Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em ¹⁵ N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

O objetivo geral deste procedimento é analisar comparativamente a composição dos complexos MultiPro nas membranas do cordão thal sob diferentes condições. Isso é feito isolando primeiro as membranas thal das células lamona expostas a condições anaeróbicas. Em seguida, as membranas do cordão são solubilizadas e fracionadas em um gradiente de densidade de sacarose.

Em seguida, volumes iguais das frações desejadas são misturados e separados na página SDS. Finalmente, as bandas coradas de kumasi são digeridas com tripsina. Por fim, as amostras são analisadas por espectrometria de massa quantitativa para observar mudanças na abundância de proteínas entre as frações investigadas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como estudos proteômicos quantitativos comparando uma quantidade definida de proteína, é que, em nossa abordagem, volumes iguais de amostras fracionadas são combinados e analisados. Isso permite estudar o comportamento de migração de proteínas dentro do gradiente e, além disso, analisar a composição de diferentes complexos não proteicos na membrana do terceiro grupo. Com relação às cepas aplicadas Após o cultivo de chlamydomonas rein hardy sceps, de acordo com o protocolo de texto, use soluções estoque de sacarose de dois molares, 10% beta MS em água e 0,5 molar trice pH 8,0.

Para preparar as seguintes soluções para gradientes de densidade de sacarose para configurar os gradientes usando tubos de centrífuga de 14 por 89 milímetros, comece despejando lentamente um mililitro de solução molar 1,3, seguido por um mililitro de solução molar 1,0. Em seguida, despeje dois mililitros de cada uma das soluções 0,85, 0,7, 0,65 e, finalmente, 0,4 molar. Armazene os gradientes durante a noite na câmara fria para induzir condições anaeróbicas.

Nas culturas de chlamydomonas, insira uma pipeta de vidro em frascos de cultura e borbulhe com Argonne por quatro horas com agitação contínua e iluminação para isolar as membranas do cordão thal. Após a incubação, comece peletizando as células por cinco minutos a 2.500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius. Em seguida, suspenda os grânulos de células em 30 mililitros de H um tampão.

Repita a centrifugação e novamente, resus. Suspenda as células em um tampão H para quebrá-las, passe-as por um nebulizador com uma pressão de nitrogênio de 1.500 Pascals. Certifique-se de que a distância entre a bola de cerâmica e o metal seja pequena o suficiente para que as células se quebrem.

Em seguida, gire as células por sete minutos a 2.500 vezes a gravidade e quatro graus Celsius. O sobrenadante deve ser de cor verde claro. Se a quebra celular for bem-sucedida, suspenda as células em 50 mililitros de tampão H dois e pelete-as por 10 minutos a 32.800 vezes a gravidade e quatro graus Celsius.

Então, depois de Resus suspender as células em 10 mililitros de tampão H três, use um oleiro para homogeneizar o palato ressuspenso. Em seguida, para preparar os gradientes de densidade de sacarose do cordão umbilical. Comece com 12 mililitros de células em H três tampão.

Em seguida, despeje lentamente uma camada de 12 mililitros de tampão H quatro e termine com 12 mililitros de tampão H cinco. Use H cinco para equilibrar o rotor e centrifugar os gradientes por uma hora a 70, 700 vezes a gravidade. Remova as bandas TH dos gradientes e use um volume apropriado de tampão H seis para diluí-las.

Gire para baixo as células a 37.900 vezes a gravidade por 20 minutos a quatro graus Celsius. Se o pellet não estiver apertado, adicione mais tampão H seis à etapa de centrifugação. Então resus.

Suspenda os cordões thal em um pequeno volume de buffer H seis para carregar um gradiente de densidade de sacarose do sistema fotográfico. Primeiro, calcule as quantidades de cordões thal, beta DM e H seis tampão necessários para cada gradiente. Seguindo essas diretrizes, cada gradiente conterá 0,8 miligramas por mililitro de clorofila em 0,9% beta MS e H seis Buffer elevará o volume final para 700 microlitros.

Para solubilizar o thys, prepare Eloqua separado com Thylakoids beta DM e H seis tampão para cada gradiente. Incube as amostras no gelo por 20 minutos e inverta a cada poucos minutos para misturar. Depois de centrifugar as amostras a 14.000 vezes a gravidade por 10 minutos e quatro graus Celsius.

O pellet deve ser pequeno e esbranquiçado, e o sobrenadante será verde escuro. Carregue o sobrenadante na balança de gradientes com H seis tampão e ultracentrífuga a 134, 470 vezes a gravidade por 14 horas e quatro graus Celsius. Após a rotação, tire fotos dos gradientes e fracione.

Use uma agulha para fazer um furo na parte inferior do tubo e coletar frações em tubos de 500 microlitros. Ou um processo de placa de 96 poços. As amostras para SDS paginam em digestão em gel e espectrometria de massa de acordo com o protocolo de texto mostrado aqui, usando os resultados da análise imunosanguínea fração seis do tipo selvagem e fração 13 do delta PS um.

As frações de pico de A e R um foram escolhidas para análise de componentes supercomplexos de fluxo de elétrons cíclicos nesta figura. Razões proteicas relativas representadas como tipo selvagem sobre delta PS um 14 N sobre 15 N para várias proteínas PS um núcleo e colheita leve de PS um, bem como para proteínas atribuídas com o supercomplexo de fluxo de elétrons cíclico são mostradas as diferenças em abundância de um NR e CAS na fração seis e 13 do tipo selvagem e delta PS um sugerem que eles são novos componentes deste complexo mostrado aqui estão os resultados para a comparação quantitativa deste supercomplexo de fluxo de elétrons cíclico entre o tipo selvagem e uma cepa PG L one knockout. Curiosamente, HCF 1 36, citocromo B seis, citocromo B seis subunidade F quatro e PET C parecem ser enriquecidos no tipo selvagem, enquanto FTSH dois, citocromo F e PET O parecem ser enriquecidos em PG L um.

Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão de como comparar a composição dos complexos MultiPro em di membranas líquidas sob diferentes condições. Lembre-se de que, para a preparação bem-sucedida das membranas líquidas e o isolamento do fluxo cíclico de elétrons, a ruptura celular supercomplexa, a olagem das células e a ização das membranas líquidas são as etapas críticas. Além disso, os gradientes de densidade de sacarose precisam ser centrifugados por pelo menos 12 horas para alcançar a separação completa dos complexos fotossintéticos.