Um método de rendimento eficiente e alta para o isolamento de subpopulações de células dendríticas Rato

O objetivo geral deste protocolo é desenvolver um método de alta eficiência e alto rendimento para gerar células dendríticas ou DCs, que reflitam fatalmente sua divergência fenotípica e funcional in vivo. As células dendríticas existem como grandes populações nos órgãos linfóides. Portanto, usamos o ligante de filtro para aumentar a frequência dessas células essenciais nos tecidos do doador para facilitar esse isolamento.

A principal vantagem dessa técnica é que ela remove a geração de todos os subconjuntos DC em números adequados para análise usando apenas os agentes disponíveis comercialmente. Para colher células de melanoma B16 que expressam o ligante flt-3 de uma cultura 90% confluente, primeiro lave as células com PBS e incube a cultura com 05% de tripsina a 37 graus Celsius. Após 5 minutos, extinguir a atividade da protease com 20 mililitros de meio dima completo de 4 graus Celsius e destacar a camada do modelo de célula aderente com batidas leves e pipetagem suave.

Colete as células por centrifugação e conte-as. Em seguida, ressuspenda a suspensão de célula única para 1 vezes a concentração de 8 células por mililitro em PBS para sua injeção subcutânea em camundongos receptores C57 preto 6. Quando o tumor atingir de dois a dez mililitros de diâmetro, colha os baços dos animais portadores do tumor e coloque os baços em uma placa de Petri contendo meio RPMI fresco.

Usando um bisturi, corte os tecidos em pedaços de 0,2 centímetros quadrados e, em seguida, incube os fragmentos em dez mililitros de colagenase e Dnase a 37 graus Celsius. Após 30 minutos, despeje a pasta de tecido parcialmente digerida em um filtro de células de 70 mícrons e use um êmbolo de seringa de cinco mililitros para pressionar os fragmentos de tecido restantes através da malha do filtro. Enxágue o filtro com 10 mililitros de meio fresco, agrupando a lavagem com o restante da suspensão de célula única e pellet as células.

Suspendemos o pellet celular em 2 mililitros de tampão de lise de glóbulos vermelhos em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células em 10 mililitros de meio RPMI fresco e ressuspenda-as em 1 vezes 10 elevado a 8 células por mililitro no tampão de classificação de células contendo o bloco FC. Para isolar as CCs de citodo plasmático, misture completamente 300 microlitros de coquetel de anticorpos marcados com biotina de um kit de isolamento de CC de citodo plasmático com 200 microlitros da suspensão de célula única esplênica.

Coloque as células em banho-maria gelado por 15 minutos, batendo suavemente a cada três minutos. Em seguida, lave as células com 12 mililitros de tampão de classificação de células e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de tampão de classificação fresco. Em seguida, incube as células em 300 microlitros de esferas conjugadas com anticorpos antibiotina por mais 15 minutos na água gelada com batidas regulares.

Depois de lavar as células em um novo tampão de classificação, ressuspenda o palete em 2 mililitros de tampão de classificação de células e carregue uma coluna magnética de tamanho apropriado em seu ímã correspondente. Equilibre a coluna com cinco mililitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius. Quando todo o buffer tiver sido drenado do topo da coluna, adicione cuidadosamente as células ao centro da superfície da cabeça da coluna e colete o fluxo.

Em seguida, lave a coluna com 10 mililitros de tampão de classificação fresco a 4 graus Celsius e colete o fluxo no mesmo tubo. Após a passagem por uma segunda coluna magnética, pode-se esperar uma população de células dendríticas de citodos plasmáticos com uma pureza superior a 94%. Para isolar os CD8aplha+ e CD8alfa-DCs, misture o restante da suspensão de células esplênicas com 100 microlitros de coquetel de anticorpos conjugados com bioção de um kit de isolamento de células CD8alfa+dendríticas por 15 minutos no gelo com batidas suaves, como acabamos de demonstrar.

No final da incubação, lave as células em 12 mililitros de tampão de classificação de células de 4 graus Celsius e ressuspenda o pellet em 150 microlitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius. Em seguida, misture as células com 100 microlitros do kit de isolamento de células CD8alfa+dendríticas anti-biotina. Após 15 minutos no gelo com batidas suaves, lave as células em 10 mililitros de tampão de classificação de células de 4 graus Celsius e ressuspenda o pellet em 1 mililitro de tampão de classificação fresco de 4 graus Celsius.

No final da incubação, classifique as células por separação de esferas magnéticas, como acabamos de demonstrar, coletando o fluxo e a primeira lavagem. Em seguida, gire as células e ressuspenda o pellet em um mililitro de tampão de classificação de células frescas a 4 graus Celsius. Agora rotule as células com 200 microlitros de esferas magnéticas conjugadas anti-CD8aplha do kit e passe as células por uma nova coluna, coletando o fluxo de células dendríticas CD8alfa.

Para coletar os CD8alpha+DCs, transfira a coluna para um tubo cônico de 15 mililitros e mergulhe 5 mililitros de tampão de classificação de células frescas de 4 graus Celsius na coluna. Após a execução das células através de uma segunda coluna, pode-se esperar uma população de células dendríticas CD8alpha + superior a 96%. Para isolar as células CD8alfa, gire a suspensão de células CD8alfa de fluxo.

Em seguida, rotule as células com 100 microlitros de grânulos c-magnéticos anti-CD11 e colete a população de células positivas do grânulo magnético, como acabamos de demonstrar, para obter uma população de subconjunto de células dendríticas CD8alfa superior a 97%. Finalmente, determine o número de células vivas, por exclusão de azul de tripano. Uma vez que o tumor se torna palpável, os camundongos portadores de tumor ligante B16 flt-3 exibem consistentemente um aumento dramático na celularidade esplênica que se correlaciona com a expansão dos subconjuntos de células dendríticas esplênicas.

Curiosamente, enquanto um aumento de 15 a 20 vezes no número absoluto de células é observado para as DCs convencionais nesses animais, apenas um aumento de cerca de 4 vezes é observado para o subconjunto de DC do citodo plasmático. Os diferentes subconjuntos de células dendríticas são caracterizados de acordo com sua expressão de B220, CD11b, CD11c e CD8alfa. As populações de células também exibem outros marcadores de subconjunto únicos, no entanto, com mPDCA1 expresso exclusivamente nos DCs de citodos plasmáticos DEC205 altamente expressos nos CD8alpa + DCs, e CD11b e 33D1 detectados com mais destaque nos CD8alfa-DCs.

Usando este método, demonstramos que CD8alpa + DCs são os mais eficientes na apresentação de antígenos por moléculas de ligação de CD a uma população especializada de células T conhecidas como células NKT invariantes. A característica mais crítica do isolamento DC é manter uma esterilidade estrita e condições livres de antidoxantes. Durante os procedimentos, essas células T são altamente responsivas ao antidoxant.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células com cuidado, pois a estimulação mecânica repetida pode alterar o estado de maturação das células endtríticas. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para isolar um grande número de todos os principais subconjuntos de DC de um único baço. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.