Name: Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em 15 N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprenda a analisar complexos multiproteicos em membranas de tilacoides usando espectrometria de massa quantitativa. Este método permite comparar a composição proteica sob diferentes condições anaeróbicas em Chlamydomonas reinhardtii.

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MH reconhece o apoio da &quot;Deutsche Forschungsgemeinschaft&quot; (DFG). Autor contribuições: MH investigação destinada; KT, JS e MT realizado pesquisas e analisados ​​os dados; KT e MH escreveu o jornal.

1. A cultura de Chlamydomonas <ol><li> A seguir C. reinhardtii cepas foram utilizados no presente estudo: WT cc124, WT CW15-arg7 (da parede celular deficiente e arginina auxotrofo), uma estirpe mutante ΔPSI 29 e um pgrl1 knock-out tensão 4. </li><li> Todas as estirpes foram crescidas em Tris-Acetato-Fosfato (TAP) médio de 30 a 25 ° C, com uma intensidade de luz contínua de 20-50 μE / m 2 seg e agitando a 120 rpm. A cultura da ΔPSI deve ser envolvido com algum papel de tecido para a exposição à luz de &lt;5 μE / m 2 seg. </li><li> As culturas de estirpes marcadas (ΔPSI e WT cc124, respectivamente) continha 7,5 mM de 15 N NH 4 Cl, enquanto que as culturas de estirpes não marcado (WT CW15-arg7 e pgrl1, respectivamente) continha 7,5 mM de 14 N NH 4 Cl. As células têm de crescer em pelo menos quatro gerandoiões para atingir rotulagem completa e deve ser mantida na fase de crescimento exponencial. </li><li> No dia antes de iniciar a contagem de experiência e diluir as células a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml em um volume de pelo menos 750 ml / deformação. </li></ol> Por favor note que dois tipos de gradientes de densidade de sacarose descontínuo são descritos no seguinte protocolo. Os gradientes de densidade fotossistema sacarose de acordo com Takahashi et al. 9 são usados ​​para separar os diferentes complexos de proteína fotossintética de tilacóides isolados e solubilizados durante durante a noite centrifugação e tem que estar preparado no dia anterior (ver Protocolo 2) e os gradientes de densidade de sacarose thylakoid 8 são aplicados no procedimento de isolamento thylakoid (ver protocolo 3). 2. Preparação de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Para despejar os gradientes são necessários três soluções estoque: <ol><li> 2 M de sacarose </li><li> 10% β-DM em H2O </li><li> 0,5 M de Tricina, pH 8,0 (NaOH) </li></ol></li><li> Usando essas ações, preparar as seguintes soluções: <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="544"><tbody><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> Concentração: </td><td style="width:75px;"> 1,3 M </td><td style="width:75px;"> 1,0 M </td><td style="width:75px;"> 0,85 M </td><td style="width:75px;"> 0,7 M </td><td style="width:75px;"> 0,65 M </td><td style="width:75px;"> 0,4 M </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 2 M de sacarose </td><td style="width:75px;"> 13 ml </td><td style="width:75px;"> 10 ml </td><td style="width:75px;"> 8,5 ml </td><td style="width:75px;"> 7 ml </td><td style="width:75px;"> 6,5 ml </td><td style="width:75px;"> 4 ml </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 10%46;-DM </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td><td style="width:75px;"> 100 ul </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:94px;"> 0,5 M Tricina </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td><td style="width:75px;"> 200 ul </td></tr><tr height="20"><td height="21" style="height:20px;width:94px;"> H2O </td><td style="width:75px;"> 6,7 ml </td><td style="width:75px;"> 9,7 ml </td><td style="width:75px;"> 11,2 ml </td><td style="width:75px;"> 12,7 ml </td><td style="width:75px;"> 13,2 ml </td><td style="width:75px;"> 15,7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Utilize tubos de 14 milímetros x 89 milímetros de centrífuga e despeje os gradientes muito lentamente, começando com a solução de mais elevada densidade de sacarose a solução de menor densidade. </li><li> Despeje apenas 1 ml cada, para os 1,3 e 1,0 M e 2 ml de soluções para o resto das soluções. </li><li> Deixe gradientes durante a noite no quarto frio. </li></ol> 3. Anaerobic Indução e Isolamento de membranas tilacóides 8 <ol><li> Antes de começar com o isolamento de membranas de tilacóides, induzir condições anaeróbicas, fazendo borbulhar árgon durante 4 h. O borbulhamento pode ser realizada por meio de uma pipeta de