Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogênicas murinas para a avaliação de sua utilidade imunoterapêutica no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia tolerogênica com células dendríticas, fornecendo um método padronizado para desenvolver e caracterizar funcionalmente células dendríticas tolerogênicas. As principais vantagens desta técnica são que ela pode ser usada para o desenvolvimento bem-sucedido de células dendríticas tolerogênicas e para testes de eficácia de células dendríticas tolerogênicas funcionais.

As implicações dessa técnica são significativas. Eles se estendem ao desenvolvimento de imunoterapia celular para doenças autoimunes, pois as células dendríticas tolerogênicas podem redefinir uma resposta imune anormal enquanto permanecem sujeitas a mecanismos reguladores imunológicos intrínsecos. Após a colheita dos ossos da perna traseira de camundongos C57BL / 6 de oito a 10 semanas de idade, de acordo com os protocolos padrão, use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o máximo de tecido possível e coloque as tíbias e fêmures limpos em uma placa de cultura de seis centímetros contendo 70% de etanol.

Apare ambas as extremidades dos ossos com uma lâmina cirúrgica e use uma seringa de três mililitros, equipada com uma agulha de calibre 23, para lavar a medula do primeiro osso com três mililitros de PBS em um tubo cônico de 15 mililitros. Quando toda a medula tiver sido coletada, centrifugue a suspensão celular e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após cinco minutos, pare a lise com nove mililitros de PBS e colete as células por centrifugação.

Ressuspenda o pellet branco de células da medula óssea em 10 mililitros de meio de cultura e filtre as células através de um filtro de células de 40 micrômetros em um novo tubo. Ajustar as células para uma concentração de uma vez 10 elevado ao sexto por mililitro em meio de cultura suplementado com GM-CSF e IL-4. E coloque três mililitros de células em cada poço de uma placa de 6 poços para uma incubação de três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

No terceiro dia, lave as células em cada poço com dois mililitros de PBS e gire suavemente para remover as células não aderentes. Em seguida, alimente as células com três mililitros de meio de cultura fresco suplementado com GM-CSF e IL-4 e retorne as células à incubadora de cultura de células, adicionando mais três mililitros de meio de cultura fresco, suplementado com citocinas em cada poço após dois dias. No sétimo dia de cultura, coloque o prato no gelo.

Após 10 minutos, pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar as células dendríticas derivadas da medula óssea frouxamente aderentes e imaturas em suspensão. Em seguida, agrupar as células para coleta por centrifugação e ressuspender o pellet no volume apropriado de meio de cultura fresco para posterior análise a jusante. Para medir a proliferação de células T singênicas, primeiro use a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de três mililitros para esmagar um baço de um camundongo OT2 C57BL / 6 de oito a 10 semanas de idade através de um filtro de células de 40 micrômetros e enxágue o filtro com PBS.

Pulverize a suspensão de células agrupadas por centrifugação e ressuspenda o pellet em 400 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas e 100 microlitros de coquetel de biotina-anticorpo de células T CD4 positivas a quatro graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, adicione 300 microlitros de tampão de classificação e 200 microlitros de esferas anti-biotina às células por uma incubação de 10 minutos e quatro graus Celsius e coloque uma coluna de esferas magnéticas e um filtro de pré-separação em um ímã de separação de células de tamanho apropriado. Enxágue a coluna com três mililitros de tampão de classificação e adicione nove mililitros de tampão de classificação às células.

Após a centrifugação, ressuspenda a célula e o grânulo em três mililitros de tampão de triagem e adicione a suspensão da célula à coluna para coletar o eluato de células T CD4 positivas em um recipiente apropriado. Em seguida, lave a coluna com mais três mililitros de tampão de triagem, coletando o fluxo e coloque as células T no gelo. Para isolamento singênico de células dendríticas esplênicas, coloque o baço de um camundongo C57BL / 6 de oito a dez semanas de idade em uma placa de cultura de seis centímetros e use uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de calibre 25, para injetar um mililitro de solução de colagenase D no baço duas vezes.

Em seguida, use uma tesoura para cortar o baço em pedaços pequenos e incube os pedaços agitando em temperatura ambiente por 25 minutos. No final da incubação, adicione 500 microlitros de EDTA 0,5 molar à pasta de tecido para uma incubação final de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, use a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de três mililitros para triturar a pasta do baço através de um filtro de células de 40 micrômetros e coletar as células por centrifugação.

Ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas, 50 microlitros de reagente bloqueador de receptor Fc e 100 microlitros de coquetel de biotina-anticorpo de células dendríticas pan para uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células em nove mililitros de tampão de classificação e ressuspenda o pellet em 800 microlitros de tampão de classificação fresco com 200 microlitros de grânulos anti-biotina a quatro graus Celsius por 10 minutos para isolamento da população de células dendríticas do pan esplênico por classificação magnética de grânulos, como acabamos de demonstrar. Ressuspenda as células em uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto dendrítico por mililitro e trate-as com a concentração experimental apropriada do triterpenóide de interesse por uma hora a 37 graus Celsius.

Durante o último terço da incubação, ressuspenda as células T em uma concentração de uma vez 10 elevado à sétima células por mililitro em um CFSE micromolar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células com PBS e reajuste o volume para uma concentração final de duas vezes 10 elevado às sextas células T por mililitro. Co-cultive 100 microlitros das células dendríticas tratadas com 100 microlitros de células T CD4 positivas marcadas com CFSE em cada poço de uma placa de 96 poços e adicione 100 nanogramas por mililitro de peptídeo OVA 323-329 às células, medindo a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após dois a três dias de incubação.

Células progenitoras da medula óssea cultivadas em meio completo, na presença de GM-CSF e IL-4, exibem uma morfologia de células dendríticas imaturas após seis dias em cultura. A análise de células dendríticas derivadas da medula óssea imaturas do sétimo dia revela a expressão robusta de CD11c, um marcador específico de células dendríticas murinas, pela maioria das células cultivadas. Apesar da falta de efeito na expressão de marcadores de maturação induzidos por LPS, as células dendríticas derivadas da medula óssea exibem um perfil de células dendríticas tolerogênicas em resposta ao tratamento com CDDO-DFPA, conforme evidenciado pela redução significativa na expressão gênica pró-inflamatória e uma expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias aprimorada, mesmo após a estimulação com LPS.

Além disso, uma redução significativa na proliferação de células T específicas para OVA singênico é observada em co-culturas in vitro nas quais o OVA é apresentado por células dendríticas tratadas com CDDO-DFPA e in vivo, como evidenciado por uma progressão tardia para encefalomielite autoimune experimental após a injeção de células dendríticas tratadas com CDDO-DFPA pulsadas por MOG, confirmando ainda mais o fenótipo tolerogênico dessas células. Uma vez dominada essa técnica, as células dendríticas tolerogênicas podem ser desenvolvidas em oito dias, se os experimentos forem realizados adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as células dendríticas tolerogênicas não são homogêneas.

Seu fenótipo celular depende da natureza dos agentes usados para a indução de sua tolerância. Após este procedimento, outros métodos, como análise citometria de fluxo detalhada, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a energia ou apoptose de células T específicas antigênicas induzidas por células dendríticas tolerogênicas ou a capacidade de diferenciação de células T. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver células dendríticas tolerogênicas funcionalmente ativas usando agentes conhecidos ou como testar a capacidade de novas substâncias de induzir essas células.