Name: Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprenda a desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogênicas murinas para imunoterapia de doenças autoimunes como esclerose múltipla. Este protocolo padronizado permite testar a eficácia funcional dessas células.

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Agradecemos Reata Pharmaceuticals fornecendo CDDO-DFPA. Também reconhecemos o apoio da Jane e Lee Seidman Presidente em inovação de câncer pediátrico (John Letterio). Este trabalho foi financiado pelo departamento de defesa [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler adolescentes e jovens adultos câncer iniciativa de pesquisa no caso Comprehensive Cancer Center; e o prêmio de estudioso de Callahan graduado de Hsi-Ju Wei da Fundação FJ Callahan.

Todos os estudos foram realizados em conformidade com os procedimentos aprovados do caso Western Reserve University School of Medicine cuidado institucional do Animal e Comitê de uso.
1. preparar células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs)
<ol><li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.</li>
	<li>Eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Impostos especiais de consumo ossos tíbia-fíbula e fêmur usando uma tesoura cirúrgica e colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 10 cm.</li>
	<li>Use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o tecido fora tanto quanto possível na tampa do cm 10 cultura prato e isolar tíbias e fêmures de colocá-los com 70% de etanol em um prato de cultura de 6 cm.</li>
	<li>Use lâminas cirúrgicas para ambas as extremidades de tíbias e fêmures. Use 3 mL de PBS em seringa de 3 ml com agulha 23G para liberar o conteúdo da medula de uma extremidade dos ossos para um tubo cônico contendo 12 ml de PBS. Repita este passo 3 x para cada extremidade dos ossos.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão de eritrócitos a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células com tampão de lise de 1ml ACK para 5 minutos para remover células vermelhas do sangue.</li>
	<li>Adicione 9 ml de PBS para diluir o tampão de Lise ACK e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender com 10 ml de meio de cultura (RPMI 1640 plus L-glutamina, 10% FBS, 1% não-essenciais aminoácidos (x 100), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoetanol e 5% de penicilina/estreptomicina). Nota: O nível de endotoxinas tem que ser menos de 0.1 EU/ml no FBS.</li>
	<li>Passar a suspensão de células através de um filtro de célula 40 μm e levar 20 µ l de suspensão de células e misture com 80 µ l de trypan azul para contar o número de células vivas usando citômetro.</li>
	<li>Ajuste o número de células a 1 x 106 células/ml com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml.</li>
	<li>3 ml de 1 x 106 células/ml em cada poço da placa de 6 a placa e incubar as células em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: As células da medula óssea de um rato é em torno de 3-5 x 107 células, indicando que pode ser colocada de 2 para 3 placas de 6 boas.</li>
	<li>No dia 3, remova todos os 3 ml de meio de cultura de cada poço, adicionar 2 ml PBS fresca em cada poço, e em seguida agite suavemente a placa para garantir a remoção de todas as células não-aderentes.</li>
	<li>Substitua 3 ml de meio de cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 em cada poço de 10 ng/ml. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade a incubadora de CO2 .</li>
	<li>No dia 5, diretamente Adicione outro 3 ml meio cultura fresco com 15 ng/ml, GM-CSF e IL-4 de 10 ng/ml em cada poço. Incube as celulas em 37° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: O volume total em cada poço agora é 6 ml.</li>
	<li>No dia 7, coloque o prato inteiro no gelo por 10 minutos. Pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar o frouxamente aderentes BMDCs como os iDCs em suspensão. Nota: Os macrófagos aderentes ainda estão conectados à placa. Procedimentos e suavemente a baixa temperatura são a chave para evitar a ativação de DC para afetar ainda mais experiências.</li>
	<li>Centrifugar a suspensão celular de 300 x g, durante 5 minutos e ressuspender com meio de cultura fresco para novas experiências. Nota: BMDCs podem ser identificadas com fluorescência-etiquetada CD11c anticorpo por citometria de fluxo e mostramos nossa estratégia associada de BMDCs para novas experiências na Figura 1.</li>
</ol>2. caracterizar o Gene TolDC e perfil de proteína
<ol><li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 h a 37 ° C, 5% de CO2 e 95% de umidade a incubadora de CO2 . Nota: CDDO-DFPA, um sintético triterpenoides, é um fator nuclear (eritroide-derivado 2) - como - 2 indutor de fator (Nrf2) e inibidor de fator nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a outros agentes para indução de TolDCs de iDCs, tais como IL-10, vitamina D3, dexametasona ou Baía 11-7085 e modificar esta etapa para uma condição ideal para cada agente.</li>
	<li>Adicione 10 ou 100 ng/ml de LPS pela incubação 4-24 hrs para induzir mDCs (tempo de incubação é diferente devido a medição do mRNA ou proteína).</li>
	<li>Delicadamente, pipetar o meio de cultura em cada poço e colher a suspensão de células usando uma pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g, durante 5 minutos para coletar as células e o sobrenadante, respectivamente.</li>
	<li>Analisar as superfície ligantes de Pelotas o celular por citometria de fluxo, tais como ligantes estimulatórios: CD40, CD80 e CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligantes inibitórios: PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.</li>
	<li>Isolar o RNA de Pelotas a célula e analisar o RNA e o sobrenadante amostras para os níveis de citocinas perfil e gene e proteína por PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) e ELISA, respectivamente. Nota: por exemplo, citocinas inflamatórias: TNF-α, relato, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL-23 ou anti-inflamatórios citocinas: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.</li>
</ol>3. avaliar a função de TolDCs In Vitro e In Vivo
