Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

O objetivo geral desta técnica de separação de esferas magnéticas CD14 é isolar monócitos do sangue para sua posterior diferenciação em células dendríticas ou macrófagos in vitro. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre o reconhecimento, processamento e apresentação de patógenos ou antígenos por células dendríticas. A principal vantagem deste procedimento de isolamento é que a população de monócitos 98 a 99% puros pode ser obtida.

Demonstrando o procedimento estará Karolin Thurnes, técnica do nosso grupo de trabalho. Comece dividindo o volume da bolsa de sangue entre os tubos de centrífuga estéreis de 50 mililitros de acordo com a quantidade de sangue recebida. Ajuste o volume final em cada tubo para 50 mililitros com PBS estéril de Dulbecco conforme necessário e centrifugue as amostras.

Usando uma pipeta sorológica estéril de um mililitro conectada a uma bomba de vácuo de laboratório, remova as camadas de plasma e plaquetas, deixando as camadas limite intactas. Em seguida, use uma nova pipeta de 25 mililitros para combinar as camadas limite de células mononucleares de dois dos tubos no novo tubo cônico estéril de 50 mililitros. Em seguida, adicione 15 mililitros de meio de gradiente de densidade a cada um dos tubos cônicos de 450 mililitros e, pipetando lenta e cuidadosamente, sobreponha 25 mililitros de células sanguíneas agrupadas no gradiente de densidade em cada tubo.

Separe as células por centrifugação. Em seguida, aspire as camadas superiores de plasma e plaquetas e transfira as interfases do PBMC para novos tubos cônicos individuais de 50 mililitros. Lave os PBMCs duas vezes com até 50 mililitros de DPBS estéril, puxando as células após a primeira centrifugação e ressuspendendo o pellet em 50 mililitros de DPBS fresco após a segunda.

Após a contagem, coletar as células por centrifugação para isolamento de partículas magnéticas de monócitos. Para purificar os monócitos por isolamento de partículas magnéticas, ajuste a concentração de PBMC para oito vezes 10 elevado às 7ª células por mililitro de tampão de isolamento. Em seguida, vortex as partículas magnéticas CD14 anti-humanas completamente e misture 50 microlitros de partículas para cada um vezes 10 ao 7º PBMCs nas células e transfira a solução de grânulo celular para um tubo estéril de 15 mililitros.

Após 30 minutos à temperatura ambiente, ajuste o volume total para 12 mililitros de tampão de isolamento e transfira dois mililitros da suspensão de partículas celulares para cada um dos seis tubos de fundo redondo estéreis. Coloque imediatamente os tubos no ímã de separação de células por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, remova o sobrenadante contendo os linfócitos do sangue periférico de cada tubo.

Remova os tubos do ímã e adicione dois mililitros de tampão de isolamento novo a cada amostra de célula. Pipete suavemente para cima e para baixo para ressuspender as células e partículas e retorne os tubos ao ímã por mais cinco minutos. No final da incubação, remova o sobrenadante novamente e ressuspenda as células em dois mililitros de tampão de isolamento novo, como acabamos de demonstrar.

Em seguida, puxe as frações celulares contendo monócitos CD14 positivos para um novo tubo de 50 mililitros e aumente o volume final do tubo para 50 mililitros em DPBS estéril. Para diferenciar os monócitos purificados em células dendríticas, colete as células por centrifugação e ressuspenda o pellet em 50 mililitros de DPBS. Após a contagem, gire as células novamente e ressuspenda o pellet em uma concentração de uma vez 10 elevado a 6 células por mililitro e meio de cultura pré-aquecido.

Transfira três mililitros de células para cada poço de uma placa de seis poços e adicione interleucina humana recombinante quatro e GMCSF a cada poço para uma incubação de 48 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No segundo dia de cultivo, reestimule as células com citocinas frescas e retorne a placa à incubadora. No quinto dia, puxe os sobrenadantes e pipete suavemente o meio fresco nos poços várias vezes para colher as células dendríticas imaturas.

Após a separação do gradiente de densidade, uma fração típica de PBMC é composta por cerca de 4% de linfócitos B, 28% de monócitos e 68% de outras células. 44% dos quais são linfócitos T. Após a separação das partículas magnéticas, a análise por citometria de fluxo da fração negativa revela uma porcentagem semelhante de linfócitos b, uma porcentagem maior das outras populações de células e uma porcentagem muito reduzida de monócitos.

A caracterização da fração positiva demonstra a alta eficiência de purificação com mais de 99% das células expressando CD14. Após cinco dias de simulação de interleucina quatro e GMCSF, as células CD14 positivas se diferenciam em células dendríticas derivadas de monócitos CD83 CD83 negativos negativos que são comparáveis às células dendríticas dérmicas na morfologia, comportamento e expressão do receptor. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em quatro a cinco horas se for executada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar monócitos do sangue total e diferenciá-los em células dendríticas. Esta técnica é muito importante para os pesquisadores da área de imunologia explorarem não apenas as células dendríticas, mas também a função de monócitos e macrófagos no sistema celular humano primário in vitro. Após este procedimento, outros métodos como análise microscópica, citometria de fluxo, ensaios de infecção ou apresentação de antígenos podem ser realizados para responder a perguntas sobre biologia celular dendrítica, função e interações com antígenos.

Não se esqueça de que trabalhar com sangue pode ser perigoso e que precauções como usar luvas, jaleco ou tomar uma vacina contra hepatite devem sempre ser tomadas antes de iniciar este procedimento.