vidro de cultura de frascos com agitação constante da cultura com uma barra de agitação magnética. </li><li> Comece com o isolamento de membranas de tilacóides por sedimentação das células durante 5 min a 2500 xg, ressuspender em tampão de H1 (0,3 M de sacarose, 25 mM de HEPES (pH 7,5), 5 mM MgCl2). (Por favor, note que quando se inicia com o isolamento de amostras de membranas tilacóides should ser mantidos em gelo para evitar a degradação de proteínas, todos os passos de centrifugação são realizados a 4 ° C e a trabalhar com luvas é fortemente recomendada para evitar a contaminação de queratina.) </li><li> Células de pellets por 5 min a 2.500 xg, ressuspender em tampão H1. </li><li> Quebre as células com duas passagens através de um nebulizador com uma pressão de azoto de 1500 hPa (para as estirpes sem parede celular fazer apenas uma passagem). </li><li> Gire para baixo as células de 7 min a 2.500 x g. (Após este passo, o sobrenadante deve ser verde claro, se não, a ruptura celular não foi bem sucedida.) </li><li> Ressuspender as células em tampão de H2 (0,3 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e as células peletizadas para 10 min a 32.800 x g. </li><li> Ressuspender as células em tampão de H3 (1,8 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)) e homogeneizar pelota com um potter (sem partículas verdes deve permanecer no final desta etapa de trabalho). </li><li> Prepare gradientes de densidade de sacarose thylakoid em banheiraes (25 mm x 89 mm) por começando na parte inferior com uma camada de 12 ml de tampão com células H3, verter uma camada do meio, de 12 ml de tampão H4 (1,3 M de sacarose, 5 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de EDTA ( pH 8,0)) e no topo de 12 ml de tampão H5 (0,5 M de sacarose, HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). Tenha cuidado ao despejar os gradientes e evitar a mistura das três camadas. </li><li> Equilibrar com tampão H5 e gradientes de densidade de sacarose tilacói centrífuga durante 1 hora a 70.700 x g. </li><li> Retirar bandas tilacói dos gradientes de densidade de sacarose e tilacóides diluí-los com um volume de tampão H6 apropriado (HEPES 5 mM (pH 7,5), EDTA 10 mM (pH 8,0)). </li><li> Gire as células em 37.900 xg por 20 min. Se a pastilha não é apertado, mais tampão H6 é necessário para este passo de centrifugação. </li><li> Ressuspender thylakoids em um buffer H6 pequeno volume e prosseguir com determinação da concentração de clorofila. </li></ol> 4. Determinação da Concentração de Clorofila 31 </sup&gt; <ol><li> A determinação da quantidade de clorofila é realizada com 80% de acetona. </li><li> Misturar 995 mL de 80% de acetona e 5 mL de tilacóides em tampão H6 (diluição 1:200). </li><li> Vortex por alguns segundos até que não haja partículas verdes permanecem e, em seguida, girar em 14,1 g durante 5 min. </li><li> Leve o sobrenadante e medir a extinção em 663,6 e 646,6 nm e 750 nm, respectivamente. </li><li> Calcula-se a quantidade de clorofila utilizando a seguinte fórmula: <ol><li> C Chl a [mg / ml] = (0,01225 * E 663,6-0,00255 * E 646,6) * factor de diluição </li><li> C Chl b [mg / ml] = (0,02031 * E 646,6-0,00491 * E 663,6) * factor de diluição </li><li> C Chl [mg / ml] = C + C Chl a Chl b </li></ol></li></ol> 5. Carregamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Calcule a quantidade de tilacóides, β-DM e tampão H6 que são necessáriospara cada gradiente: <ol><li> Cada rampa deve ser carregado com um volume total de 700 ul com 0,8 mg / ml em 0,9% de clorofila β-MS (dissolver β-DM em H 2 O), preencher o volume restante com tampão H6. </li></ol></li><li> Para solubilização preparar diferentes alíquotas, com tilacóides, β-DM e tampão H6 para cada gradiente. </li><li> Deixar as amostras durante 20 minutos em gelo, com agitação regular (inversora) a cada poucos minutos (passo de solubilização). </li><li> Centrifugar a uma velocidade máxima (14000 xg) durante 10 min a 4 ° C. (Após a centrifugação, o sedimento deve ser pequeno e esbranquiçado, enquanto o sobrenadante é verde-escuro.) </li><li> Carregar sobrenadante sobre os gradientes. </li><li> Equilibrar com tampão H6 e girar usando ultracentrífuga a 134.470 xg durante a noite (14 horas) a 4 ° C. (Por favor, note que a separação bem sucedida de complexos fotossintéticos usando gradientes de densidade fotossistema sacarose como apresentado neste protocolo só é alcançada quando using recém tilacóides isolado, uma vez que uma previsão para a solubilização e separação