Name: A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda a purificação de afinidade em tandem para isolar complexos proteicos de células eucarióticas com alta pureza. Este método permite identificar novos interagentes e modificações pós-traducionais reguladoras.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) do NIH sob o número de concessão R01AI114362 e pela concessão I-1782 da Fundação Welch a Iván D'Orso.

1. Células chapeamento <ol><li> Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente. NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai contar com os níveis de expressão e a solubilidade do complexo proteína de interesse. Alternativamente, se a purificação é necessária maior escala, as linhas celulares podem ser adaptadas para crescer em suspensão em frascos rotativos de 2, mas este método não funciona para transfecções transientes. </li></ol> 2. Indução de transfecção de células ou linhas celulares estáveis <ol><li> No dia seguinte, verifique as células ao microscópio. As células devem ser 70 - 80% confluentes antes de proceeding. </li><li> Transfectar as células com uma mistura total de 7 ug de ADN de plasmídeo e 21 uL de reagente de transfecção por placa de 100 mm. Transfectar as células com um vector que expressa GFP (Tabela 1) como um controlo para a eficiência da transfecção. NOTA: Se for utilizada uma linha celular estável semelhante HEK293-T-REX ou que induz a expressão de dois ou mais complexos subunidades em resposta à doxiciclina 14, 15, o indutor terá de ser adicionado às células e incubado durante 48 h. Do mesmo modo, uma linha celular estável que induz a expressão de GFP após a adição do indutor também seria necessária para fins de validação. Avance para o passo 2.7. </li><li> Preparar a mistura de transfecção por placa de 100 mm. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 500 ul de DMEM suplementada com 7 ug de ADN plasmídeo total (correspondendo a dois ou mais plasmídeos). Num tubo de microcentrífuga separado, misturar 500 ul de DMEM sem suplementos with 21 ul de reagente de transfecção. Repita para cada reacção de transfecção. </li><li> Pipetar a solução de reagente de transfecção para a solução de DNA de plasmídeo (não misturar soluções na ordem inversa). Misturar por pipetagem de pelo menos 4 vezes. </li><li> Incubar esta mistura à temperatura ambiente durante 10 - 15 minutos, mas não mais do que 15 min. </li><li> Inclinar a placa para criar um reservatório de meios de comunicação e cuidadosamente pipetar a mistura de transfecção gota a gota, sobre o lado interior da placa, sem perturbar as células. Devolver o prato à sua posição original plana e homogeneizar suavemente para distribuir a mistura. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de célula humidif içada com 5% de CO 2 (esta condição é a seguir referido como &quot;tecido incubadora de cultura&quot;). Substitua a mídia 5 horas após a transfecção (opcional). </li></ol> 3. A transfecção corrente ou Eficiência Indução <ol><li> Às 24 h pós-transfecção, visualizar as células sob uma gripemicroscópio orescent para verificar a eficiência de transfecção (ou indução de linha de células estável controle HEK293T-Rex expressando GFP). Incubar por mais 24 horas. </li></ol> 4. Purificação de Afinidade STREP (STREP AP) <ol><li> Recolher as células <ol><li> Em 48 horas após a transfecção, remova a mídia e adicionar 8 ml de solução salina 1x frio fosfato tamponada (PBS). Pipeta-se para baixo e para separar as células a partir da placa. </li><li> Recolha e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a células para baixo a 800 * g durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante de PBS. Repetir a rotação para baixo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar qualquer PBS residual. Armazenar o sedimento de células a -80 ° C para uso futuro ou siga o procedimento a seguir para continuar a purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Lisar as células <ol><li> Ressuspender as peletes de células utilizando 5 x o volume de sedimento de células (~ 250 mL por placa) de Passive Lysis Buffer(PLB: Tris-HCl 20 pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, protease de cocktail inibidor de comprimido, 5% v / v de glicerol, e 1,0% de NP-40) e transferir a suspensão de células para uma 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Resumidamente vortex a suspensão e nutar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Girar a suspensão de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transfira os lisados ​​solúveis para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e descartar os sedimentos celulares. Guardar a 10% do volume final do lisado solúvel como &quot;entrada STREP AP.&quot; Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrando as contas STREP NOTA: Use STREP esferas para o primeiro passo AP! Complexos puxado para baixo com contas STREP recuperar significativamente mais proteína do que as puxou para baixo com contas de bandeira. <ol><li> Retire (N × 40 ul) + N ul da suspensão STREP talão 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Use de toda a mdicas outhed a esferas de pipeta. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de PLB às pérolas. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. <ol><li> Repetir para um total de 3 lavagens. Ressuspender as esferas em PLB para um volume final de 40 ul N ×. </li></ol></li><li> Adicionar 40 ul de 50% de pasta STREP talão para cada amostra de ligado celular e nutar durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Spin down solução a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e armazenar como &quot;STREP-AP por meio de fluxo (FT)&quot; a 4 ° C. </li><li> Adicionar 500 ul de Tampão de Lavagem STREP AP I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, 5% de glicerol e 0,2% de NP-40) para os grânulos. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. <ol><li> Repetir para um total de 4 lavagens. <br/&gt; NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo de proteína. Este passo é essencial. </li></ol></li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lavagem II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, e EDTA 1 mM) e equilibrar as contas por inversão dos tubos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Eluir a proteína de interesse com 50 ul de tampão de eluição STREP (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM e). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Girar as esferas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante. Esta fracção corresponde à amostra &quot;A eluição STREP AP&quot;. </li><li> Guardar a fracção de esferas, a 4 ° C durante uma segunda eluição, que pode produzir-se a metade da quantidade de proteína obtida com a primeira eluição. Alíquota de 10% do AP STREP eluição por coloração com prata e / ou transferência de western16. </li></ol></li><li> Equilibrando as contas BANDEIRA <ol><li> Retire (nx 16 ul) + n ul de solução de esferas de FLAG (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Use dicas de boca larga a contas pipeta. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de tampão de lavagem FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, e 0,1% de NP-40) para os grânulos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 3 lavagens. </li><li> Ressuspender as pérolas em tampão de lavagem FLAG para um volume final de 16 ul NX. </li><li> Adicionar 16 ul da suspensão FLAG grânulo para o restante eluição STREP AP e durante a noite a 4 ° nutar C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Spin down a suspensão esferas BANDEIRA a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante e armazenar como a &quot;bandeira IP Flow-through&quot; (FT) a 4 ° C. </li><li> Adicionar 50081; l de tampão de lavagem FLAG para a solução. Nutar durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 4 lavagens e remover o sobrenadante depois de cada lavagem. NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de proteína de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo. Este passo é essencial. </li><li> Retirar o sobrenadante do centrifugação final e adicionar 30 uL de tampão de lavagem FLAG contendo 200 ng / mL de péptido FLAG nas pérolas. Vortex a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Girar a suspensão a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Colher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C como o &quot;BANDEIRA IP eluição.&quot; NOTA: As amostras de eluição pode ser confirmada por coloração de prata e / ou transferência de Western utilizando protocolos padrão de 16, e está pronto para mais ensaios de proteína. Ao configurar um western blot, execute todas as seguintes amostras: (1) STREP AP entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) BANDEIRA IP FT, e (5) BANDEIRA IP eluição. Volumes carregados terá de ser determinado para cada experimento. Todas as amostras recolhidas e contas podem ser armazenadas a 4 ° C para armazenagem a curto prazo e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Amostras de TAP podem ser analisados por espectrometria de massa para verificar a identidade dos seus componentes, para identificar novas modificações pós-traducionais (PTMs), e / ou para descobrir qualquer interacção nova proteína com o complexo purificado 2, 17. Para este efeito, após a execução de um gel de mancha de Coomassie ou prata, as bandas podem ser excisadas a partir do gel utilizando um bisturi limpa. Vários excelentes comentários que discutem métodos de espectrometria de massa foram publicados anteriormente 18, 19. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta significativamente o rendi...

