Name: Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Aprenda a comparar dois métodos de isolamento de monócitos humanos para geração de células dendríticas in vitro. A citometria de fluxo por imagem caracteriza a expressão de marcadores de superfície CD11c e CD14.

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Esta pesquisa é apoiada pelo Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo, prêmio K99/R00 AA021264. Suporte laboratorial adicional como parte do pacote inicial foi recebido do Departamento de Imunologia, Instituto de Farmacologia Neuroimune, Faculdade de Medicina Herbert Wertheim e FIU- Escritório de Pesquisa e Desenvolvimento Econômico. Gianna Casteleiro foi apoiada pelo NIH / NIGMS R25 GM061347. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

estudos de sangue humano em geral têm sido revistos e aprovados pelo Institutional Review Board (IRB) da FIU, o protocolo IRB aprovação # IRB-13-0440. leukopaks humanos foram adquiridos a partir do banco de sangue da comunidade em Miami, FL. 1. Isolamento de PBMC pela técnica de gradiente de densidade padrão <ol><li> Efectuar uma diluição de 1: 1 de sangue com solução salina 1x com fosfato tamponada num frasco T75. </li><li> Pipetar 15 ml de solução de gradiente de densidade em 50 ml de tubos de centrífuga e cuidadosamente camada (25 - 30 ml / tubo) do sangue diluído ao longo deste gradiente. </li><li> Centrifugar durante 20 minutos a 1200 xg, com uma aceleração e desaceleração do de 0. </li><li> Após centrifugação, recolher a camada de interface (células brancas do sangue) em 50 ml de um novo tubo de centrífuga e lavar as células duas vezes em PBS (3 min a 1080 xg). Elimine o sobrenadante de cada vez. </li><li> as células com tampão de lise de cloreto de amónio-potássio-(ACK) tratar (para lisar os glóbulos vermelhos). Adicionar 10 ml de tampão e emCubate durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar as células duas vezes com PBS, centrifuga-se durante 3 min a 1080 xg e elimine o sobrenadante de cada vez. </li><li> Guardar o sedimento, que conterá as PBMC. </li><li> Proceda com método de purificação de monócitos de escolha. </li></ol> 2. Método de Monócitos A purificação por aderência <ol><li> Prepare meio de cultura celular completo, contendo L-glutamina (300 mg / ml) e suplementado com penicilina (50 U / ml) -streptomycin (50 ug / ml) e soro fetal bovino a 10%. </li><li> Permitir PBMC a aderir durante cerca de 2 horas através da sua cultura num frasco de T75 a uma concentração de 5 x 10 7 células por 10 ml de meio completo a 37 ° C e 5% de CO2 num incubador humidificado. </li><li> Após a incubação, remover as células flutuantes não aderentes da garrafa de cultura e lavar cuidadosamente as células aderentes duas vezes com PBS. </li><li> Incubar as células aderentes no meio de cultura celular completo suplementado com 2 ul / ml de granulócitos humano-macrophage factor de estimulação de colónia (GM-CSF) e interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml. </li><li> Alterar a metade do meio e reabastecer citocinas cada 48 horas. </li><li> Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs. </li></ol> 3. Método de Monócitos A purificação por separação magnética <ol><li> Recolhe CMSPs de técnica de gradiente de densidade padrão, verter para um tubo de poliestireno de 5 ml e re-suspensão em tampão de PBS a uma concentração de células / ml. </li><li> Adicionar cocktail de enriquecimento de células de monócitos humanos utilizando 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Após a incubação, adicionar partículas magnéticas, utilizando células 50 uL / ​​mL, misturar bem e incubar a 4 ° C durante 5 min. </li><li> Trazer a suspensão celular até um volume total de 2,5 ml por adição de tampão PBS, misturar bem por pipetagem para cima e para baixo 2 - 3 vezes. </li><li> Colocar o tubo de poliestireno sem uma tampa para o dispositivo magnético e deixada em repouso à TA durante dois0,5 min. </li><li> Após a incubação e, em um movimento contínuo, pegar o imã e despeje a fração de monócitos purificado desejado