<ol><li>
Ensaio de Syngeneic de proliferação de células T
	<ol>
<li>Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos através de autoclavagem e realizar o experimento em classe II de segurança biológica com procedimentos de segurança adequados.</li>
		<li>Prepare o buffer de MACS usando 0,5% albumina de soro bovino (BSA) e 2 mM de EDTA em 500 ml de PBS. Esterilize o buffer por filtragem através de um filtro de 0,2 µm. Nota: Mantenha o buffer no gelo durante o experimento a seguir.</li>
		<li>Para obter o CD4+ T células, eutanásia em ratos transgénicos do OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica.</li>
		<li>Colocar o baço com 2 ml de PBS em um prato de cultura de 6 cm e usar a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o baço, passando um filtro de célula 40 μm.</li>
		<li>Recolha a suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 400 μl de tampão de MACS.</li>
		<li>Adicionar 100 μl de CD4+ T Cell biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 5 minutos. Nota: O anticorpo cocktail vincula em outros tipos de célula, exceto CD4+ T células, tais como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-classe II, Ter-119 e TCRγ/δ.</li>
		<li>Adicione 300 μl de tampão de MACS e 200 μl de antigrânulos biotina (Tabela de materiais) a 4° C por 10 minutos.</li>
		<li>Lugar da coluna composta de esferas ferromagnéticas (Tabela de materiais) e filtro de pré-separação juntos no magnético campo e enxaguá-lo com 3 ml de tampão de MACS.</li>
		<li>Adicione 9 ml de tampão de MACS nas células e centrifugar 300 x g por 5 min.</li>
		<li>Ressuspender as células em 3 ml de tampão de MACS e aplique na coluna. Coleta de passagem contendo CD4+ T células.</li>
		<li>Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS e também coletar o escoamento.</li>
		<li>Para obter o pan esplênica DCs, eutanásia em camundongos C57BL/6 8-10 semanas de idade usando câmara de CO2 . Coloque o mouse sobre um tabuleiro de dissecação e enxágue com etanol a 70%. Isole o baço do lado esquerdo do abdômen com o uso de fórceps e a tesoura cirúrgica. Coloque o baço em um prato de cultura de 6cm contendo 2 ml de solução de colagenase D (colagenase 2 mg/ml D dissolvido em HBSS contendo cálcio, magnésio).</li>
		<li>Injecte 1 ml da solução de colagenase D o baço duas vezes com uma seringa de 1 ml e uma agulha de 25G. Corte o baço em pequenos pedaços com uma tesoura pequena.</li>
		<li>Agitar e incubar a temperatura ambiente por 25 minutos.</li>
		<li>Adicione 500 μl de EDTA 0,5 M à temperatura ambiente por 5 minutos. Nota: Os passos de 3.1.13-3.1.14 são essenciais para aumentar o rendimento do DCs.</li>
		<li>Agora use a parte de trás do empurrador da seringa de 3 ml para picar o chorume do baço, passando um filtro de célula 40 μm e coletar a suspensão de células por centrifugação a 300 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Ressuspender as células em 350 μl de tampão MACS, 50 µ l de reagente de bloqueio de FcR e 100 μl de Pan células dendríticas biotina-anticorpo Cocktail a 4° C por 10 minutos. Nota: O anticorpo cocktail contra antígenos que não são expressas por DCs.</li>
		<li>Lave as células pela adição de 9 ml de tampão de MACS e centrifugar a 300 x g por 5 minutos.</li>
		<li>Ressuspender as células em 800 μl de tampão de MACS e adicionar 200 μl de antigrânulos biotina a 4 ° C por 10 minutos.</li>
		<li>Repita as etapas de 3.1.9-3.1.11 para coletar DCs.</li>
		<li>Lavar a coluna com outro 3 ml de tampão de MACS duas vezes e também coletar o escoamento.</li>
		<li>Tratar a 2 x 105 DCs/ml na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C para 1 hr separadamente, rótulo o CD4+ T células (1 x 107/ml) com 1 μM CFSE a 37 ° C por 15 minutos, lave com PBS e reajustar o volume para obter a concentração final de 2 x 106 T células/ml.</li>
		<li>Em seguida, em uma placa de 96 poços, co cultura 100 μl de células dendríticas tratadas com o mesmo volume de CD4 CFSE-rotulado+ T cells, ambos colhidos os passos acima para obter 01:10 proporção. Agora adicione 100 ng/mL ovalbumina (OVA) peptídeo 323-329 por bem e medir a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após 2-3 dias de incubação. Nota: O número de células e a relação de DCs e T células foram otimizadas de nossa anterior trabalho37.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Induzir o passivo EAE injetando BMDCs pulsada com mielina Oligodendrocyte glicoproteína (MOG) (35-55)
	<ol>
<li>Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por bem em 6-placa com meio de cultura na presença ou ausência de 100-400 nM CDDO-DFPA para incubar 1 hr.</li>
		<li>Adicionar 10 ng/ml de LPS para incubação 24 hrs.</li>
		<li>Adicionar 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubação 4 hrs.</li>
		<li>A suspensão de células e centrifugar 300 x g por 5 min. da colheita.</li>
		<li>Ressuspender as células com PBS e contar as células.</li>
		<li>Por via subcutânea injete 200 μl de 2 x 106 células de camundongos C57BL/6 fêmeas de 8-10 semanas de idade (100 μl em cada pata traseira).</li>
		<li>No dia da injeção de BMDC e 48 hrs. mais tarde, injetar 200 ng de toxina pertussis (PTX) em cada rato.</li>
		<li>Repita etapas 3.2.6-3.2.7 uma vez por semana durante 4 semanas consecutivas.</li>
		<li>Avalie os sintomas clínicos da EAE diariamente usando critérios padrão37 (0.5-manco cauda final, cauda 1-manco, fraqueza do membro posterior de 2-moderado, 3-grave membro posterior fraqueza, paralisia dos membros posteriores de 4-completo, estado 5-quadriplegia ou moribundo, morte-6).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Este artigo descreve um protocolo eficiente que pode ser usado para reproducibly para gerar CIDS e posteriormente diferenciá-los em TolDCs, e propomos que isto pode ser aplicado para avaliar a capacidade de novos agentes de alvo molecular para induzir a TolDC fenótipo. Conforme descrito neste relatório, seguimos uma sequência em que primeiro foram analisados TolDC expressão de ligantes de superfície por citometria de fluxo, seguida por uma avaliação do perfil de citocinas do DC medido por qRT-PCR e ELISA. Finalmente, a f...