complexo é difícil de fazer quando se trabalha com membranas de tilacóides que tenham sido congeladas antes.) </li></ol> 6. Fracionamento de gradientes de densidade de sacarose Fotossistema <ol><li> Tire fotos dos gradientes. </li><li> Perfurar um furo na parte inferior do tubo por meio de uma agulha e gradientes de fraccionar em 500 tubos de ul. Alternativamente, o fraccionamento pode também ser realizado usando uma placa de 96 cavidades (microplaca). </li><li> Ao utilizar uma microplaca, determinar a absorbância das diferentes frações do gradiente em 675 nm. (Neste passo as amostras podem ser armazenadas a -80 ° C durante algumas semanas.) </li></ol> 7. SDS-PAGE e imunodetecção (Por favor, note que apenas a comparação de WT vs ΔPSI um western blot foi realizada para selecionar as frações para posterior MS-análise. Para o experimento WT vs pgrl1 fracções foram escolhidos por meio da absorção em diferentes fracções.) <ol><li> Separe 30 ul de cada fracção de WT e ΔPSI gradiente em 13% de SDS em gel de poliacrilamida 32. </li><li> Realizar análise de western blot 33 utilizando os seguintes anticorpos: ANR1 (TEF7) 26, PGRL1 34, CAS 6, o AASI PSI subunidade 32 e PSII núcleo subunidade D1. Use todos os anticorpos com uma diluição de 1:1.000 (por técnica de detecção de quimioluminescência aumentada), excepto para o anticorpo D1, que deve ser utilizado com uma diluição de 1:10.000. </li><li> Com base nos resultados da imunodetecção, tomar as frações de pico de ANR1, PGRL1 e AASI para WT e ΔPSI (aqui frações 6 e 13, respectivamente), misturar 30 mL da fração 6 do WT e ΔPSI e fazer o mesmo com a fração de 13 de ambas as composições e separar os novamente sobre um gel de poliacrilamida SDS a 13%. </li><li> Para a comparação quantitativa do WT vs pgrl1 tomar o CFracções EF-supercomplex como determinado através da medição da absorvância nas diferentes fracções do gradiente e misturar 30 ul de ambas as amostras, seguido por separação num gel de SDS-poliacrilamida a 13%. </li><li> Manchar as bandas de proteína com uma solução de Coomassie (ácido fosfórico 85%, sulfato de amónio 757 mM, 1,2% de azul brilhante de Coomassie, 20% de metanol) durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Para remover manchas inespecífica, lavar várias vezes com DDH 2 O. </li><li> Corte as pistas em um milímetro pedaços de gel e prosseguir com a digestão em gel. (Alternativamente, as amostras podem ser secas de alguns minutos em uma centrífuga de vácuo e armazenados durante algumas semanas antes de continuar com a digestão em gel.) </li></ol> 8. A digestão em gel (a partir de modificação Shevchenko et al. 35) Por favor, note a preparar todos os buffers e soluções imediatamente antes da utilização e tomar garrafas de vidro para buffers contendo acetonitrila (ACN). &lt;br /&gt; ATENÇÃO! Trabalhando com ACN pode ser prejudicial; mais informações pode ser baixado em: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927335 (2013). <ol><li> Lavar com pedaços de gel&gt; 10 volumes de ddH2O (~ 200 mL) durante 30 seg. </li><li> Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 durante 15 min com agitação, remover o líquido. </li><li> Incubar os pedaços de gel, com 300 ul de mM NH 4 HCO 3 25 em 50% de ACN (preparar por mistura de ACN e 50 mM NH 4 HCO 3 a uma razão de 1:1) durante 15 min com agitação, remover o líquido. </li><li> Se as peças de gel são ainda azul, repetir o NH 4 HCO 3 e NH 4 HCO 3 / ACN lava até a maioria do Coomassie é removido. (Embora a maior parte da coloração com Coomassie deve ser removido, ele não é necessário para Destain os pedaços de gel completamente.) </li><li> Adicionar 100 ul de ACN para desidratar os pedaços de gel por 5 min. Os pedaços de gel deve encolher umª olhar completamente branco. </li><li> Remover o máximo possível ACN e prossiga com a digestão de tripsina. Alternativamente, as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C durante algumas semanas. </li><li> Adicionar 10-20 mL por banda de 20 ng / mL de tripsina em 10% ACN / 25 mM NH 4 HCO 3 (recém diluído), manter as amostras em gelo. </li><li> Após 30 min, verificar se toda a solução foi absorvida e adicionar mais tampão de tripsina, se necessário. Pedaços de gel deve ser completamente cobertas com tampão de tripsina. Manter as amostras em gelo. </li><li> Deixar pedaços de gel por mais 90 min em gelo para saturar os com tripsina. (Etapa crítica: a produção de peptídeos trípticos aumenta consideravelmente com o aumento do tempo de incubação em gelo, provavelmente