Name: Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Aprenda um método eficiente de alto rendimento para isolar subpopulações de células dendríticas do baço de camundongos usando ligante Flt-3. Esta técnica preserva as características funcionais in vivo das células.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIAID AI45889 subvenção para SAP citometria de fluxo estudos foram realizados utilizando as instalações nucleares FACS apoiados pelo Cancer Center Einstein (NIH / NCI CA013330) e Center for AIDS Research (NIH / NIAID AI51519).

Experiências em animais são feitos de acordo com as directrizes aprovadas do comitê institucional cuidados com os animais e uso (IACUC). Todos os procedimentos que requerem a esterilidade são realizadas em uma cabine de segurança biológica. 1. Implantação de Melanoma B16.Flt3L em Ratos <ol><li> Cultura da linha expressando Flt-3 de células de melanoma B16 em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 0,5 X 10 6 células / ml em meio DMEM completo com 10% de CO 2 a 37 ° C. Crescer até as células atingirem confluência ~ 90% (~ 20 h). </li><li> Colher as células por digestão com tripsina. Aspirar os meios de cultura de células e lavar as células aderentes com PBS. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina e incubar durante 5 min a 37 ° C. Adicionar a frio 20 ml de meio DMEM completo (4 ° C) contendo soro fetal de vitelo (FCS) para extinguir a digestão com protease. Levante as células off batendo levemente seguido cuidado pipetando para cima e para baixo. </li><li> Recolher as células por centrifugação a 300xg durante 10 min a 4 ° C. Contar as células utilizando um hemocitómetro ou um contador de viabilidade de células automatizado. Ressuspender a uma densidade de 10 8 culas / ml em PBS. </li><li> Ratinhos implante (C57BL / 6 ou outra estirpe histocompatível) com células de tumor por injecção subcutânea como descrito por Machholz et al. 19, na base do pescoço com 100 ul de suspensão de células (10 7 células). </li><li> Permitir que o tumor crescer até serem palpáveis ​​ou visíveis (2 - 10 mm de diâmetro, geralmente de 7 - 12 dias) antes de sacrificar os animais para os órgãos de colheita. </li></ol> 2. Preparação de Esplênica suspensão única célula de RATOS COM TUMOR <ol><li> Anestesiar ratos com uma overdose de isoflurano (ajustar a taxa de fluxo de isoflurano a&gt; 5% e continuar a exposição, pelo menos, 2 minutos após a paragens de respiração). Sacrificar o mouse rolamento Flt-3 tumor melanoma por deslocamento cervical de acordo com as diretrizes institucionais para a eutanásia. </li><li> disinfect a pele com 70% de etanol e colheita do baço utilizando uma técnica asséptica, com o auxílio de uma tesoura esterilizada 20. </li><li> Colocar o baço em uma placa de Petri estéril para o transporte para a cabine de segurança biológica. Execute todas as etapas a partir daqui em condições estéreis. </li><li> Transferir baço para um prato fresco Petri e lavar com meio RPMI. Cortar o baço em pedaços pequenos (~ 0,2 centímetros 2) utilizando um bisturi. Incubar durante 30 min a 37 ° C com 10 ml de solução de colagenase / ADNase. </li><li> Verter a suspensão parcialmente digerido de tecido do baço sobre um filtro celular de 70 uM. Comprimir os restantes fragmentos de tecido através da tela do filtro com 5 ml de uma êmbolo da seringa. </li><li> Lavar o filtro de malha com 10 ml de meio fresco e descartar o filtro. Centrifugar a suspensão a 300 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar as células. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos. Incubar à temperatura ambiente fou 10 min. Extingue-se a tampão de lise dos glóbulos vermelhos por adição de 10 ml de meio RPMI completo. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Ressuspender em volume apropriado para atingir a densidade de células de 10 8 culas / ml em tampão de separação de células (por exemplo, MACS) contendo 20 ug / ml de anticorpo de Fc-bloco (2.4G2). </li></ol> 3. Purificação de plasmocitóides DCs, CD8a Pos DCs e CD8a Neg DCs a partir do baço suspensão única célula Nota: O isolamento dos subconjuntos de DC esplénicos de suspensão de célula única é um processo multi-passo, como ilustrado na Figura 1 execute todas as etapas usando tampão de pré-arrefecido e um banho de água gelada para manter a temperatura a 4-8 ° C.. Todos os volumes de reagente na seção seguinte do protocolo são calculados para uma entrada inicial de 200 ul de suspensão de células do baço em 10 8 células / ml). Este pode ser aumentado oupara baixo com base na sua necessidade, alterando o volume de suspensão de células (sempre com uma densidade de 1 x 10 8 células / ml) e outros reagentes proporcionalmente no passo inicial (3.1.1 e 3.2.1). Ajustar os volumes de reagente em todas as etapas posteriores de acordo. Por exemplo, se começando com 100 ul de suspensão de células do baço a 1 x 10 8 / mL, usar metade dos volumes de reagentes indicados em todas as etapas. <ol><li> Isolamento de plasmocitóides DCs (PDC) <ol><li> Adicionar 300 ul de coquetel de anticorpo marcado com biotina fornecido no kit de isolamento de DC plasmocitï¿½des a 200 ul de suspensão de células do baço. </li><li> Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque no tubo a cada 3 minutos para manter as células em suspensão, e para maximizar a ligação do anticorpo. </li><li> Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante para remover os anticorpos não ligados biotinilados. </li><li> Ressuspender a célulapellet em 500 ul de tampão de separação de células. Adicionar 300 ul de esferas de anticorpo anti-conjugado com