Células dendríticas (DCs) são parte integrante do sistema imune inato e primeiro foram descobertas e caracterizadas por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 como principal antígeno profissional apresentando células1. DCs foram mostrados a desempenhar um papel importante na ativação imune, apresentando transformados de antígenos de células T e células B através de complexos de histocompatibilidade (MHC) em órgãos linfoides secundários de ligação a sistemas de imune inata e adaptativa2. No sistema imunológico dos mamíferos, existem pelo menos duas categorias de DCs, que tem sido descritos como mieloide DCs e plasmocitoide DCs (pDCs)3. DCs mieloides, também conhecidos como DCs convencionais (conjuntos), caracterizam-se pela expressão de CD11c e podem ser diferenciados como imaturo DCs (CIDS) em vitro de células progenitoras de medula óssea ou monócitos do sangue periférico utilizando Granulócito-macrófago-colônia-estimulando factor (GM-CSF) e IL-4 na espécie humana ou murino, respectivamente4.
Ativar o 'perigo' sinais, tais como padrões moleculares associados patógeno (PAMP) ou padrões moleculares associados a danos (DAMP), irá conduzir iDCs maturação em direção a DCs imunogênicas como maduros DCs (mDCs) através da ligação de vários receptores de reconhecimento padrão a superfície de DC5. Imunogênicas DCs mais prime ingênuo T proliferação e diferenciação celular através da regulação alta de MHCII2ligantes co-estimulação (CD80, CD86 e CD40)6, citocinas e outros mediadores solúveis7. Uma cascata de produção pro-inflamatórios mediador de DCs imunogênica é essencial para a diferenciação de pilha de T mediada por citocinas. Por exemplo, tanto o IFN-γ e IL-12 são necessários para a diferenciação de células Th18 e Il-1, IL-6 e IL-23 são críticos para ingênuo células T polarização no sentido de células Th179. Embora maduros DCs reagem aos antígenos estranhos, ativação descontrolada de DC por autoantígenos pode causar ablação de tolerância e fomentar o desenvolvimento de doenças autoimunes, gerando células auto-reativas T, cuja ativação leva à destruição de tecido10 .
Relatórios recentes forneceram evidência clara de plasticidade DC, exemplificada pela sua capacidade de interagir com diferentes pistas dentro de seu microambiente de tecido e de se diferenciar em subconjuntos distintos efetor/supressor DC. Os mediadores anti-inflamatórios, tais como IL-10,11e TGF-β12HO-113 foram mostrados a desempenhar um papel importante na supressão imune através da indução de tolerogenic DCs (TolDCs). Estes TolDCs adquirir funções reguladoras e suprimir a proliferação de células T14. Além disso, a falta de estimulação co pela DCs e a produção de mediadores anti-inflamatórios da TolDCs tanto contribuem para a indução de células T reguladoras (Tregs) e também efetivamente inibir tanto Th1 e Th17 diferenciação e expansão15. Nas últimas duas décadas, o potencial terapêutico de TolDCs foi relatado por diversos investigadores. Nesses estudos, a administração da ex-vivo gerado TolDCs não só melhorada sintomas patológicos em diferentes modelos pré-clínicos de doenças auto-imunes16 mas também levou ao desenvolvimento de tolerância imunológica em pacientes17 ,18. Curiosamente, hoje a terapia de TolDCs tem sido considerada como uma abordagem alternativa ou adjuvante para doenças auto-imunes em vários ensaios clínicos, incluindo o tipo 1 diabetes mellitus19, artrite reumatoide20, 21, esclerose múltipla (MS)22,23,24e doença de Crohn25.
Há uma variedade de protocolos que têm sido empregadas para desenvolver TolDCs e vários laboratórios relataram métodos para geração e Caracterização fenotípica de TolDCs. Estes métodos podem ser usados para gerar reproducibly TolDCs em vitro de progenitores hematopoiéticos e estàvel, mantê-los em um tolerogenic estado na vivo26,,,27,2829. Os iDCs pode ser convertida em TolDCs pela exposição a vários agentes farmacológicos imunomoduladores ou citocinas anti-inflamatórias. Por exemplo, a vitamina D3 é um conhecido agente farmacológico conhecido para aumentar a produção de IL-10 e suprimir a secreção de IL-12 de DCs e, assim, aumentar sua função imunossupressora30. Além disso, quando DCs são expostos a estímulos inflamatórios potentes, tais como lipopolissacarídeos (LPS), vários agentes farmacológicos tais como dexametasona31, rapamicina32e corticosteroides33 foram mostrados para induzir a TolDC fenótipo, reduzindo a expressão de superfície DC de CD40, CD80, CD86 e MHCII34. IL-10 e TGF-β são as citocinas anti-inflamatórias mais estudado para induzir DC tolerância35 e a exposição concomitante a ambos dessas citocinas têm sido mostradas para induzir um fenótipo tolerogenic em DCs36.
Desde o tolerogenic que DC é definido pelas características funcionais, ao invés de por marcadores fenotípicos, há um grande precisa desenvolver um método consistente para a caracterização funcional e celular de TolDCs. Além disso, um protocolo rigoroso e consistente deve ser estabelecido para a avaliação consistente e caracterização do fenótipo tolerogenic DC se estamos efetivamente e reproducibly comparar a capacidade de novos agentes para induzir o fenótipo TolDC na laboratório. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado com métodos passo a passo para isolar CIDS de progenitores hematopoiéticos de ratos e posteriormente analisar a eficácia de novos agentes sob avaliação pela sua capacidade de converter iDCs em TolDCs, fornecendo um robusto Caracterização fenotípica e funcional de TolDCs tanto in vitro e in vivo. Esta descrição inclui um método elaborado para caracterizar a TolDCs por seus ligantes de superfície, perfil de citocinas e imunossupressoras funções em vitro. Nós também fornecemos um exemplo de um método para explorar a potencial aplicação terapêutica destes TolDCs em um modelo pré-clínico de MS, encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Este protocolo estabelecido ajudará os investigadores para avaliar a capacidade de novos agentes para promover a indução de TolDCs e irá facilitar o esforço para ampliar o escopo do desenvolvimento terapêutico de TolDC.