por causa da difusão lenta da enzima na matriz de poliacrilamida É necessário ter um pequeno excesso de solução cobrindo os pedaços de gel para evitar que as peças. cair seco durante a incubação durante a noite.) </li><li> Digerir a 37 ° C durante 4-6 horas. Para os experimentos que requeremrecuperação peptídeo máxima, digerir durante a noite. </li><li> Após a digestão girar tampão condensado. </li><li> Sonicar tubos durante 5 min para eluir os péptidos e centrifugar de novo. </li><li> Recolher o sobrenadante e transferi-lo para um novo tubo. </li><li> Realizar a extracção de péptidos com 80 ul de 30% ACN / 1% de ácido fórmico (FA), num banho sónico, durante 15 min. </li><li> Realizar a extracção com 80 mL de 30% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min. </li><li> Realizar a extracção com 80 mL de 70% de ACN / 1% de FA em um banho sónico, durante 15 min. </li><li> Centrifugar novamente e piscina sobrenadante com o fluido antes. (FA serve para inactivar a tripsina e aumentar a solubilidade do péptido). </li><li> Solução de peptídeo seca completamente numa centrífuga de vácuo. (Nesse momento as amostras podem ser armazenadas durante algumas semanas, em -20 ° C, antes de prosseguir com o MS-análise). </li><li> Peptídeos Ressuspender em 6 mL MS tampão (5% ACN, 0,1 v / v FA, água) e sonicado por 2-5 min. </li><li> Centrifugar as amostras a maximum velocidade durante 5 minutos para remover o material em partículas. </li><li> Use 4 ul de sobrenadante para análise por espectrometria de massa. </li></ol> 9. MS-Análise de Dados com &quot;Proteomatic&quot; A análise dos dados foi realizada com o software open-source &quot;Proteomatic&quot; (que pode ser baixado em http://www.proteomatic.org/), uma plataforma que permite a geração e realização de MS / MS pipelines de avaliação de dados, usando software livre e comercial 36. Resumidamente, as configurações são descritas a seguir e informações mais detalhadas podem ser encontradas em 6,26. <ol><li> Identificação e quantificação de dados MS- A identificação e quantificação de proteínas de o WT vs ΔPSI experiências foram realizadas com OMSSA (versão 2.1.4 37) e qTrace 26, respectivamente, como descrito 6,26. Para a análise de dados a partir de MS-o experimento WT vs pgrl1 o seguinte oleoduto actualização foi utilizado:<ol><li> Além OMSSA 37, as proteínas foram também identificados com X! Tandem (versão 2013/02/01 38). Ambos os algoritmos foram aplicados através de pesquisa contra um banco de dados gerado pela combinação do JGI Chlamydomonas banco de dados modelo gene versão 4.3 com a versão do banco de dados AUGUSTUS 10.2, bem como contra um banco de dados do NCBI juntou bancos de dados BK000554.2 e NC_001638.1. </li><li> MS 2 Identificação de péptidos foi realizada utilizando uma abordagem de chamariz alvo 39. Um engodo para cada proteína foi criado por baralhar aleatoriamente péptidos trípticos, mantendo a redundância de péptidos nonproteotypic. </li><li> Validação estatística dos péptidos foi realizada com o qvality software (versão 0.3.3 40) utilizando uma probabilidade de erro posterior (PEP) limiar de menos do que 0,01 e os resultados foram filtrados com uma tolerância de massa precursor de 5 ppm. </li><li> Peptídeos de OMSSA e X! Runs Tandem se juntaram e quantificadas com qTrace <sup&gt; 26 aplicando as seguintes etapas de filtragem: exija o MS 2 Identificação, adicionar nomes de proteína / informações do grupo e exigem ambos os peptídeos irmã. </li></ol></li></ol> Para investigar se a proteína proporções foram significativamente diferentes em relação uns aos outros nas frações CEF-supercomplex mistas de WT e pgrl1, a análise estatística foi realizada a aplicação do software SPSS (versão 21). As sub-unidades do complexo de citocromo b 6 / f foram testados contra o outro, assim como as proteínas FNR, FTSH2 e HCF136 contra as subunidades PSI. Os rácios de péptidos de cada contagem de varredura por proteína de todas as quatro repetições foram testados para a distribuição normal com o teste de Shapiro-Wilks. Uma vez que as populações de péptidos não foram distribuídos normalmente (p &lt;0,001), foram realizadas estatísticas não paramétricas. Primeiro, o teste de Kruskal-Wallis foi aplicado avaliando uma divergência significativa entre os grupos. Só se este teste previsto diferença significativas entre grupos, foi realizada uma análise mais aprofundada de prever as diferenças significativas entre os dois grupos independentes, com o teste de Mann-Whitney U-teste.