em um 50 ml tubo de centrifugação limpo. </li><li> Incubar as células aderentes no meio completo de cultura de células suplementado com 2 ul / ml de factor estimulante de colónias (GM-CSF) de granulócitos-macrófagos humanos e de interleucina 4 (IL-4), armazenado a uma concentração de estoque de 10 jig / ml. </li><li> Cada 48 horas, mudar metade do meio, spin para baixo em 1080 xg durante 5 minutos e re-suspender pellet com as novas mídias (cRPMI) e citocinas. </li><li> Permitir 5 - 7 dias para a diferenciação de monócitos em MDDCs. </li></ol> 4. Azul de Tripano ensaio de exclusão de Viabilidade Nota: Use esta técnica para obter rendimento celular e viabilidade de PBMC, monócitos e MDDCs. <ol><li> Células colheita usando o padrão tripsina-EDTA e executar lavagens dos frascos e o sedimento de células utilizando PBS. Dependendo do tamanho do grânulo, resuspender em 5 a 10 ml de PBS para dissolver o sedimento. </li><li> Num tubo de micro-centrifugação, efectuar uma diluição 1: 1 de reagente azul de tripano com sedimento celular diluído. </li><li> A partir desta mistura, uma alíquota de 10 ul em uma célula de contagem corrediça e ler os resultados usando um contador de células automatizado de acordo com o protocolo do fabricante. Se um contador de células automatizado não está disponível, uma contagem de células semelhante é possível utilizando um hemocitómetro ou um contador manual. </li></ol> Ensaio 5. MTT <ol><li> As células em placas a uma concentração de 4 x 10 4/100 ul de meio completo a cada poço numa placa de 96 poços. Permita 24 horas para as células a ajustar à cultura. </li><li> Incubar e efectuar leituras a 0 (dia 0), 36 (dia 3) e 84 (dia 7) horas, respectivamente. </li><li> No final da incubação desejado, remover a mídia e substituir com 100 ul de PBS sozinho. </li><li> Preparar 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio solução de brometo (MTT) (5 mg / ml) por adição de 10 ml de dimethsulfóxido il (DMSO) a 1 g de sulfato de dodecilo de sódio (SDS). </li><li> Adicionam-se 10 ul (5 mg / ml) de uma solução de MTT a cada poço e incubar a 37 ° C durante 2 horas adicionais. </li><li> Após a incubação, remova sobrenadantes que contêm PBS e mistura MTT não convertidos (solução amarela-cor). </li><li> Adicionar 100 ul de solução de SDS-DMSO a cada poço e incubar durante uma hora adicional. </li><li> Ler a absorvância a 540 nm utilizando um leitor de microplacas. </li></ol> 6. Análise de Coloração da superfície celular por citometria de fluxo de imagem <ol><li> Após 7 dias de diferenciação de monócitos purificados, dispensar 1x10 6 alíquotas de células das células dendríticas derivadas de monócitos para o número apropriado de tubos de 1,5 ml. </li><li> Comece a coloração da superfície celular por células de bloqueio, utilizando 50 ul de calor inactivados (HI) de soro humano, incubar a 4 ° C durante 10 min. </li><li> Após a incubação, as células centrifugar a 720 xg durante 5 minutos, rejeitar o sobrenadante. </li><li> A célula pellet, adicionar respectivos anticorpos fluorocromo-conjugados (por exemplo, anti-CD11c ou anti-CD14) e incubar a 4 ° C durante 20 minutos ao abrigo da luz. Em tubos separados, prepare individuais manchado de fluorocromos amostras / ml), uma vez que são necessários para a compensação. </li><li> Após a incubação, lavar as células duas vezes com 1 ml de tampão PBS e centrifugação de cada vez a 720 xg durante 5 min. </li><li> As células protegidas da luz Mantendo, re-suspender em tampão de PBS a uma concentração de células / 100 ul para análise de citometria de fluxo. </li><li> A fim de porta em células viáveis, adicionar 1 ml de DAPI a cada tubo antes de adquirir as células no fluxo de imagens de células única citometria de instrumento de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol> 7. Análise estatística <ol><li> Entrada de todos os dados em uma planilha. </li><li> Comparar resultados utilizando t-teste do estudante e / ou one-way ANOVA, conforme apropriado. </li><li> Considerar as diferenças estatisticamente significativas se p &lt;0,05. </li&gt; </ol>