<table><tbody><tr><td>CDDO-DFPA (RTA-408)</td><td>Reata Pharmaceuticals</td><td>em síntese interna</td><td>Cultura</td></tr><tr><td>de células Mouse GM-CSF</td><td>Peprotech Inc.</td><td>315-03</td><td>Diferenciação BMDC</td></tr><tr><td>Mouse IL-4</td><td>Peprotech Inc.</td><td>214-14</td> Lipopolissacarídeos de <td>diferenciação BMDC</td></tr><tr><td>(LPS)</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>L2880</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>516732</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Toxina pertussis (PTX)</td><td>R& D systems</td><td>3097</td><td>EAE indução</td></tr><tr><td>MOG (35&ndash; 55) peptídeo</td><td>21stCentury Bioquímicos</td><td>em síntese interna</td><td>EAE indução</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>RPMI-1640 mais L-glutamina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11875-093</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>Aminoácido não essencial (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Cultura de células</td></tr><tr><td>40 &#956; filtro de células m</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Isolamento celular</td></tr><tr><td>CD80 conjugado com PE</td><td>BD Biosciences</td><td>557227</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CD86 conjugado com PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>PD-L1 conjugada com PE</td><td>BioLegend</td><td>124307</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>MHCII conjugada com APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-112-388</td><td></td></tr><tr><td>Citometria de fluxo CD11c conjugado com APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Isotipo correspondente PE</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-835</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>Isotipo compatível com APC</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-091-836</td><td>Citometria de fluxo</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>BioLegend</td><td>423801</td><td>Ensaio de proliferação de células T</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de células dendríticas Pan</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875</td><td>Ensaio de proliferação de células</td></tr><tr><td>T FcR bloqueando o reagente</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>Anti-Biotina MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-100-875 Ensaio de</td><td>proliferação de células</td></tr><tr><td>T CD4 + Kit de isolamento de células T</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>CD4 + Célula T Biotina-Anticorpo Coquetel</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>Anti-Biotina MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-104-454 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>Tampão de lise ACK</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1049201</td><td>Diferenciação BMDC</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td>309626</tr><tr><td>Seringa de 3 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>Diferenciação BMDC</td></tr><tr><td>Agulha 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>309626</td><td>Ensaio de proliferação de células T</td></tr><tr><td>Agulha 23G</td><td>BD Biosciences</td><td>309588</td><td>diferenciação BMDC</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>Ensaio de proliferação de células T</td> <td>A2058</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575020</td><td>Ensaio de proliferação de células T</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-042-401 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>Filtro de pré-separação</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-095-823 Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td></tr><tr><td>colagenase D</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>Ensaio de</td><td>proliferação de células T</td>11088858001</tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025076</td><td>ensaio de proliferação de células T</td></tr><tr><td>ovalbumina (OVA) peptídeo 323- 329</td><td>Sigma Aldrich Inc.</td><td>Ensaio de proliferação de células T</td> <td>O1641</td></tr><tr><td>Camundongo IFN-&gama; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01168134_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00434165</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA</td><td>R& D sistemas</td><td>DY419-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>Mouse EDN-1 ELISA</td><td>RayBiotech</td><td>ELM-EDN1-1</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>TNF-&alpha; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00443258</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse TNF-&alpha; Kit ELISA Quantikine</td><td>R& D systems</td><td>MTA00B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-6 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm00446190</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit</td><td>R& D systems</td><td>M6000B</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-23a Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01160011</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Mouse IL-23 DuoSet ELISA</td><td>R& Sistemas D</td><td>DY1887-05</td><td>ELISA</td></tr><tr><td>IL-4 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm99999154_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>IL-10 Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01288386_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>TGF-&beta; Sonda TaqMan</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Mm01178820_m1</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Heme Oxigenase 1 anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab13248</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-actina</td><td>Abcam</td><td>ab8226</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Sistema de detecção de PCR em tempo real</td><td>Bio-Rad Inc.</td><td></td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Citometria de fluxo</td></tr></tbody></table>

desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas tolerogenic murino

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

O sistema imunológico funciona através da manutenção de um equilíbrio apertado entre as respostas coordenação contra antígenos estranhos e manter um estado sem resposta contra autoantígenos, bem como antígenos derivados de organismos comensais. O rompimento da homeostase imune pode levar à inflamação crônica e para o desenvolvimento de auto-imunidade. Células dendríticas (DCs) são as células apresentadoras profissionais do sistema imunológico inato envolvida na ativação de células T de ingênuo para iniciar respostas imunes contra antígenos estranhos. No entanto, a DCs também podem ser diferenciados em TolDCs que agem para manter e promover a tolerância de células T e a suprimir as células efetoras, contribuindo para o desenvolvimento das condições de qualquer inflamação auto-imune ou crônica. O recente avanço em nossa compreensão de TolDCs sugere que a tolerância de DC pode ser alcançada, modulando suas condições de diferenciação. Este fenômeno tem levado ao crescimento tremendo no desenvolvimento de terapias TolDC por numerosos distúrbios imunológicos causados devido a quebrar em tolerância imunológica. Estudos bem sucedidos em murino modelos pré-clínicos auto-imunidade ainda mais tem validado o utilitário imunoterapia de TolDCs no tratamento de doenças auto-imunes. Hoje, TolDCs tornaram-se uma ferramenta promissora e imunoterapia na clínica para reintegrar tolerância imunológica em várias desordens imunes ao direcionar respostas auto-imunes patogénicas deixando intacta a imunidade protetora. Embora vários laboratórios para induzir TolDCs propôs uma matriz de estratégias, não há nenhuma consistência em caracterizar o fenótipo celular e funcional dessas células. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento da DCs derivadas da medula óssea em grandes números, um método exclusivo usado para diferenciá-los em TolDCs com um sintético triterpenoides 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic ácido-diflúor-propil-Amida (CDDO-DFPA) e as técnicas utilizadas para confirmar o seu fenótipo, incluindo análises de assinaturas moleculares essenciais de TolDCs. Finalmente, mostramos um método para avaliar a função TolDC testando sua resposta imunossupressoras em vitro e em vivo em um modelo pré-clínicos de esclerose múltipla.

A diferenciação e seleção de BMDCs:
Células progenitoras de medula óssea foram cultivadas em meio RPMI completo na presença de GM-CSF e IL-4, de se diferenciarem em iDCs para 7 dias (figura 1A). No dia 1, as células eram pequenas em tamanho e mostraram a morfologia esférica. Lavagem com PBS antes da substituição de meio fresco no dia 3 ajudou células para clusters de forma e também ...