Os autores declaram que não há interesse financeiro concorrente.

Diferentes estudos de proteômica quantitativa, utilizando rotulagem de isótopos estáveis ​​têm sido publicados nos últimos anos. Nestas experiências, normalmente duas amostras diferentes são comparados, de que uma amostra é marcada com um isótopo estável. Posteriormente, as proteínas ou os péptidos de ambas as amostras são combinadas numa proporção igual e ainda mais processados ​​em conjunto 48. Tais estudos, muitas vezes a intenção de comparar os compartimentos definidos isoladas celulares (por exemplo,...

Processos fotossintéticos em tilacóides de plantas e algas podem funcionar de modo linear e cíclica. Durante o fluxo de elétrons linear (LEF) fotossistema I (PSI), fotossistema II (PSII) e citocromo b 6 / f em última análise, transferir elétrons da água para o NADP + 1, o que leva à geração de NADPH e ATP 2. Em contraste, cíclico fluxo de elétrons (CEF), que é conhecido por ser induzida sob diversas condições ambientais, como o estado 2 3 e 4, as condições anaeróbias resulta na redução de re do PSI oxidados através da injeção de elétrons de volta para a cadeia de transporte de elétrons. Este processo pode ocorrer tanto no lado do estroma do citocromo b 6 / f complexo 1 ou na piscina plastoquinona 5 e gera ATP, mas não NADPH 2. O objectivo do protocolo apresentado serve para demonstrar a espectrometria de massa (MS) m baseadoétodo para a análise comparativa e quantitativa de complexos multiprotein em tilacóides de Chlamydomonas reinhardtii para obter insights sobre a composição destes complexos em condições diferentes (exemplificadas comparando linhagens geneticamente diferentes). Esta abordagem foi aplicada em uma publicação por Terashima et al., Em 2012, mostrando uma Ca 2 +-regulação dependente da CEF em C. reinhardtii mediada por um complexo multiproteico, incluindo as proteínas do CAS, ANR1, e PGRL1 6. O procedimento será explicado por comparativamente a análise da composição de CEF-supercomplex em duas estirpes geneticamente diferentes, tirando assim partido de rotulagem uma das duas estirpes com azoto pesado (15 N). Resumidamente, o protocolo inclui a preparação de membranas de tilacóides, seguido de solubilização detergente e fraccionamento de complexos fotossintéticos em um gradiente de densidade de sacarose. Após o fracionamento do gradiente, frac selecionadoções de duas estirpes são misturadas com base no volume igual, separadas por SDS-PAGE seguido por digestão em gel e subsequente análise por MS quantitativa. Como mencionado acima, a CEF é induzida em diferentes condições ambientais e uma publicação de 2010 demonstra o isolamento de um funcional CEF-supercomplex de estado 2 de células bloqueadas C. reinhardtii 7, a qual foi realizada por separação tilacóides solubilizados em um gradiente de densidade de sacarose durante a ultracentrifugação. Diferente do Iwai et al. 7, o protocolo apresentado descreve o isolamento de CEF-supercomplex de anaeróbio crescido C. culturas reinhardtii, seguindo um procedimento alternativo. Isto inclui mudanças no protocolo de isolamento thylakoid bem como as diferenças relativas ao passo solubilização ea separação de complexos de proteínas por ultracentrifugação. No presente protocolo, tilacóidessão isolados mediante a aplicação do processo publicado por Chua e Bennoun 8, enquanto que os tampões usados ​​para a preparação de tilacoide por Iwai et al. continha 25 mM de Mes, 0,33 M de sacarose, 5 mM de MgCl2, 1,5 mM de NaCl (pH 6,5) como descrito 9. A solubilização foi realizada com 0,7-0,8% de detergente (de n-tridecil-β-D-maltósido) durante 30 min em gelo, no caso de Iwai e colegas de trabalho, enquanto o método de solubilização descrito aqui baseia-se no uso de 0,9% de detergente (n -Dodecil-β-D-maltósido (β-MS)) e é realizado por apenas 20 minutos em gelo. Ambos os grupos utilizaram 0,8 mg de clorofila por ml para a solubilização com o respectivo detergente. Para a separação dos complexos fotossintéticos de tilacóides solubilizadas Iwai et al. Aplicadas concentrações de sacarose entre 0,1-1,3 M, ao passo que os autores deste protocolo utilizado concentrações variando 0,4-1,3 M. A última diferença é a velocidade de centrifugação, que é menor em comparação ao eApublicação rlier. A solubilização das membranas tilacóides com detergentes não iónicos, seguido por fraccionamento de densidade de gradiente de sacarose foi já aplicado em numerosos estudos que vão desde a década de 1980 até hoje 7, 9-14 e também a aplicação da marcação metabólica das proteínas é um método generalizado no campo proteómica. A abordagem descrita aplica-se a marcação metabólica 15N para uma das duas estirpes por cultura de comparação que, na presença de azoto pesado como única fonte de nitrogénio na forma de 15 N NH 4 Cl, o que é incorporada em todos os aminoácidos que conduzem a uma massa mudar dependendo da sequência de aminoácidos do péptido. Quando a análise de uma mistura de 14 N e 15 N dentro de um MS executado, este deslocamento de massa pode ser usada para determinar a origem da amostra, para cada péptido e o péptido relativa abundância pode ser calculada representando abundâncias relativas para o correspondenteção da proteína 15. Numerosos estudos quantitativos sobre proteômica C. reinhardtii estão disponíveis, o que comparar uma quantidade definida de proteína para analisar as alterações do proteoma entre as condições experimentais (por exemplo, mudanças no proteoma de nutrientes devido a 16-19 ou luz estresse 20,21). Comparado a esses estudos, a abordagem atualmente apresentada volumes iguais de amostras são combinados e analisados. Esta configuração permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro da inclinação e, além disso, a análise da composição de diferentes complexos com respeito às estirpes investigadas. Este método irá ser explicada pela concentração principalmente em três proteínas: O primeiro candidato é o CAS proteína sensor de cálcio localizada-cloroplasto, que foi mostrado estar envolvida na foto-aclimatação em C. reinhardtii 22. O cálcio é considerado para ser um sinal importanteção de íons para caminhos que são ativados devido a diferentes estresses bióticos e abióticos, finalmente, levando a mudanças na expressão genética e fisiologia da célula 23 e foi proposto que os cloroplastos podem contribuir para celular Ca 2 + sinalização via proteína CAS 22,24,25. A segunda proteína é ANR1 (resposta anaeróbia 1 6), uma proteína que se mostrou ser induzida em condições de crescimento em anóxicas C. reinhardtii 26. Notavelmente, CAS, bem como ANR1 foram identificadas como subunidades de CEF-supercomplex e, além disso, utilizando abordagens genéticas reversa, foi demonstrado que ambas as proteínas funcionalmente contribuir para CEF in vivo 6, suportando o seu papel como subunidades funcionais deste complexo proteína. A terceira proteína é a proteína de tilacoide PGR5-like 1 (PGRL1), que foi mostrado estar envolvidas em CEF em Chlamydomonas 4,27, bem como em Arabidopsis 5,28 e era também IDentified no trabalho de Iwai et al. 7 Esta abordagem irá ser apresentada mostrando os resultados de duas experiências diferentes: de tipo selvagem (WT) versus (vs) uma estirpe ΔPSI 29, apresentando uma deleção do gene PSAB, que codifica para uma subunidade fotossistema essencial I, que também é parte da CEF-supercomplex e WT contra um pgrl1 knock-out tensão 4. Para cada uma destas experiências, a composição quantitativa do CEF-supercomplex entre 15 N e uma deformação de 14 N-etiquetada tem sido comparado.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>AppliChem</td><td>A0662</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetona</td><td>AppliChem</td><td>A2300</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Acetonitrila Optigrade f&uuml; r LC-MS</td><td>Diagonal</td><td>9340</td><td>Nocivo, trabalhe com luvas. Consulte o texto do protocolo para obter mais precauções. https://www.diagonal.de/</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio 15N</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>39466-62-1</td><td>http://www.isotope.com/cil/index.cfm</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio 14N</td><td>AppliChem</td><td>A0988</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Hidrogenofosfato de amônio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3583</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Sulfato de amônio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3598</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Coomassie azul brilhante R-250</td><td>Fisher Scientific</td><td>10041653</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/deindex</td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltosídeo</td><td>AppliChem</td><td>A0819</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>EDTA</td><td>AppliChem</td><td>A2937</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Ácido fórmico&nbsp; &nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3858</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>AppliChem</td><td>A4425</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>AppliChem</td><td>A2954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Ácido fosforoso</td><td>AppliChem</td><td>A0989</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Hidrogenofosfato dipotássico&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1042</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Fosfato de dihidrogênio de potássio&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>hidróxido de sódio</td><td>AppliChem</td><td>A1551</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Sacarose</td><td>AppliChem</td><td>A1125</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td>http://www.applichem.com/home/</td></tr> <tr><td>Tripsina (grau de sequenciamento modificado) e tampão de tripsina</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>http://www.promega.de/</td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nebulizador (disruptor de células BioNeb)</td>Tubos de centrífuga <td>Glas-Col</td><td></td><td>http://www.glascol.com/product/subproduct/id/75</td></tr><tr><td>(14 mm x 89 mm)&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>para preparação de gradientes de estilo Takahashi
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 25 mm x 89 mm </td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>para preparação de gradientes de isolamento de tilacóides.
http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Coulter Avanti Centrifuge J-20 XP</td> Câmara de Medição de Células <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://www.beckmancoulter.de/</td></tr> <tr><td>Fuchs-Rosenthal</td><td>Diagonal</td><td>449/72</td><td>https://www.diagonal.de/</td></tr> <tr><td>Homogeneizador (Potter) 50 ml&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>10618242</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Pistil para homogeneizador</td><td>Fisherbrand</td><td>105252220</td><td>http://www.de.fishersci.com/index.php/defisherbrand</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (Optima XPN-80 Ultracentrifuge)</td><td>Site da Beckman Coulter</td><td></td><td>: http://www.beckmancoulter.de/</td></tr><tr><td>Outros</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos&nbsp;</td><td>Agrisera</td><td></td><td>http://www.agrisera.com/en/index.html</td></tr></tbody></table>

