Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em

O objetivo geral deste procedimento é analisar comparativamente a composição de complexos MultiPro em membranas de cordões thal sob diferentes condições. Isso é realizado primeiramente isolando membranas thal de células lamona expostas a condições anaeróbicas. Em seguida, as membranas de cordão thal são solubilizadas e fracionadas em um gradiente de densidade de sacarose.

Em seguida, volumes iguais das frações desejadas são misturados e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS. Por fim, as bandas coradas com coomassie são digeridas com tripsina. Em última instância, as amostras são analisadas por espectrometria de massa quantitativa para observar alterações na abundância proteica entre as frações investigadas.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como estudos proteômicos quantitativos que comparam uma quantidade definida de proteína, é que na nossa abordagem, volumes iguais de amostras fracionadas são combinados e analisados. Isso permite estudar o comportamento de migração das proteínas dentro do gradiente e, além disso, analisar a composição de diferentes complexos não proteicos na membrana do terceiro grupo. Em relação às cepas utilizadas, após o cultivo de cepas de Chlamydomonas reinhardtii, de acordo com o protocolo descrito, utilize soluções estoque de sacarose 2 M, beta-DM 10% em água e Tris 0,5 M, pH 8,0.

Para preparar as seguintes soluções para gradientes de densidade de sacarose, a fim de montar os gradientes utilizando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comece derramando lentamente um mililitro da solução 1,3 molar, seguido por um mililitro da solução 1,0 molar. Em seguida, adicione dois mililitros de cada uma das soluções 0,85, 0,7, 0,65 e, finalmente, a solução 0,4 molar. Armazene os gradientes durante a noite na câmara fria para induzir condições anaeróbicas.

Nas culturas de chlamydomonas, insira uma pipeta de vidro nos frascos de cultivo e borbulhe com Argonne por quatro horas com agitação contínua e iluminação para o isolamento de membranas do talo. Após a incubação, inicie pela centrifugação das células por cinco minutos a 2.500 ×g e quatro graus Celsius. Em seguida, re-suspenda os pellets celulares em 30 mililitros de tampão H um.

Repita a centrifugação e, novamente, ressuspenda. Suspenda as células no tampão H um para romper as células, passe-as por um nebulizador com uma pressão de nitrogênio de 1.500 pascals. Certifique-se de que a distância entre a esfera de cerâmica e o metal seja pequena o suficiente para que as células se rompam.

Em seguida, centrifugue as células por sete minutos a 2.500 ×g e 4 °C. O sobrenatante deve ser de cor verde claro. Se a ruptura celular foi bem-sucedida, ressuspenda as células em 50 mililitros de tampão H₂ e centrifugue-as por 10 minutos a 32.800 ×g e 4 °C.

Em seguida, após ressuspender as células em 10 mililitros de tampão H três, utilize um potter para homogeneizar a suspensão celular. A seguir, prepare gradientes de densidade de sacarose em cordão de tal. Inicie com 12 mililitros de células em tampão H três.

Em seguida, despeje lentamente uma camada de 12 mililitros de tampão H4 e finalize com 12 mililitros de tampão H5. Use H5 para equilibrar o rotor e centrifugue os gradientes por uma hora a 70.700 ×g. Remova as bandas de TH dos gradientes e utilize um volume apropriado de tampão H6 para diluí-las.

Centrifugue as células a 37.900 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Se o pellet não estiver compacto, adicione mais tampão H6 ao passo de centrifugação. Em seguida, reconstitua.

Suspenda os cordões tilacoides em um pequeno volume de tampão H seis para carregar um gradiente de densidade de sacarose em sistema fotográfico. Primeiro, calcule as quantidades de cordões tilacoides, beta DM e tampão H seis necessárias para cada gradiente. Seguindo estas orientações, cada gradiente conterá 0,8 miligramas por mililitro de clorofila em 0,9% beta DM e o tampão H seis elevará o volume final a 700 microlitros.

Para solubilizar os tilsos, prepare separadamente soluções de Eloqua com tilsacoides beta DM e tampão H seis para cada gradiente. Incube as amostras em gelo por 20 minutos, invertendo a cada poucos minutos para misturar. Após centrifugar as amostras a 14.000 vezes a gravidade por 10 minutos a quatro graus Celsius.

O pellet deve ser pequeno e esbranquiçado, e o sobrenadante será verde escuro. Carregue o sobrenadante sobre as graduações equilibradas com tampão H seis e ultracentrifugue a 134.470 ×g por 14 horas a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, tire fotos das graduações e, em seguida, fracione-as.

Use uma agulha para perfurar um orifício na parte inferior do tubo e colete as frações em tubos de 500 microlitros. Ou um processo em placa de 96 poços. As amostras para eletroforese em gel SDS-PAGE, digestão em gel e espectrometria de massa de acordo com o protocolo descrito no texto, conforme mostrado aqui, utilizando os resultados da fração seis da análise imunológica do sangue do tipo selvagem e da fração 13 do delta PS um.

As frações de pico de A e R um foram escolhidas para análise dos componentes do supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico nesta figura. As proporções relativas de proteínas são representadas como tipo selvagem sobre delta PS um, 14 N sobre 15 N, para diversas proteínas centrais e de captura de luz do PS um, bem como para proteínas atribuídas ao supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico. As diferenças na abundância de NR um e CAS nas frações seis e 13 de tipo selvagem e delta PS um sugerem que elas são componentes novos deste complexo. São apresentados aqui os resultados da comparação quantitativa deste supercomplexo do fluxo de elétrons cíclico entre o tipo selvagem e uma linhagem com deleção de PG L um. Curiosamente, HCF 1 36, citocromo B seis, subunidade quatro do citocromo B seis F e PET C parecem estar enriquecidos no tipo selvagem, enquanto FTSH dois, citocromo F e PET O parecem estar enriquecidos em PG L um.

Após assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como comparar a composição de complexos MultiPro em membranas líquidas di sob diferentes condições. Tenha em mente que, para o preparo bem-sucedido das membranas líquidas e o isolamento do fluxo eletrônico cíclico, a ruptura celular de supercomplexos, a homogeneização das células e a solubilização das membranas líquidas são etapas críticas. Além disso, os gradientes de densidade de sacarose precisam ser centrifugados por pelo menos 12 horas para se obter a separação completa dos complexos fotossintéticos.