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogênicas murinas para a avaliação de sua utilidade imunoterapêutica no tratamento de doenças autoimunes, como a esclerose múltipla. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da terapia tolerogênica com células dendríticas, fornecendo um método padronizado para desenvolver e caracterizar funcionalmente células dendríticas tolerogênicas. As principais vantagens desta técnica são que ela pode ser usada para o desenvolvimento bem-sucedido de células dendríticas tolerogênicas e para testes de eficácia de células dendríticas tolerogênicas funcionais.As implicações dessa técnica são significativas. Eles se estendem ao desenvolvimento de imunoterapia celular para doenças autoimunes, pois as células dendríticas tolerogênicas podem redefinir uma resposta imune anormal enquanto permanecem sujeitas a mecanismos reguladores imunológicos intrínsecos. Após a colheita dos ossos da perna traseira de camundongos C57BL / 6 de oito a 10 semanas de idade, de acordo com os protocolos padrão, use lâminas cirúrgicas e fórceps para dissecar o máximo de tecido possível e coloque as tíbias e fêmures limpos em uma placa de cultura de seis centímetros contendo 70% de etanol.Apare ambas as extremidades dos ossos com uma lâmina cirúrgica e use uma seringa de três mililitros, equipada com uma agulha de calibre 23, para lavar a medula do primeiro osso com três mililitros de PBS em um tubo cônico de 15 mililitros. Quando toda a medula tiver sido coletada, centrifugue a suspensão celular e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de lise de glóbulos vermelhos. Após cinco minutos, pare a lise com nove mililitros de PBS e colete as células por centrifugação.Ressuspenda o pellet branco de células da medula óssea em 10 mililitros de meio de cultura e filtre as células através de um filtro de células de 40 micrômetros em um novo tubo. Ajustar as células para uma concentração de uma vez 10 elevado ao sexto por mililitro em meio de cultura suplementado com GM-CSF e IL-4. E coloque três mililitros de células em cada poço de uma placa de 6 poços para uma incubação de três dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No terceiro dia, lave as células em cada poço com dois mililitros de PBS e gire suavemente para remover as células não aderentes. Em seguida, alimente as células com três mililitros de meio de cultura fresco suplementado com GM-CSF e IL-4 e retorne as células à incubadora de cultura de células, adicionando mais três mililitros de meio de cultura fresco, suplementado com citocinas em cada poço após dois dias. No sétimo dia de cultura, coloque o prato no gelo.Após 10 minutos, pipete suavemente o meio de cultura em cada poço para desalojar as células dendríticas derivadas da medula óssea frouxamente aderentes e imaturas em suspensão. Em seguida, agrupar as células para coleta por centrifugação e ressuspender o pellet no volume apropriado de meio de cultura fresco para posterior análise a jusante. Para medir a proliferação de células T singênicas, primeiro use a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de três mililitros para esmagar um baço de um camundongo OT2 C57BL / 6 de oito a 10 semanas de idade através de um filtro de células de 40 micrômetros e enxágue o filtro com PBS.Pulverize a suspensão de células agrupadas por centrifugação e ressuspenda o pellet em 400 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas e 100 microlitros de coquetel de biotina-anticorpo de células T CD4 positivas a quatro graus Celsius por cinco minutos. No final da incubação, adicione 300 microlitros de tampão de classificação e 200 microlitros de esferas anti-biotina às células por uma incubação de 10 minutos e quatro graus Celsius e coloque uma coluna de esferas magnéticas e um filtro de pré-separação em um ímã de separação de células de tamanho apropriado. Enxágue a coluna com três mililitros de tampão de classificação e adicione nove mililitros de tampão de classificação às células.Após a centrifugação, ressuspenda a célula e o grânulo em três mililitros de tampão de triagem e adicione a suspensão da célula à coluna para coletar o eluato de células T CD4 positivas em um recipiente apropriado. Em seguida, lave a coluna com mais três mililitros de tampão de triagem, coletando o fluxo e coloque as células T no gelo. Para isolamento singênico de células dendríticas esplênicas, coloque o baço de um camundongo C57BL / 6 de oito a dez semanas de idade em uma placa de cultura de seis centímetros e use uma seringa de um mililitro, equipada com uma agulha de calibre 25, para injetar um