uma nova abordagem para a análise comparativa de complexos multiproteicos baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; n metabólica labeling e quantitativa espectrometria de massa

A New Approach for the Comparative Analysis of Multiprotein Complexes Based on 15N Metabolic Labeling and Quantitative Mass Spectrometry

O protocolo introduzido fornece uma ferramenta para a análise de complexos multiproteicos na membrana tilacoide, revelando insights composição complexa, sob diferentes condições. Neste protocolo a abordagem é demonstrada através da comparação da composição do complexo de proteínas responsáveis ​​pela cíclico fluxo de electrões (CEF) na Chlamydomonas reinhardtii, isolado a partir de estirpes geneticamente diferentes. O processo compreende o isolamento de membranas de tilacóides, seguida pela sua separação em complexos multiproteicos por centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, SDS-PAGE, espectrometria de imunodetecção e comparativa, quantitativa de massa (MS) com base na marcação metabólica diferencial (14 N / 15 N) do cepas analisadas. Tilacóides solubilizados detergentes são carregados em gradientes de densidade de sacarose na concentração igual clorofila. Após ultracentrifugação, os gradientes são separados em fracções, as quais foram analisadas por massa spectrometry baseado em igual volume. Esta abordagem permite a investigação da composição dentro das frações de gradiente e, sobretudo, para analisar o comportamento de migração de proteínas diferentes, com especial incidência sobre ANR1, CAS, e PGRL1. Além disso, este método é demonstrado pela confirmando os resultados com immunoblotting e, adicionalmente, apoiando as descobertas de estudos anteriores (a identificação e a migração dependentes do PSI de proteínas que foram previamente descritos para fazer parte da CEF-supercomplex como PGRL1, FNR, e cit f). Notavelmente, esta abordagem é aplicável para tratar uma ampla gama de questões para as quais este protocolo podem ser adotadas e, por exemplo utilizados para análises comparativas de composição complexa multiprotein isolado de condições ambientais distintas.

A abordagem proteômica quantitativa introduzida tem por objetivo caracterizar a composição dos complexos multiprotein em tilacóides demonstrados pela análise comparativa dos componentes CEF-supercomplex em geneticamente diferente C. reinhardtii cepas. O método descrito foi aplicado com sucesso por Terashima et al. 6 e compreende o isolamento de membranas de tilacóides de anaeróbios cultivadas culturas, seguido por detergente de solubilização. Subsequentemente, as amostras são carregadas para...

A abordagem descrita comparativa, quantitativa proteómica visa obter conhecimentos sobre a composição de complexos multiproteicos sob diferentes condições e é demonstrada através da comparação geneticamente diferentes estirpes. Para a análise quantitativa de volumes iguais de diferentes fracções de um gradiente de densidade de sacarose são misturados e analisados ​​por espectrometria de massa.

Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

The introduced protocol provides a tool for the analysis of multiprotein complexes in the thylakoid membrane, by revealing insights into complex ...