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<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+dendritic+cells+through+CD40+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.</a> J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).</li>
<li>Fujii, S. i, Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Linkage+of+Innate+to+Adaptive+Immunity+via+Maturing+Dendritic+Cells+In+Vivo+Requires+CD40+Ligation+in+Addition+to+Antigen+Presentation+and+CD80%2F86+Costimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation.</a> J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).</li>
<li>Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+culture+and+maturation+on+human+monocyte-derived+dendritic+cell+surface+markers%2C+necrosis+and+antigen+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding.</a> Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).</li>
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Todos os autores não divulgam interesses financeiros concorrentes.

Com base nas dificuldades conhecidas de isolar e gerando MDDCs de sangue humano, o presente estudo teve como objetivo fornecer uma comparação global dos dois métodos bem estabelecidos para a geração de MDDCs. O primeiro método de comparação é um método tradicional bem estabelecida para gerar MDDCs, explorando a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é rápido e de baixo custo, e não requer o uso de equipamento complexo. No entanto, alg...

As células dendríticas (CDs) são mediadores essenciais dos sistemas imunitários inato e adaptativo. Eles funcionam para induzir respostas imunitárias primárias e facilitar o desenvolvimento de memória imunológica. Estas células são os principais responsáveis para a captura de antígeno, migração e estimulação das células T e, portanto, são chamados de células apresentadoras de antígenos, como profissionais (APCs) 1 .Manipulation de DCs poderiam ser utilizados em uma ampla variedade de campos de pesquisa e na prática clínica para o tratamento diferente doenças inflamatórias, tais como o VIH 6,7, 8 cancro, doenças auto-imunes, 9 e 10 respostas alérgicas. DCs também estão sendo usados para a investigação de abuso de substâncias, a fim de resolver os mecanismos desconhecidos e vias, tais como aqueles associados à dependência de álcool 11-14, dependência de drogas 13,15, ea combinação de infecção e abuso de substâncias HIV 16-19. Estes estudos em curso e futuros estudos in campo da imunologia fazer na geração in vitro de DCs extremamente importante para a investigação. No entanto, existem várias dificuldades associadas com o isolamento de DC a partir do sangue humano como elas constituem apenas 0,1-1% do total de células mononucleares de sangue 20. Até à data, alguns dos métodos bem estabelecidos para a geração de DC in vitro consiste em plástico ou vidro aderência de monócitos 21,22, centrifugação em gradiente de densidade de 23, a separação com base marcador específico, tais como triagem de células activadas magnética 22, triagem de células activadas fluorescentes 24, a selecção positiva de monócitos CD14 + utilizando nanopartículas magnéticas revestidas com dextrano 25, e isolamento rápido de monócitos altamente purificados através de selecção celular negativa totalmente automatizado 26. No entanto, o melhor método de escolha permanece controverso. Portanto, para melhorar as técnicas de geração de DC, vários métodos têm sido desenvolvidos nos quaiso grau de pureza destas células pode ser aumentada pela diferenciação de células progenitoras CD34 + purificadas e os monócitos isolados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) 27. Como mencionado antes, um método amplamente utilizado e popular para a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) é explorar a capacidade dos monócitos para aderir ao vidro ou de plástico (método de aderência) 21,22,27. O método de aderência é um método rápido e simples que não requerem o uso de equipamento complexo. No entanto, algumas desvantagens deste processo incluem a contaminação de linfócitos, baixa flexibilidade, e monócitos manipulação transitória 28. Um método alternativo para o método de aderência é o isolamento magnético de monócitos a partir de PBMC totais, particularmente com o uso de um kit de enriquecimento de monócitos humanos, que se destina a isolar os monócitos a partir de PBMC por selecção negativa 26. Durante este procedimento, as células não desejadas são dirigidos para a remoção com tetraméricacomplexos de anticorpo e as partículas magnéticas revestidas com dextrano. A vantagem deste método de isolamento é que as