biotina. Repita o passo 3.1.2 e 3.1.3. </li><li> Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 2 ml de tampão de separação de células. Execute todas as etapas a partir deste ponto à temperatura ambiente usando buffers pré-arrefecido. </li><li> Coloque uma célula ativada magnética fresco triagem coluna LS no suporte magnético. Lave e equilibrar coluna com 5 ml de tampão de separação de células. </li><li> Pipetar a suspensão de células na coluna, aplicando-o suavemente para o centro da superfície do leito da coluna. Recolhe-se o fluxo através de. </li><li> Lava-se a coluna com 10 ml de tampão de separação de células. Recolha este fluxo através e combinar com o fluxo através do passo 3.1.7. Os pDCs são enriquecidos nesse fluxo de coluna através de (FT1). </li><li> Agregar as células de FT1 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, ressuspender em 2 ml de tampão de triagem de células e passar as células através de uma coluna LS frescorepetindo os passos 3.1.6 - 3.1.8. Este uso de duas colunas sequenciais produz pureza aumentada de células isoladas. </li><li> as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender com 2 ml de RPMI completo. Coloque em gelo até ser necessário. </li></ol></li><li> Isolamento de CD8a Pos e CD8a DCs Neg Nota: O primeiro passo neste processo é a depleção de células B, PDC, T e NK. <ol><li> Começando com toda a suspensão de células do baço (1 ml de 8 a 10 células / ml obtidas no passo 2.8), adicionar 100 ul de coquetel de anticorpo conjugado com biotina fornecido no kit de isolamento de CD8a Pos DC. </li><li> Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. Toque suavemente o tubo a cada 3 min para maximizar a ligação dos anticorpos marcados com biotina para suas células alvo. </li><li> Adicionar 12 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar Supernatant para remover os anticorpos biotinilados não ligados. </li><li> Adicionar 150 ul de tampão de separação de células e 100 ul de contas de anti-biotina fornecidos no kit de isolamento de CD8a Pos DC. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. </li><li> Adicionar 10 ml de tampão de célula triagem e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em tampão de classificação 1 ml de células e passar sobre uma coluna LS frescos acordo com o procedimento nos passos 3.1.6 através de 3.1.8. </li><li> Recolhe-se o fluxo não marcado a 2 (FT2) e descartar o material retido coluna. Esta fracção não marcado é enriquecido para CD8a Pos e CD8a DCs Neg. </li><li> Agregar as células em FT2 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender as células em tampão de células de triagem 1 ml e adicionar 200 ul de anti-CD8a contas magnéticas conjugadas fornecidos no kit de isolamento de CD8a Pos DC. </li><li> Repcomer passos 3.2.2 através de 3.2.6. O fluxo através da coluna é enriquecido para CD8a Neg DCs e esgotado para CD8a Pos DCs. Esta é rotulada fluxo através de 3 (FT3). </li><li> Para eluir a CD8a Pos DCs retidos na coluna, a coluna de remover o íman, adicionam-se 5 ml de tampão de separação de células e purgar a matriz da coluna utilizando o êmbolo fornecida com a coluna LS. </li><li> Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender em tampão de triagem 1 ml de células. Para aumentar a pureza, executar as células eluídas novamente através de uma coluna LS fresca, repetindo os passos 3.1.6 a 3.1.8, excepto descartar o fluxo através e recolher células retidas como em 3.2.11. </li><li> Para a purificação de CD8a Neg DCs a partir da suspensão FT3, sedimentar a FT3 por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender em 300 ul de tampão de separação de células. </li><li> Adicione 100 ml de mag anti-CD11cgrânulos magnética. Misturar bem e incubar em banho de água gelada durante 15 min. </li><li> Adicionar triagem células de tampão e 10 ml de pelotas de células por centrifugação a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Repita os passos 3.1.5 através de 3.1.8. O CD8a Neg DCs são selecionados positivamente com contas CD11c e estão ligadas à coluna. O fluxo que atravessa pode ser descartado. </li><li> Elui-se as células retidas na coluna tal como descrito no passo 3.2.11 para recolher a CD8a purificada Neg DCs. </li></ol></li></ol> 4. Pulsing APCs com antígenos e Transferência de celular <ol><li> Contar as células vivas após purificação usando exclusão de azul tripano 21 a distinguir as células vivas e mortas. </li><li> Incubam-se as células com o antigénio de escolha. Use análogos de antigénio glicolipídico ceramida chamada alfa-galactosilo (αGalCer) na concentração de 100 nM de 13. Normalmente, placa 10 6 células viáveis ​​bem em meio RPMI / completo utilizando ultra-low ATTAChment de fundo em U placas de 96 poços para minimizar a ligação de células. Incubar as células em uma atmosfera de 5% de CO2 a 37 ° C durante 1-4 h. </li><li> Células colheita com cuidado pipetando várias vezes. Use largas dicas furo de pipeta para minimizar os danos celulares a partir de forças de cisalhamento. Lavar os poços com PBS e agrupar as lavagens para maximizar a colheita de células. </li><li> Agregar as células a 300 xg durante 5 min a 4 ° C e ressuspender a densidade desejada em PBS. Tipicamente, injectar 1 milhão de células em 200 ul por animal receptor. Manter as células no gelo para maximizar a viabilidade antes da administração em animais hospedeiros. </li><li> Injetar células por via intravenosa em ratos, quer através do vão lateral da cauda ou do plexo venoso retro-orbital 19. Usar uma agulha G 27 numa seringa de 1 ml e injectar um volume máximo de 0,1 ml por ratinho. </li></ol>

