Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

O objetivo geral deste estudo é comparar dois métodos diferentes de isolamento de monócitos humanos para geração de células dendríticas in vitro e caracterizar a expressão da superfície celular CT11c, CT14 das populações derivadas de monócitos resultantes por citometria de fluxo por imagem. Esses protocolos de isolamento de monócitos podem contribuir para o desenvolvimento de métodos confiáveis para a purificação de células dendríticas humanas para pesquisa e aplicações clínicas. A principal vantagem desses protocolos é que eles facilitam o isolamento de monócitos humanos e sua diferenciação em células derivadas de monócitos viáveis e funcionais.

Além disso, este é o primeiro estudo a caracterizar a população específica de células dendríticas derivadas de monócitos por citometria de fluxo de imagem de célula única. Este método também pode ser aplicado como uma alternativa para o isolamento de outras células raras com um rendimento adequado para aplicações de pesquisa a jusante. A demonstração visual desses métodos é fundamental, pois pode ser um desafio manusear as amostras de sangue com segurança sem as instruções e experiência adequadas.

Começar por diluir a amostra de sangue para uma proporção de um para um com PBS num balão T75. Em seguida, adicione 15 mililitros de solução de gradiente de densidade em um tubo de centrífuga de 50 mililitros e coloque cuidadosamente 25 a 30 mililitros de sangue diluído sobre o gradiente. Para obter uma separação adequada das células mononucleares do sangue periférico, carregue o sangue na solução de gradiente de densidade rapidamente, mas com cuidado e sem misturar as camadas.

Separe as células por centrifugação, seguida pela transferência da camada de interface dos glóbulos brancos para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Lave as células duas vezes em PBS, ressuspendendo o pellet final em 10 mililitros de tampão de lise de potássio de cloreto de amônio por 15 minutos a 4 graus Celsius. Em seguida, lave as células mais duas vezes em PBS.

Para isolar monócitos pelo método de aderência, cultive cinco vezes 10 para as sete células do pellet PBMC resultante por 10 mililitros de meio completo em um novo frasco T75 por duas horas a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono em uma incubadora umidificada. No final da incubação, descarte as células flutuantes não aderentes e lave suavemente as células aderentes duas vezes com PBS. Em seguida, alimente as células aderentes com meio de cultura celular completo suplementado com GMCSF humano e IL4 e retorne a cultura à incubadora por cinco a sete dias.

Para isolar os monócitos por separação magnética, após coletar o PBMC por separação por gradiente de densidade, transfira a camada de glóbulos brancos para um tubo de poliestireno de cinco mililitros e ressuspenda as células em PBS em uma concentração de cinco vezes 10 a sete células por mililitro. Em seguida, adicione 50 microlitros de um coquetel de enriquecimento de monócitos humanos por mililitro às células com mistura e incube as células com o coquetel a quatro graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 50 microlitros de partículas magnéticas por mililitro de células com mistura cuidadosa e incube as células a 4 graus Celsius por cinco minutos.

No final da segunda incubação, adicione PBS às células para aumentar o volume total para dois vírgula cinco mililitros e misture pipetando duas a três vezes. Em seguida, coloque o tubo de poliestireno em um dispositivo magnético apropriado em temperatura ambiente. Após dois minutos e meio, com o tubo ainda no ímã, decantar a fração de monócitos purificada para um novo tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, cultive os monócitos purificados e o meio de cultura celular completo suplementado com GMCSF e IL4 por cinco a sete dias, conforme demonstrado. Após sete dias de diferenciação, dispense uma vez 10 aos seis aliquats celulares das células dendríticas derivadas de monócitos no número apropriado de tubos de um vírgula cinco mililitros e adicione 50 microlitros de soro humano inativado pelo calor a cada amostra para bloquear qualquer achado inespecífico. Após 10 minutos, centrifugue as células e ressuspenda os pellets nos anticorpos primários conjugados com fluorescência apropriados por 20 minutos a quatro graus Celsius, protegidos da luz.

Em seguida, lave as células duas vezes em um mililitro de PBS, ressuspendendo os pellets em 100 microlitros de PBS por um vezes dez elevado a seis células. Pouco antes da análise, adicione um microlitro de DAPI a cada tubo. Em seguida, leia as amostras em um citômetro de fluxo de imagem de célula única de acordo com as instruções do fabricante.

Em média, os monócitos isolados pelo método de adesão representam aproximadamente seis vírgula dois por cento da população total de monócitos do sangue periférico, ou PBMC, enquanto os monócitos isolados por separação magnética representam até 25% do PBMC total. Monócitos isolados por qualquer método são igualmente viáveis. Os MDDCs diferenciados de monócitos purificados por ambos os métodos foram primeiro bloqueados com base em células DAPI negativas ou viáveis do total de células únicas, seguido pelo gating de cada população de células.

Ambos os métodos de isolamento produziram uma população CD14 positiva única baixa e ambos os métodos produziram uma população CD11c positiva total alta. Uma análise fenotípica adicional foi realizada em todas as células CD11c positivas e, embora o isolamento magnético forneça uma porcentagem maior de células CD11c CD14 positivas duplamente positivas, esse efeito não foi significativo quando comparado com o método de adesão. Essas células CD11c positivas duplamente positivas e CD14 positivas podem ser MDDCs diferenciados em estágio inicial que ainda não abandonaram o marcador monocítico CD14.

Ao analisar as células CD11c positivas individuais, o método de adesão fornece o maior rendimento de células CD11c positivas e CD14 negativas. Essas células positivas únicas podem ser MDDCs diferenciadas em estágio avançado. Uma vez dominadas, as técnicas de aderência e isolamento magnético podem ser concluídas em três a quatro e uma a duas horas, respectivamente, se forem executadas corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter citocinas de diferenciação de células dendríticas frescas a cada 48 horas quando o meio é reabastecido. Trabalhar com fluidos de risco biológico, como sangue, pode ser extremamente prejudicial, e o uso de equipamentos de proteção individual e métodos de descarte apropriados deve sempre ser tomado ao realizar esses procedimentos. Este estudo abre caminho para pesquisadores no campo da imunologia explorarem o uso de monócitos humanos e células dendríticas para tratamento terapêutico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como otimizar o isolamento de monócitos humanos para gerar diferentes populações de células derivadas de monócitos in vitro.