células marcadas não desejados são separados usando um íman enquanto as células alvo podem ser vertida livremente fora para um novo tubo sem a necessidade de colunas. Até à data, com a disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos que pode marcar populações de células únicas, a técnica de separação magnética tornou-se não só de um método adicional, mas também uma necessidade para o isolamento de células raras no campo da imunologia. Por exemplo, técnicas como a célula magnética triagem com paramagnéticas MACS-nanopartículas disponíveis comercialmente têm facilitado o desenvolvimento de novas abordagens para a investigação e aplicações clínicas 22,29. Além disso, estudos recentes que compararam geração de DC a partir de métodos de aderência de monócitos e tecnologia MACS têm demonstrado uma maior pureza DC e viabilidade usando MACS monócitos 22,30 separados. Os presentes estudos atuaisuma comparação entre dois métodos para a geração de DC humanas a partir de monócitos isolados a partir de PBMC: 1) isolamento de monócitos por adesão e 2) isolamento de monócitos por selecção negativa utilizando um kit comercial de enriquecimento de monócitos humanos. Este estudo fornece evidências para mostrar que o processo de separação negativa selecção magnética para isolar monócitos gera o maior rendimento de monócitos com nenhuma diferença significativa na viabilidade de monócitos, quando comparados com os monócitos isolados pelo método de aderência. Por sua vez, depois de sete dias, os monócitos isolados por separação magnética diferenciada em MDDCs com significativamente maior capacidade proliferativa e maior quantidade de células que expressam duplo positivo (CD11c + / CD14 +) fenótipo sem afectar a viabilidade MDDC. No geral, o presente estudo difere dos estudos anteriores referidos acima, uma vez que demonstra a capacidade de ambas as técnicas para gerar, simultaneamente, os monócitos que são capazes de proliferar e de se diferenciar em CD11c +MDDCs (&gt; 70%) após sete dias em cultura, sem comprometer a sua viabilidade. Além disso, a abordagem actual fornece pela primeira vez caracterização de diferentes populações CD11c / CD14 MDDCs por citometria de fluxo de imagem. Em resumo, uma vez que as DCs desempenhar um papel central em relação à investigação no domínio da imunologia, diferentes parâmetros devem ser tomadas em consideração quando se considera como eles são derivados e métodos que são utilizados para isolar e cultivar-los in vitro. Portanto, este estudo tem como objetivo fornecer informações em dois métodos diferentes de isolamento de monócitos e como esses métodos afetam diferencialmente viabilidade de monócitos e de rendimento, eventualmente, afetar a viabilidade das células dendríticas, proliferação e fenótipo. Estes resultados irão contribuir significativamente para o campo da imunologia e irá proporcionar um protocolo detalhado de DC isolamento, purificação, e caracterização.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>Deve ser usado em RT</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampão de lising</td><td>Qualidade Biológica</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100x)</td> <td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>RoboSep tampão</td><td>StemCell</td><td>20104</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimento de monócitos humanos</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0101</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD4-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Leitor multimodo Synergy 2</td><td>Biotek</td><td>7131000</td><td></td></tr><tr><td>XTT Biorreagente de sal de sódio (XTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X4626-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Biorreagente de dimetilsulfóxido (DMS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de tetrazólio azul de tiazolila (MTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>m5655-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td> <td>Bio-Rad</td><td>161-0302</td><td></td></tr><tr><td>Metossulfato de Fenazina (DMSO)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P9626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inativado (HI) Soro Humano</td><td>Chemicon</td><td>S1-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6 Citômetro de Fluxo</td><td>BD Accuri</td><td>653119</td><td></td></tr><tr><td>FlowSight Amnis Citômetro de Fluxo</td><td>EMD Millipore</td><td>100300</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem citometria de fluxo: uma comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