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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

As células dendríticas são aceites como sendo a principal antigénio profissional células envolvidas na iniciação de respostas de células T apresentando. Sua função principal é fazer um levantamento do microambiente do tecido, tomando-se e processar antigénios para apresentação às células T. A fim de estudar a função dos subconjuntos de DC específicos, estes devem ser isolado em quantidade suficiente usando uma abordagem que mantém o seu fenótipo e funções normais. A maioria dos protocolos contar com o isolamento de DC s...

As células dendríticas (DC) foram descobertos há quase quarenta anos como o &quot;grande estreladas celular (dendron grego)&quot; encontrado nos órgãos linfóides 1. Muitos estudos têm demonstrado que DC são as únicas células que apresentam o antigénio que pode estimular eficazmente células T ingénuas 2. Uma das principais funções destas células é a absorção de antigénios e apresentação e o seu processamento eficiente e carregamento destes para moléculas que apresentam antigénios. No baço de ratinho, as DCs pode ser separado em subconjuntos e plasmocitï¿½des convencionais. As DCs plasmocitoides são caracterizados por uma baixa expressão de CD11c e níveis elevados de B220 e Gr-1. Eles também são positivas para o mPDCA1 marcador de superfície e secretar interferon tipo I em resposta a toll like receptor 9 ligantes (TLR9). As DCs convencionais são elevados para CD11c e MHC classe expressão II. Eles podem ser divididos em três subgrupos distintos com base na expressão de superfície de marcadores fenotípicos tais como CD4, CD8a, DEC205, CD11b e receptor de células dendríticas 2 inibitória (DCIR2, reconhecida pelo anticorpo 33D1) proteínas de 3,4. Os CD8a Pos DCs são também conhecidos como CDC1, são positivos para DEC205, mas negativo para marcadores mielóides tais como CD11b e 33D1. O CD8a Neg DCs, também chamado cdc2, são positivos para 33D1, CD11b e CD4, mas falta DEC205. O subconjunto dupla negativa (isto é, negativo para CD4 e CD8a) é relativamente rara, e é negativo para DEC205 e 33D1. É o subconjunto menos caracterizado e pode ser uma forma menos diferenciadas de CD8a Neg DC. Diferenças fenotípicas nos diferentes subconjuntos de DC também se estendem para as suas funções in vivo. O CD8a Neg DCs são altamente fagocítica e são pensados ​​para apresentar antigénio exógeno principalmente por via do MHC de classe II às células T CD4 + 3. Em contraste, as DCs CD8a Pos são especializados para apresentação de antigénio proteico solúvel em MHC de classe Inum mecanismo denominado apresentação cruzada. O resultado da apresentação cruzada depende do estado de activação de estas DCs 5, e pode levar à expansão das células T citotóxicas (CTL) ou o desenvolvimento de células T reguladoras 6 2,7. Segmentação de antigénio para CD8a Pos DCs utilizando resultados de entrega anti-DEC205-anticorpo-mediadas, em grande parte na eliminação de células T 8, enquanto que a apresentação de antigénios derivados de células apoptóticas infectadas induz uma forte resposta de CTL 9. Além do reconhecimento de antigénios peptídicos, o sistema imunitário de mamífero evoluiu para reconhecer lípido e antigénios de glicolípidos. Estes antigénios são apresentados por moléculas de CD1, que são proteínas de MHC de classe I na superfície de células semelhantes que existem em várias formas relacionadas em vários mamíferos. Em ratos, um único tipo de molécula de CD1 CD1d altamente conservada chamada é responsável pela apresentação de antigénios glicolipidicos 10. O prefeito<html> população de células T que reconhecem os complexos glicolipidicos / CD1d é chamado células NKT invariantes (células iNKT). Estas células expressam um receptor de células T semi-invariante (TCR) composto por uma cadeia invariante TCRα que é emparelhado com cadeias TCRβ que a diversidade 11 limitadas. Ao contrário das células T convencionais que precisam proliferam e se diferenciam para se tornarem células T efectoras activadas, existem células iNKT como uma população efectora e começar a responder rapidamente após a administração de 12 glicolípido. Identificação de células apresentadoras de antigénio lípido fisiologicamente relevante é uma área activa de investigação, e vários tipos de células distintos, tais como células B, macrófagos e células dendríticas têm sido sugeridos para executar esta função. No entanto, demonstrou-se que o subconjunto CD8a Pos de DCS é a principal célula mediar a captação e a apresentação de antigénios a células lipídicas rato iNKT 13 e glicolípido mediada cross-priming de células T CD8 14. ove_content &quot;&gt; Para comparar a eficiência da apresentação de antigénio por diferentes células apresentadoras de antigénio, uma abordagem simples é a transferência de diferentes tipos de APC purificadas pulsadas com quantidades equivalentes de antigénio em hospedeiros sem tratamento prévio. experiências de transferência celular deste tipo são muitas vezes realizados para estudos imunológicos. no entanto, a realização de estudos de transferência com DCs tratadas ex vivo antigénio é desafiador, uma vez que estas células não existem populações como raros em órgãos linfóides, onde eles constituem menos do que 2% do total de células 15. por conseguinte, é necessário reforçar o desenvolvimento destas células em animais dadores para aumentar a eficácia dos protocolos de isolamento. Sabe-se que o linfóide comum e progenitores mielóides comuns, que são necessários para a geração de pdc e CD8 Pos subconjuntos e CD8 Neg DC, fms relacionados expressa a tirosina-cinase do receptor 3 (Flt-3). Após a in vivo, ligando Flt-3 (Flt-3L) administração, emigratião de Flt-3 que expressam as células progenitoras da medula óssea é aumentada, resultando no aumento da semeadura de órgãos linfóides periféricos e a expansão da sua descendência madura CC 16. A expressão de Flt-3 é perdida durante compromisso com o B, T ou NK vias de diferenciação celular. Portanto, apenas alterações mínimas são observados nestas células após administração Flt-3L. Expansão similar em populações DC é observada em ratinhos portadores de tumores gerados por implantação de uma linha celular de melanoma B16-secretoras de murino Flt-3L, que proporciona um método simples e económico para proporcionar níveis sistémicos sustentados de Flt-3L 17,18. Utilizando esta abordagem, temos desenvolvido um protocolo com base na implantação de células B16 de melanoma secretoras de Flt-3L para estimular a expansão de todos os subconjuntos normais DC em baço de ratinho, aumentando assim os rendimentos destas células que podem ser isolados por experiências subsequentes . Nós sempre achar que dentro de 10 - 14 dias após im subcutâneaplantação do tumor secretor de Flt-3, os murganhos desenvolvem esplenomegalia com enriquecimento acentuada das DCs para constituir 40 - 60% do total de células de baço. A partir destes baços, diferentes subconjuntos de DC pode ser isolado com pureza elevada utilizando kits de purificação de células padrão disponíveis comercialmente que utilizam marcadores fenotípicos específicos do subconjunto.