mililitro de solução de colagenase D no baço duas vezes.Em seguida, use uma tesoura para cortar o baço em pedaços pequenos e incube os pedaços agitando em temperatura ambiente por 25 minutos. No final da incubação, adicione 500 microlitros de EDTA 0,5 molar à pasta de tecido para uma incubação final de cinco minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, use a extremidade traseira de um êmbolo de seringa de três mililitros para triturar a pasta do baço através de um filtro de células de 40 micrômetros e coletar as células por centrifugação.Ressuspenda o pellet em 350 microlitros de tampão de classificação de células magnéticas, 50 microlitros de reagente bloqueador de receptor Fc e 100 microlitros de coquetel de biotina-anticorpo de células dendríticas pan para uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius. No final da incubação, lave as células em nove mililitros de tampão de classificação e ressuspenda o pellet em 800 microlitros de tampão de classificação fresco com 200 microlitros de grânulos anti-biotina a quatro graus Celsius por 10 minutos para isolamento da população de células dendríticas do pan esplênico por classificação magnética de grânulos, como acabamos de demonstrar. Ressuspenda as células em uma concentração de duas vezes 10 elevado ao quinto dendrítico por mililitro e trate-as com a concentração experimental apropriada do triterpenóide de interesse por uma hora a 37 graus Celsius.Durante o último terço da incubação, ressuspenda as células T em uma concentração de uma vez 10 elevado à sétima células por mililitro em um CFSE micromolar por 15 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células com PBS e reajuste o volume para uma concentração final de duas vezes 10 elevado às sextas células T por mililitro. Co-cultive 100 microlitros das células dendríticas tratadas com 100 microlitros de células T CD4 positivas marcadas com CFSE em cada poço de uma placa de 96 poços e adicione 100 nanogramas por mililitro de peptídeo OVA 323-329 às células, medindo a intensidade CFSE das células T por citometria de fluxo após dois a três dias de incubação.Células progenitoras da medula óssea cultivadas em meio completo, na presença de GM-CSF e IL-4, exibem uma morfologia de células dendríticas imaturas após seis dias em cultura. A análise de células dendríticas derivadas da medula óssea imaturas do sétimo dia revela a expressão robusta de CD11c, um marcador específico de células dendríticas murinas, pela maioria das células cultivadas. Apesar da falta de efeito na expressão de marcadores de maturação induzidos por LPS, as células dendríticas derivadas da medula óssea exibem um perfil de células dendríticas tolerogênicas em resposta ao tratamento com CDDO-DFPA, conforme evidenciado pela redução significativa na expressão gênica pró-inflamatória e uma expressão gênica de citocinas anti-inflamatórias aprimorada, mesmo após a estimulação com LPS.Além disso, uma redução significativa na proliferação de células T específicas para OVA singênico é observada em co-culturas in vitro nas quais o OVA é apresentado por células dendríticas tratadas com CDDO-DFPA e in vivo, como evidenciado por uma progressão tardia para encefalomielite autoimune experimental após a injeção de células dendríticas tratadas com CDDO-DFPA pulsadas por MOG, confirmando ainda mais o fenótipo tolerogênico dessas células. Uma vez dominada essa técnica, as células dendríticas tolerogênicas podem ser desenvolvidas em oito dias, se os experimentos forem realizados adequadamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as células dendríticas tolerogênicas não são homogêneas.Seu fenótipo celular depende da natureza dos agentes usados para a indução de sua tolerância. Após este procedimento, outros métodos, como análise citometria de fluxo detalhada, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a energia ou apoptose de células T específicas antigênicas induzidas por células dendríticas tolerogênicas ou a capacidade de diferenciação de células T. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver células dendríticas tolerogênicas funcionalmente ativas usando agentes conhecidos ou como testar a capacidade de novas substâncias de induzir essas células.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação mielóide células dendríticas da medula óssea de ratos. Isolamento de rato tíbia e fêmur, e processamento de medula óssea são demonstradas. Fotos demonstrando a morfologia das células antes e depois da diferenciação, e figuras representando fenótipo celular e IL-12 maturação de produção a seguir usando CpG são mostrados.