As células dendríticas (DCs) são células apresentadoras de antígenos do sistema imunológico que desempenham um papel crucial nas respostas dos linfócitos, nos mecanismos de defesa do hospedeiro e na patogênese da inflamação. O isolamento e o estudo das DCs têm sido importantes na pesquisa biológica devido às suas características distintivas. Embora sejam mediadores-chave essenciais do sistema imunológico, as DCs são muito raras no sangue, representando aproximadamente 0,1 - 1% do total de células mononucleares do sangue. Portanto, as alternativas para os métodos de isolamento dependem da diferenciação de DCs de monócitos isolados de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). A utilização de técnicas de isolamento adequadas que combinam simplicidade, acessibilidade, alta pureza e alto rendimento de células é imperativa a ser considerada. No presente estudo, dois métodos distintos para a geração de CDs serão comparados. Os monócitos foram selecionados por adesão ou enriquecidos negativamente usando o procedimento de separação magnética seguido de diferenciação em DCs com IL-4 e GM-CSF. A viabilidade, proliferação e fenótipo de monócitos e MDDC foram avaliados usando corantes de viabilidade, ensaio de MTT e análise de marcadores de superfície CD11c/CD14 por citometria de fluxo de imagem. Embora o método de separação magnética tenha produzido uma porcentagem significativamente maior de monócitos com maior capacidade proliferativa quando comparado ao método de adesão, os achados demonstraram a capacidade de ambas as técnicas de gerar simultaneamente monócitos capazes de proliferar e se diferenciar em MDDCs CD11c+ viáveis após sete dias em cultura. Ambos os métodos produziram > 70% de MDDCs CD11c+. Portanto, nossos resultados fornecem insights que contribuem para o desenvolvimento de métodos confiáveis para isolamento e caracterização de DCs humanas.

<html> Rendimento de monócitos por separação magnética é superior em comparação com monócitos Rendimento pelo Método A adesão Os dados apresentados na Figura 1 PBMC exibição e as contagens de células de monócitos pelo método de exclusão de azul de tripano no dia do isolamento de PBMCs e separação de monócitos. Em média, os monócitos isolados pelo método de adesão responsáveis ​​por aproximadame...

Este estudo compara dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para obtenção de células dendríticas (DCs) in vitro. Os monócitos são selecionados por aderência ou enriquecidos negativamente por separação magnética. O rendimento e a viabilidade de monócitos, juntamente com a viabilidade, proliferação e expressão de marcadores de superfície CD11c/CD14 do MDDC, serão comparados entre os dois métodos.