<table><tbody><tr><td>0,05% de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS019936-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Colagenase D&nbsp;</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (pó seco)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Etanol à prova de 200&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9-6705-004-220</td><td>Usado para preparar</td></tr><tr><td>tampão de lise de RBC</td> com 70% de etanol <td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 médio com L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Meio DMEM com L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-glutamina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais MEM&nbsp;</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos essenciais&nbsp;</td><td>Tecnologias de Vida</td><td>11130-051&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS Ca2+ e Mg2+ pH livre 7.2)</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>20012-050</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (DPBS com Ca2+ e Mg2+)</td><td>Life Technologies, Gibco</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Solução de etilenodiaminotetraacetato (EDTA)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal para bezerros</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina&nbsp;</td><td>Life Technologies, Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue (pó seco)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6146-5G&nbsp;</td><td>Prepare 0,08% com PBS</td></tr><tr><td>Kit de Isolamento de Células Dendríticas Plasmocitoides II, camundongo</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-786</td><td></td></tr><tr><td>Contas magnéticas conjugadas com CD11c anti-camundongo;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-152-001</td><td></td></tr><tr><td>CD8&alpha; Kit de isolamento DC de mouse Pos</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-169</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo bloqueador do receptor Fc-gama (Clone 2.4G2)</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c-FITC&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553801</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8&alfa;-PerCP&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553036</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse B220-PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553090</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1 ml&nbsp;</td><td>BD</td><td>26048</td><td></td></tr><tr><td>23 G1 agulha&nbsp;</td><td>BD</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri de 100 mm&nbsp;</td>Instrumentos Científicos <td>875712</td><td></td> <td>Cirúrgicos Thermo Fisher</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Kent Scientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (70 &micro; m)</td> <td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Grandes placas de Petri&nbsp;</td>Sistema de filtração a vácuo <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>(500 ml (0.22 &micro; m))</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>colunas LS&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Separador MACS com suporte magnético&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Wide-bore 200 &mu; l pontas de pipeta&nbsp;</td><td></td> Placas de 96 poços de fixação ultrabaixa <td>PerkinElmer</td> 111623 <td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;</td><td>Corning</td><td>CLS3474-24EA</td><td></td></tr><tr><td>camundongos C57BL/6 fêmeas de 6-8 semanas de idade&nbsp;</td><td>Jackson Research Laboratories, linhagem</td> celular de melanoma Jax <td></td><td></td></tr><tr><td>Murine B16.Flt3L</td><td>descrita por Mach et al., 2000</td>Serum free DMEM e RPMI media 500 ml DMEM com L-glutamina, ou 500 ml RPMI-1640 com L-glutamina 5 ml de aminoácidos não essenciais MEM (100x,<td></td><td></td></tr><tr><td> 10&nbsp; mM) Tampão HEPES de 5 ml (1 M) 5 ml de L-glutamina (200&nbsp; mM) 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (5,5 x 10-2 M)</td>Misture todos os ingredientes em um gabinete de biossegurança com mídia DMEM ou RPMI, <td></td><td></td><td>dependendo da sua necessidade. Filtre esterilize a mídia passando por um 0,22 &micro; Sistema de filtragem a vácuo M.</td></tr><tr><td><forte>Meios RPMI e DMEM completos</forte></td><td></td><td></td><td>Adicione 50 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor ao meio RPMI ou DMEM livre de soro para obter um meio completo.</td></tr><tr><td><tampão forte>MACS</forte></td><td></td><td></td><td>Adicione 2 ml de EDTA 0,5 M e 10 ml de soro fetal de bezerro inativado pelo calor a 500 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, Ca2+ e Mg2+ Free, pH 7,2) e 2&nbsp; &micro; g/ml 2,4G2 (anticorpo Fc-Block).</td></tr><tr><td>Tampão de coloração <forte>FACS</forte></td><td></td><td></td><td>Dissolva a azida sódica a 0,05% (0,25 g por 500 ml) em tampão MACS para obter tampão de coloração</td></tr> <tr><td>FACS<forte>10x solução estoque de colagenase D e DNase 1</forte> 
Dissolva 1 g de colagenase D e 0,2 ml de estoque de DNase 1 (1 mg / ml, 100x) em 20 ml de PBS contendo Ca2+ e Mg2+ para obter uma solução de aproximadamente 1.000-2.000 unidades de atividade da colagenase por ml.</td><td></td><td></td><td>Esta solução estoque de 10x pode ser preparada com antecedência e armazenada a -20 &graus; C por várias semanas. Diluir 1 ml com 9 ml de RPMI livre de soro imediatamente antes da utilização.</td></tr></tbody></table>