Cultura de células dendríticas mielóides a partir de precursores da medula óssea

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Este vídeo demonstra a geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas, ou DCs, a partir de monócitos humanos. A incubação de monócitos com fatores de crescimento e citocinas leva à produção de DCs imaturas. Em resposta a moléculas reguladoras imunológicas, DCs imaturas se diferenciam em DCs tolerogênicas e maduras.

Geração de células dendríticas imaturas, maduras e tolerogênicas a partir de monócitos

Este vídeo demonstra um método de conversão de células dendríticas (DCs) em DCs tolerogênicas (TolDCs) usando um agente farmacológico imunomodulador. Essa conversão é confirmada pela avaliação da função TolDC por meio de seu efeito imunossupressor nas células T CD4+.

Efeito de um agente farmacológico imunomodulador na interação entre células dendríticas e células T CD4+

Este protocolo descreve os procedimentos experimentais para avaliar a diferenciação de células dendríticas plasmacytoid em placas de Peyer de progenitores de células dendriticas comuns, utilizando técnicas que envolvem o isolamento de FACS mediada por células, a transferência de genes hidrodinâmico, e análise de fluxo de subconjuntos imunes em placas de Peyer.

Avaliando o Desenvolvimento da murino células dendríticas plasmocitóides em placas de Peyer Usando transferência adoptiva de Progenitores hematopoiéticos

Neste estudo, apresentamos um sistema de cultura in vitro que pode gerar pDCs de forma eficiente por co-cultura de progenitores linfóides comuns com células alimentadoras de AC-6 na presença do ligante Flt3.

In Vitro geração de células dendríticas plasmocitóides Murino de comum Linfóide Progenitores usando o sistema de alimentação AC-6

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

Aqui fornecemos um protocolo para triagem de potenciais fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento de células dendríticas (DC) usando transdução lentiviral de shRNA para obter linhas celulares de knockdown estáveis para diferenciação in vitro DC.

Estudo do Desenvolvimento de Células Dendríticas por Short Hairpin RNA-Mediado Gene Knockdown em uma linha de célula hematopoiética e progenitora in vitro

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogênicas murinas para imunoterapia de doenças autoimunes como esclerose múltipla. Este protocolo padronizado permite testar a eficácia funcional dessas células.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

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