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

O objetivo geral deste estudo é comparar dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para a geração de células dendríticas in vitro e caracterizar a expressão da superfície celular CT11c e CT14 das populações derivadas de monócitos resultantes por citometria de fluxo com imagem. Esses protocolos de isolamento de monócitos podem contribuir para o desenvolvimento de métodos confiáveis para a purificação de células dendríticas humanas para aplicações em pesquisa e clínicas. A principal vantagem desses protocolos é que eles facilitam o isolamento de monócitos humanos e sua diferenciação em células derivadas de monócitos viáveis e funcionais.Além disso, este é o primeiro estudo a caracterizar a população específica de células dendríticas derivadas de monócitos por citometria de fluxo com imagem em nível de célula única. Este método também pode ser aplicado como uma alternativa para o isolamento de outras células raras com um rendimento adequado para aplicações de pesquisa subsequentes. A demonstração visual desses métodos é essencial, pois pode ser desafiador manipular as amostras de sangue com segurança sem as instruções e experiência adequadas.Beginha diluindo a amostra de sangue em uma proporção de um para um com PBS em um frasco T75. Em seguida, adicione 15 mililitros de solução de gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e sobreponha cuidadosamente 25 a 30 mililitros do sangue diluído sobre o gradiente. Para obter uma separação adequada das células mononucleares do sangue periférico, adicione o sangue sobre a solução de gradiente de densidade rapidamente, mas com cuidado e sem misturar as camadas.Se pare as células por centrifugação, seguido pela transferência da camada de interface de glóbulos brancos para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Lave as células duas vezes em PBS, re-suspendendo o pellet final em 10 mililitros de tampão lisante de cloreto de amônio e potássio por 15 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, lave as células mais duas vezes em PBS.Para isolar monócitos pelo método de aderência, cultive cinco vezes 10 à sétima potência de células do pellet resultante de PBMC por 10 mililitros de meio completo em um novo frasco T75 durante duas horas a 37 graus Celsius e 5 por cento de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. Ao final da incubação, descarte as células não aderentes em suspensão e lave suavemente as células aderentes duas vezes com PBS. Em seguida, alimente as células aderentes com meio de cultura celular completo suplementado com GM-CSF humano e IL-4 e retorne a cultura à incubadora por cinco a sete dias.Para isolar os monócitos por separação magnética, após coletar os PBMCs pela separação em gradiente de densidade, transfira a camada de glóbulos brancos para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e re-suspenda as células em PBS numa concentração de cinco vezes 10 à sétima células por mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de um coquetel de enriquecimento de monócitos humanos por mililitro às células, misturando bem, e incube as células com o coquetel a quatro graus Celsius por 10 minutos. Depois, adicione 50 microlitros de partículas magnéticas por mililitro de células, com mistura cuidadosa, e incube as células a 4 graus Celsius por cinco minutos.No final da segunda incubação, adicione PBS às células para atingir um volume total de dois vírgula cinco mililitros e homogeneíze pipetando de duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo de poliestireno em um dispositivo magnético apropriado à temperatura ambiente. Após dois minutos e meio, com o tubo ainda no ímã, decante a fração purificada de monócitos para um novo tubo cônico de 15 mililitros.Em seguida, cultive os monócitos purificados em meio de cultura celular completo suplementado com GM-CSF e IL-4 por cinco a sete dias, conforme acabou de ser demonstrado. Após sete dias de diferenciação, distribua alíquotas de um vezes dez à sexta potência de células derivadas de monócitos em um número apropriado de tubos de 1,5 mililitro e adicione 50 microlitros de soro humano inativado pelo calor a cada amostra para bloquear qualquer ligação inespecífica. Após 10 minutos, centrifugue as células e re-suspenda os pellets nos anticorpos primários conjugados com fluoróforo apropriados por 20 minutos a quatro graus Celsius, protegidos da luz.Em seguida, lave as células duas vezes em um mililitro de PBS, ressuspendendo os pellets em 100 microlitros de PBS por um vezes dez à sexta potência de células. Pouco antes da análise, adicione um microlitro de DAPI a cada tubo. Em seguida, leia as amostras em um citômetro de fluxo com imagem de célula única de acordo com as instruções do fabricante.Em média, os monócitos isolados pelo método de aderência representam aproximadamente seis vírgula dois por cento da população total de monócitos do sangue periférico, ou PBMC, enquanto os monócitos isolados por separação magnética representam até 25 por cento do total de PBMC. Os monócitos isolados por qualquer um dos métodos são igualmente viáveis. As DCs derivadas de monócitos (MDDCs) diferenciadas a partir de monócitos purificados por ambos os métodos foram inicialmente selecionadas com base em células viáveis, ou seja, negativas para DAPI, entre as células simples totais, seguido pelo seleção de cada população celular.Os dois métodos de isolamento resultaram em uma baixa população única positiva para CD14, e ambos os métodos geraram uma alta população total positiva para CD11c. Foi realizada uma análise fenotípica adicional em todas as células positivas para CD11c, e embora o isolamento magnético forneça uma porcentagem maior de células duplamente positivas (CD11c positiva e CD14 positiva), esse efeito foi não significativo quando comparado ao método de aderência. Essas células duplamente positivas, CD11c positiva e CD14 positiva, podem ser MDDCs em estágio inicial de diferenciação que ainda não perderam o marcador monócito CD14.Ao analisar as células individuais positivas para CD11c, o método de aderência fornece o maior rendimento de células positivas para CD11c e negativas para CD14. Essas células simplesmente positivas podem ser MDDCs diferenciadas em estágio tardio. Após dominados, os procedimentos de aderência e isolamento magnético podem ser concluídos em três a quatro horas e uma a duas horas, respectivamente, se realizados corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de adicionar citocinas frescas para diferenciação de células dendríticas a cada 48 horas, quando o meio for reposto. Trabalhar com fluidos biohazard, como sangue, pode ser extremamente prejudicial, e o uso de equipamentos de proteção individual apropriados e métodos adequados de descarte devem sempre ser adotados ao realizar estes procedimentos. Este estudo abre caminho para pesquisadores na área de imunologia explorarem o uso de monócitos humanos e células dendríticas para tratamentos terapêuticos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como otimizar o isolamento de monócitos humanos para gerar diferentes populações de células derivadas de monócitos in vitro.