um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas rato

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

As células dendríticas (CDs) são células apresentadoras de antigénios profissionais primariamente responsável pela aquisição, processamento e apresentação de antigénios no antigénio que apresenta moléculas para iniciar a imunidade mediada por células-T. As células dendríticas podem ser separados em vários subconjuntos fenotipicamente e funcionalmente heterogéneas. Três subconjuntos importantes de células dendríticas esplênicas são plasmocitï¿½des, as células CD8a POS e CD8a Neg. As DCs plasmocitoides são produtores naturais de interferão de tipo I e são importantes para a imunidade de células T anti-viral. O subconjunto de CD8a Neg DC é especializado para apresentação de antígenos MHC classe II e está envolvido no centro de priming células T CD4. O CD8a Pos DCs são os principais responsáveis ​​para a apresentação cruzada de antígenos exógenos e priming células T CD8. As DCs CD8a Pos ter sido demonstrado ser mais eficaz na apresentação de antigénios de glicolípidos por moléculas CD1d a um cel t especializadol população conhecidas como células invariante natural killer T (iNKT). A administração de ligando Flt-3 aumenta a frequência de migração de células progenitoras de células dendríticas a partir da medula óssea, resultando em última análise, a expansão de células dendriticas em órgãos linfóides periféricos em modelos murinos. Temos este modelo adaptado para purificar grandes números de células dendríticas funcionais para utilização em experiências de transferência de células para comparar proficiência in vivo de diferentes subconjuntos de DC.

O resultado deste procedimento baseia-se na ampliação de subconjuntos de DC de murino por Flt-3L expressos pelas células de melanoma implantado. O tumor B16.Flt3L foi derivado a partir de um ratinho C57BL 6 /, e deve ser implantado num animal com essa estirpe de fundo, a fim de evitar o fracasso do tumor para se estabelecer devido à rejeição. Em alguns casos, pode ser desejável a utilização de ratinhos geneticamente modificados para derivar as DCs com defeitos conhecidos nas vias de sina...