O objetivo geral deste procedimento é analisar comparativamente a composição de complexos MultiPro em membranas de cordões thal sob diferentes condições. Isso é realizado primeiramente isolando membranas thal de células lamona expostas a condições anaeróbicas. Em seguida, as membranas de cordão thal são solubilizadas e fracionadas em um gradiente de densidade de sacarose.Em seguida, volumes iguais das frações desejadas são misturados e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Por fim, as bandas coradas com coomassie são digeridas com tripsina. Em última instância, as amostras são analisadas por espectrometria de massa quantitativa para observar alterações na abundância proteica entre as frações investigadas.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos proteômicos quantitativos que comparam uma quantidade definida de proteína, é que na nossa abordagem, volumes iguais de amostras fracionadas são combinados e analisados. Isso permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro do gradiente e, além disso, analisar a composição de diferentes complexos não proteicos na membrana do terceiro grupo. Em relação às cepas utilizadas, após o cultivo de cepas de Chlamydomonas reinhardtii, de acordo com o protocolo descrito, utilize soluções estoque de sacarose 2 M, beta-DM 10% em água e Tris 0,5 M, pH 8,0.Para preparar as seguintes soluções para gradientes de densidade de sacarose, a fim de montar os gradientes utilizando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comece derramando lentamente um mililitro da solução 1,3 molar, seguido por um mililitro da solução 1,0 molar. Em seguida, adicione dois mililitros de cada uma das soluções 0,85, 0,7, 0,65 e, finalmente, a solução 0,4 molar. Armazene os gradientes durante a noite na câmara fria para induzir condições anaeróbicas.Nas culturas de chlamydomonas, insira uma pipeta de vidro nos frascos de cultivo e borbulhe com Argonne por quatro horas com agitação contínua e iluminação para o isolamento de membranas do talo. Após a incubação, inicie pela centrifugação das células por cinco minutos a 2.500 ×g e quatro graus Celsius. Em seguida, re-suspenda os pellets celulares em 30 mililitros de tampão H um.Repita a centrifugação e, novamente, ressuspenda. Suspenda as células no tampão H um para romper as células, passe-as por um nebulizador com uma pressão de nitrogênio de 1.500 pascals. Certifique-se de que a distância entre a esfera de cerâmica e o metal seja pequena o suficiente para que as células se rompam.Em seguida, centrifugue as células por sete minutos a 2.500 ×g e 4 °C. O sobrenatante deve ser de cor verde claro. Se a ruptura celular foi bem-sucedida, ressuspenda as células em 50 mililitros de tampão H₂ e centrifugue-as por 10 minutos a 32.800 ×g e 4 °C.Em seguida, após ressuspender as células em 10 mililitros de tampão H três, utilize um potter para homogeneizar a suspensão celular. A seguir, prepare gradientes de densidade de sacarose em cordão de tal. Inicie com 12 mililitros de células em tampão H três.Em seguida, despeje lentamente uma camada de 12 mililitros de tampão H4 e finalize com 12 mililitros de tampão H5. Use H5 para equilibrar o rotor e centrifugue os gradientes por uma hora a 70.700 ×g. Remova as bandas de TH dos gradientes e utilize um volume apropriado de tampão H6 para diluí-las.Centrifugue as células a 37.900 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Se o pellet não estiver compacto, adicione mais tampão H6 ao passo de centrifugação. Em seguida, reconstitua.Suspenda os cordões tilacoides em um pequeno volume de tampão H seis para carregar um gradiente de densidade de sacarose em sistema fotográfico. Primeiro, calcule as quantidades de cordões tilacoides, beta DM e tampão H seis necessárias para cada gradiente. Seguindo estas orientações, cada gradiente conterá 0,8 miligramas por mililitro de clorofila em 0,9% beta DM e o tampão H seis elevará o volume final a 700 microlitros.Para solubilizar os tilsos, prepare separadamente soluções de Eloqua com tilsacoides beta DM e tampão H seis para cada gradiente. Incube as amostras em gelo por 20 minutos, invertendo a cada poucos minutos para misturar. Após centrifugar as amostras a 14.000 vezes a gravidade por 10 minutos a quatro graus Celsius.O pellet deve ser pequeno e esbranquiçado, e o sobrenadante será verde escuro. Carregue o sobrenadante sobre as graduações equilibradas com tampão H seis e ultracentrifugue a 134.470 ×g por 14 horas a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, tire fotos das graduações e, em seguida, fracione-as.Use uma agulha para perfurar um orifício na parte inferior do tubo e colete as frações em tubos de 500 microlitros. Ou um processo em placa de 96 poços. As amostras para eletroforese em gel SDS-PAGE, digestão em gel e espectrometria de massa de acordo com o protocolo descrito no texto, conforme mostrado aqui, utilizando os resultados da fração seis da análise imunológica do sangue do tipo selvagem e da fração 13 do delta PS um.As frações de pico de A e R um foram escolhidas para análise dos componentes do supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico nesta figura. As proporções relativas de proteínas são representadas como tipo selvagem sobre delta PS um, 14 N sobre 15 N, para diversas proteínas centrais e de captura de luz do PS um, bem como para proteínas atribuídas ao supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico. As diferenças na abundância de NR um e CAS nas frações seis e 13 de tipo selvagem e delta PS um sugerem que elas são componentes novos deste complexo. São apresentados aqui os resultados da comparação quantitativa deste supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico entre o tipo selvagem e uma linhagem com deleção de PG L um. Curiosamente, HCF 1 36, citocromo B seis, subunidade quatro do citocromo B seis F e PET C parecem estar enriquecidos no tipo selvagem, enquanto FTSH dois, citocromo F e PET O parecem estar enriquecidos em PG L um.Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como comparar a composição de complexos MultiPro em membranas líquidas di sob diferentes condições. Tenha em mente que, para o preparo bem-sucedido das membranas líquidas e o isolamento do fluxo eletrônico cíclico, a ruptura celular de supercomplexos, a homogeneização das células e a solubilização das membranas líquidas são etapas críticas. Além disso, os gradientes de densidade de sacarose precisam ser centrifugados por pelo menos 12 horas para se obter a separação completa dos complexos fotossintéticos.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

precursor marcação isotópica combinados e marcação isobaric (cPILOT) é uma estratégia proteômica quantitativa que aumenta a capacidade de multiplexação de amostras de etiquetas isobáricos. Este protocolo descreve a aplicação de cPILOT aos tecidos a partir de controlos modelo de rato da doença e do tipo selvagem de um Alzheimer.

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

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Proteome profunda de criação de perfil por isobárica rotulagem extensa cromatografia líquida, espectrometria de massa e quantificação assistida por Software

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Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

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Rotulagem covalente com dietilpirocarbonato para estudar estrutura de alta ordem de proteína por espectrometria de massa

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Aprenda a analisar complexos multiproteicos em membranas de tilacoides usando espectrometria de massa quantitativa. Este método permite comparar a composição proteica sob diferentes condições anaeróbicas em Chlamydomonas reinhardtii.

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