characterization-human-monocyte-derived-dendritic-cells-imaging-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Aqui, demonstramos como os monócitos são isolados por separação de esferas magnéticas de células mononucleares do sangue periférico após centrifugação por gradiente de densidade de sangue anticoagulado humano. Após a incubação por 5 dias, os monócitos humanos são diferenciados em células dendríticas imaturas e estão prontos para procedimentos experimentais em um ambiente não clínico.

Geração de células dendríticas derivadas de monócitos humanos a partir de sangue inteiro

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Aqui nós apresentamos um protocolo para caracterizar subconjuntos de monócitos por citometria de fluxo de sangue total. Isso inclui como portão os subconjuntos e avaliar sua expressão de marcadores de superfície de estrutura de tópicos e dando um exemplo da avaliação da expressão de marcadores M2 (anti-inflamatório) e M1 (inflamatória).

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Aqui, apresentamos um protocolo integrado que mede subpopulação de monócitos tráfico sob fluxo in vitro pelo uso de marcadores de superfície específicas e microscopia de fluorescência confocal. Este protocolo pode ser usado para explorar etapas sequenciais de recrutamento, bem como perfil de outros subtipos de leucócitos usando outros marcadores de superfície específicos.

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Apresentado aqui é um protocolo otimizado para isolar, cultivar, transfeccionar e diferenciar monócitos primários humanos de indivíduos infectados pelo HIV e controles saudáveis.

Isolamento, Transfecção e Cultura dos Monócitos Humanos Primários

O isolamento de células de implantes dissecados e sua caracterização por citometria de fluxo podem contribuir significativamente para o entendimento do padrão de resposta imune contra implantes. Este trabalho descreve um método preciso para o isolamento de células de implantes dissecados e sua coloração para análise por citometria de fluxo.

Citometria de fluxo de alta dimensionalidade para análise da função imune de tecidos dissecados de implantes

Aqui, apresentamos um método econômico e eficiente para isolar e gerar células dendríticas derivadas da medula óssea de camundongos após 7 dias de cultura com 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocolo Econômico e Eficiente para Isolar e Culturing Células Dendríticas Derivadas da Medula Óssea de camundongos

Um protocolo único e abrangente para gerar células dendríticas derivadas de monócitos humanos dessialiladas (mo-DCs) a partir de células mononucleares isoladas do sangue periférico (PBMCs) usando um tratamento com sialidase é apresentado. Além disso, são descritos métodos para avaliar a caracterização fenotípica e funcional das mo-DCs e avaliar como o tratamento com sialidase melhora o nível de maturação das mo-DCs.

Geração de Células Dendríticas Derivadas de Monócitos com Fenótipos Sialilados Diferentes

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Um método simples e eficiente para testar agentes imunomoduladores para geração de células dendríticas tolerogênicas a partir de monócitos CD14+ humanos

Aprenda a comparar dois métodos de isolamento de monócitos humanos para geração de células dendríticas in vitro. A citometria de fluxo por imagem caracteriza a expressão de marcadores de superfície CD11c e CD14.

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Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

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