Subconjuntos distintos de células dendríticas existem como populações raras em órgãos linfóides e, portanto, são difíceis de isolar em número e pureza suficientes para experimentos imunológicos. Aqui descrevemos um método de alta eficiência e alto rendimento para isolamento de todos os principais subconjuntos atualmente conhecidos de células dendríticas esplênicas de camundongos.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver um método de alta eficiência e alto rendimento para gerar células dendríticas ou DCs, que reflitam fatalmente sua divergência fenotípica e funcional in vivo. As células dendríticas existem como grandes populações nos órgãos linfóides. Portanto, usamos o ligante de filtro para aumentar a frequência dessas células essenciais nos tecidos do doador para facilitar esse isolamento.A principal vantagem dessa técnica é que ela remove a geração de todos os subconjuntos DC em números adequados para análise usando apenas os agentes disponíveis comercialmente. Para colher células de melanoma B16 que expressam o ligante flt-3 de uma cultura 90% confluente, primeiro lave as células com PBS e incube a cultura com 05% de tripsina a 37 graus Celsius. Após 5 minutos, extinguir a atividade da protease com 20 mililitros de meio dima completo de 4 graus Celsius e destacar a camada do modelo de célula aderente com batidas leves e pipetagem suave.Colete as células por centrifugação e conte-as. Em seguida, ressuspenda a suspensão de célula única para 1 vezes a concentração de 8 células por mililitro em PBS para sua injeção subcutânea em camundongos receptores C57 preto 6. Quando o tumor atingir de dois a dez mililitros de diâmetro, colha os baços dos animais portadores do tumor e coloque os baços em uma placa de Petri contendo meio RPMI fresco.Usando um bisturi, corte os tecidos em pedaços de 0,2 centímetros quadrados e, em seguida, incube os fragmentos em dez mililitros de colagenase e Dnase a 37 graus Celsius. Após 30 minutos, despeje a pasta de tecido parcialmente digerida em um filtro de células de 70 mícrons e use um êmbolo de seringa de cinco mililitros para pressionar os fragmentos de tecido restantes através da malha do filtro. Enxágue o filtro com 10 mililitros de meio fresco, agrupando a lavagem com o restante da suspensão de célula única e pellet as células.Suspendemos o pellet celular em 2 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células em 10 mililitros de meio RPMI fresco e ressuspenda-as em 1 vezes 10 elevado a 8 células por mililitro no tampão de classificação de células contendo o bloco FC. Para isolar as CCs de citodo plasmático, misture completamente 300 microlitros de coquetel de anticorpos marcados com biotina de um kit de isolamento de CC de citodo plasmático com 200 microlitros da suspensão de célula única esplênica.Coloque as células em banho-maria gelado por 15 minutos, batendo suavemente a cada três minutos. Em seguida, lave as células com 12 mililitros de tampão de classificação de células e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de classificação fresco. Em seguida, incube as células em 300 microlitros de esferas conjugadas com anticorpos antibiotina por mais 15 minutos na água gelada com batidas regulares.Depois de lavar as células em um novo tampão de classificação, ressuspenda o palete em 2 mililitros de tampão de classificação de células e carregue uma coluna magnética de tamanho apropriado em seu ímã correspondente. Equilibre a coluna com cinco mililitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius. Quando todo o buffer tiver sido drenado do topo da coluna, adicione cuidadosamente as células ao centro da superfície da cabeça da coluna e colete o fluxo.Em seguida, lave a coluna com 10 mililitros de tampão de classificação fresco a 4 graus Celsius e colete o fluxo no mesmo tubo. Após a passagem por uma segunda coluna magnética, pode-se esperar uma população de células dendríticas de citodos plasmáticos com uma pureza superior a 94%. Para isolar os CD8aplha+ e CD8alfa-DCs, misture o restante da suspensão de células esplênicas com 100 microlitros de coquetel de anticorpos conjugados com bioção de um kit de isolamento de células CD8alfa+dendríticas por 15 minutos no gelo com batidas suaves, como acabamos de demonstrar.No final da incubação, lave as células em 12 mililitros de tampão de classificação de células de 4 graus Celsius e ressuspenda o pellet em 150 microlitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius. Em seguida, misture as células com 100 microlitros do kit de isolamento de células CD8alfa+dendríticas anti-biotina. Após 15 minutos no gelo com batidas suaves, lave as células em 10 mililitros de tampão de classificação de células de 4 graus Celsius e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de classificação fresco de 4 graus Celsius.No final da incubação, classifique as células por separação de esferas magnéticas, como acabamos de demonstrar, coletando o fluxo e a primeira lavagem. Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de classificação de células frescas a 4 graus Celsius. Agora rotule as células com 200 microlitros de esferas magnéticas conjugadas anti-CD8aplha do kit e passe as células por uma nova coluna, coletando o fluxo de células dendríticas CD8alfa.Para coletar os CD8alpha+DCs, transfira a coluna para um tubo cônico de 15 mililitros e mergulhe 5 mililitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius na coluna. Após a execução das células através de uma segunda coluna, pode-se esperar uma população de células dendríticas CD8alpha + superior a 96%. Para isolar as células CD8alfa, gire a suspensão de células CD8alfa de fluxo.Em seguida, rotule as células com 100 microlitros de grânulos c-magnéticos anti-CD11 e colete a população de células positivas do grânulo magnético, como acabamos de demonstrar, para obter uma população de subconjunto de células dendríticas CD8alfa superior a 97%. Finalmente, determine o número de células vivas, por exclusão de azul de tripano. Uma vez que o tumor se torna palpável, os camundongos portadores de tumor ligante B16 flt-3 exibem consistentemente um aumento dramático na celularidade esplênica que se correlaciona com a expansão dos subconjuntos de células dendríticas esplênicas.Curiosamente, enquanto um aumento de 15 a 20 vezes no número absoluto de células é observado para as DCs convencionais nesses animais, apenas um aumento de cerca de 4 vezes é observado para o subconjunto de DC do citodo plasmático. Os diferentes subconjuntos de células dendríticas são caracterizados de acordo com sua expressão de B220, CD11b, CD11c e CD8alfa. As populações de células também exibem outros marcadores de subconjunto únicos, no entanto, com mPDCA1 expresso exclusivamente nos DCs de citodos plasmáticos DEC205 altamente expressos nos CD8alpa + DCs, e CD11b e 33D1 detectados com mais destaque nos CD8alfa-DCs.Usando este método, demonstramos que CD8alpa + DCs são os mais eficientes na apresentação de antígenos por moléculas de ligação de CD a uma população especializada de células T conhecidas como células NKT invariantes. A característica mais crítica do isolamento DC é manter uma esterilidade estrita e condições livres de antidoxantes. Durante os procedimentos, essas células T são altamente responsivas ao antidoxant.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células com cuidado, pois a estimulação mecânica repetida pode alterar o estado de maturação das células endtríticas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para isolar um grande número de todos os principais subconjuntos de DC de um único baço. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Isolamento de linfócitos usando a Miltenyi MACs kit é uma maneira confiável para purificar as células de todo homogeneizados de tecido linfóide. Células purificadas usando o sistema Miltenyi são tipicamente ≥ 96% pura. Aqui, nós demonstrar as medidas tomadas para isolar células CD4 + T, um dos muitos kits oferecidos pela Miltenyi.

