnéticas, a análise por citometria de fluxo da fração negativa revela uma porcentagem semelhante de linfócitos b, uma porcentagem maior das outras populações de células e uma porcentagem muito reduzida de monócitos.A caracterização da fração positiva demonstra a alta eficiência de purificação com mais de 99% das células expressando CD14. Após cinco dias de simulação de interleucina quatro e GMCSF, as células CD14 positivas se diferenciam em células dendríticas derivadas de monócitos CD83 CD83 negativos negativos que são comparáveis às células dendríticas dérmicas na morfologia, comportamento e expressão do receptor. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro a cinco horas se for executada corretamente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar monócitos do sangue total e diferenciá-los em células dendríticas. Esta técnica é muito importante para os pesquisadores da área de imunologia explorarem não apenas as células dendríticas, mas também a função de monócitos e macrófagos no sistema celular humano primário in vitro. Após este procedimento, outros métodos como análise microscópica, citometria de fluxo, ensaios de infecção ou apresentação de antígenos podem ser realizados para responder a perguntas sobre biologia celular dendrítica, função e interações com antígenos.Não se esqueça de que trabalhar com sangue pode ser perigoso e que precauções como usar luvas, jaleco ou tomar uma vacina contra hepatite devem sempre ser tomadas antes de iniciar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Este vídeo demonstra a geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas, ou DCs, a partir de monócitos humanos. A incubação de monócitos com fatores de crescimento e citocinas leva à produção de DCs imaturas. Em resposta a moléculas reguladoras imunológicas, DCs imaturas se diferenciam em DCs tolerogênicas e maduras.

Geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas a partir de monócitos

Aqui apresentamos um protocolo que gera grandes quantidades de monócitos murinos a partir de medula óssea heterogênea para aplicações translacionais. Em comparação com outros, esse novo método ajuda a reduzir o número de animais sacrificados e reduz os custos, evitando métodos caros, como a separação de células magnéticas de alto gradiente (MACS).

Isolamento e injecção intravenosa de Murino de Medula Óssea Derivado monócitos

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.

Geração de um grande número de progenitores mieloides e células dendríticas precursores de murino medula óssea usando um celular romance classificação estratégia

O dispositivo de transimmunização (TI) ou a placa e os protocolos relacionados foram desenvolvidos para replicar as principais características da fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), em um ambiente experimental, permitindo a produção de células dendríticas ativadas fisiologicamente, células (DCs) para a imunoterapia do cancro.

Novo protocolo para a geração de células dendríticas imunogênicas fisiológicas

A metodologia descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos bovinos (MoDCs) e sua aplicação na avaliação in vitro de candidatos antigênicos durante o desenvolvimento de potenciais vacinas veterinárias em bovinos.

Determinação da imunogenicidade vacinal utilizando células dendríticas derivadas de monócitos bovinos

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a isolar monócitos de sangue humano usando separação magnética de partículas CD14 e diferenciá-los em células dendríticas imaturas. Este método alcança 98-99% de pureza para estudos imunológicos avançados.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

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