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

A preparação altamente purificada de células dendríticas pulmonares do rato é descrito. Ênfase específica é dada para o isolamento de um subconjunto de células dendríticas convencionais.

Isolamento de células dendríticas pulmonares do rato

Aqui, nós detalhe uma metodologia para o isolamento rápido de células de ratinho intestinais dendríticas (DC) e macrófagos. Caracterização fenotípica de DCs intestinais e macrófagos é realizada utilizando várias cores análise de fluxo citométrico enquanto enriquecimento grânulo magnético seguido por separação de células é usado para produzir populações altamente puros para estudos funcionais.

Isolamento e caracterização de células dendríticas e macrófagos a partir do intestino do rato

Este vídeo descreve um protocolo para a geração de células dendríticas - células-chave apresentadoras de antígenos que ativam as células T - da medula óssea de um camundongo adulto.

Geração de células dendríticas derivadas da medula óssea: um método para gerar células dendríticas a partir da medula óssea de camundongos

Este vídeo demonstra um procedimento para a transferência adotiva de células dendríticas (DCs) apresentadoras de antígenos tratadas com alto teor de sal para camundongos. As células dendríticas (DCs) CD11c+ murinas são expostas a um meio contendo grandes quantidades de sódio, formando adutos da proteína isolevuglandina (IsoLG) nas células. Esses adutos servem como neoantígenos e são apresentados na superfície das DCs. As células tratadas com alto teor de sal são injetadas em camundongos por...

Um método para o tratamento com alto teor de sal de células dendríticas e sua transferência adotiva para camundongos

Este protocolo detalha um método para isolar células apresentadoras de antigénio a partir de timo humano por meio de diferentes passos de digestão enzimática do tecido seguida por centrifugação de densidade da suspensão de células individuais e finalmente separação magnética e / ou FACS das populações de células de interesse.

O isolamento de células dendríticas mielóides e células epiteliais de timo humano

Descrevemos aqui um método para isolar e purificar as células dendríticas de diferentes compartimentos anatômicas no aparelho reprodutor feminino humano para a avaliação de suas características fenotípica e funcionais. Esse método pode ser adaptado para isolar outras células do sistema imunológico ou células dendríticas de outros tecidos da mucosa.

Isolamento de células dendríticas do tracto reprodutivo feminino humano para estudos fenotípica e funcionais

Derivados de monócitos DC (MoDC) podem sentir pequenas quantidades de moléculas associadas a perigo e facilmente, portanto, estão prontos. Nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de MoDC do sangue, tumores e sua ativação com complexos imunes ao destacar as principais precauções que devem ser consideradas para evitar sua ativação prematura.

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver e caracterizar células dendríticas tolerogenic (TolDCs) e avaliar sua utilidade de imunoterapia.

Desenvolvimento e caracterização funcional de células dendríticas Tolerogenic murino

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Isolamento e transferência adotiva de sal alta trataram apresentadoras de células dendríticas

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Aprenda um método eficiente de alto rendimento para isolar subpopulações de células dendríticas do baço de camundongos usando ligante Flt-3. Esta técnica preserva as características funcionais in vivo das células.

Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

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