<html> Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos 1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função 2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio 3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cerevisiae. Para além da sua utilidade notável para a descoberta de IPP, o ensaio Y2H pode ser utilizado para caracterizar pares de proteínas em células de levedura, que define o mínimo de domínios interactuantes, e a identificação de mutações que abolem essas interacções. Ao modificar o ensaio Y2H, IPP também pode ser estudado em células de mamíferoclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variações do ensaio Y2H (por exemplo, sistema de levedura de três híbridos) também pode ser aplicada ao estudo de proteínas e de ARN-ligante orgânico proteína-pequeno em células. Outra ferramenta utilizada para estudar os IPP num sistema homólogo é o ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) 5. Ao utilizar um anticorpo para imunoprecipitar uma proteína de interesse, o ensaio de co-IP permite aos investigadores monitorar IPP em células para diferentes condições ambientais e experimentais situações. A utilização de proteínas marcadas no epitopo (por exemplo, FLAG, Myc, estreptococos e HA, entre outros), a purificação por afinidade (AP) métodos facilitou o isolamento de proteínas a partir de misturas complexas de proteínas para vários ensaios a jusante, incluindo Western blot, coloração de prata , e análise enzimática. No entanto, nenhuma destas abordagens anteriores permitem o isolamento de grandes quantidades de complexos de proteínas para caracterização adicional in vitro incluindo umssays, descoberta de subunidades reguladoras por espectrometria de massa, e a identificação de modificações pós-traducionais. Uma versão melhorada do método de AP AP é chamado tandem (TAP), que é uma técnica de purificação para o estudo de IPP através da criação de uma proteína de fusão com dois epitopos que se purifica por meio de dois pontos de acesso subsequentes 6, 7. Neste artigo, apresentamos uma variação do método TAP para complexos de proteína de purificação em que duas subunidades são marcadas com epítopos diferentes e depois purificado através de dois APs sequenciais (STREP AP seguido por FLAG IP). Em primeiro lugar, proporcionar uma visão minimalista da TAP (Figura 1) e, em seguida, uma descrição detalhada de todas as etapas experimentais (Figura 2), de modo que os investigadores possam aplicá-las a seu complexo de proteína de interesse. Para demonstrar a aplicabilidade do método de TAP, nós escolhemos um bem caracterizado ciclina-CDK complexa (referido como PTEFB quinase), que é composta da subunidade reguladora da ciclina T1 (CycT1) e uma cinase (CDK9), e está envolvido na regulação da transcrição por ARN-polimerase II (pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila o domínio C-terminal de pol II e os seus associados factores de alongamento negativos, o que alivia a pausa da transcrição no promotor e facilita assim a transcrição de alongamento 11, 12, 13. Com essa interação conhecida em mente, STREP-marcado CycT1 e CDK9 marcado com FLAG foram mais expressos em células HEK293T. Uma experiência recíproca TAP foi realizada com CDK9 marcaram-STREP e marcado com FLAG CycT1 para validar ainda mais que a interacção da proteína é independente dos epítopos utilizados. As células foram recolhidas e lisadas 48 h após a transfecção. O ligado solúvel foi purificado por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada e proteínas purificadas foram analisadas por Western blot e por coloração com prata (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal</td><td>bovino GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eluição STREP-tag</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &vezes; 20 mm estilo de cultura de células de poliestireno não pirogênico tratado 20/manga</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Digital de Vórtice</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Rack de espuma de tubo micro de 48 furos</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Labquake rotisserie&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td>Rolamento 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

a purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.

Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase). Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9: F ou ...

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

O objetivo geral deste método de purificação por afinidade em tandem é isolar complexos proteicos expressos em células eucarióticas para caracterização bioquímica e montagem molecular, além da identificação de novos interatores e modificações pós-traducionais que regulam sua função. Este método permite a purificação de complexos proteicos intactos a partir de células eucarióticas, visando identificar novos interatores e modificações pós-traducionais regulatórias que ajustam finamente sua função. A principal vantagem desta técnica é que ela possibilita alta pureza e rendimento de complexos proteicos para aplicações downstream in vitro, a fim de estudar sua função e atividade.As células são coletadas a partir da purificação por afinidade com STREP 48 horas após a transfeção. Remova o meio e adicione oito mililitros de PBS frio. Pipete para cima e para baixo para destacar as células da placa.Colete e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 800 ×g durante quatro minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante de PBS. Centrifugue novamente a 800 ×g durante um minuto a quatro graus Celsius para eliminar qualquer resíduo de PBS.Para ini

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Tandem purificação por afinidade é uma abordagem robusta para a identificação de parceiros de ligação às proteínas. Como prova de conceito, este método foi aplicado ao bem caracterizado eIF4E factor de iniciação da tradução para o co-precipitado os factores de células hospedeiras envolvido na iniciação da tradução. Este método é facilmente adaptado a qualquer proteína celular ou virai.

Identificação de parceiros de proteína Interagir utilizando Tandem purificação por afinidade

A purificação por afinidade das proteínas marcadas em combinação com espectrometria de massa (STDA) é um método poderoso para o mapeamento sistemático de redes de interacção de proteínas e para a investigação do mecanismo de base de processos biológicos. Aqui, descrevemos um otimizado seqüencial peptídeo afinidade (SPA) APMS procedimento desenvolvido para a...

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Ensaio de purificação de afinidade em tandem para estudar interações proteína-proteína

Complexos proteína de catalisar as funções celulares importantes. Caracterização estrutural e funcional detalhada de muitos complexos essenciais exige a produção recombinante. MultiBac é um sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para a expressão de proteínas eucarióticas e seus complexos. MultiBac foi implementado como uma plataforma de acesso aberto, e procedimentos operacionais padrão desenvolvidos para maximizar a sua utilidade.

A Plataforma de Produção de Proteína Complexo MultiBac no EMBL

Drosophila é famoso por sua poderosa manipulação genética, mas não para a sua adequação de análises bioquímicas em profundidade. Aqui apresentamos um procedimento baseado em TAP para identificar interagindo parceiros de qualquer proteína de interesse a partir do cérebro da mosca. Este procedimento pode potencialmente levar a novos caminhos de pesquisa.

Identificando interacção proteína-proteína em<em&gt; Drosophila</em&gt; Chefes Adulto por Tandem Affinity Purification (TAP)

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.

Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira

Este artigo fornece um procedimento para a purificação de afinidade de uma proteína recombinante humana, a endonuclease 1 (FEN1), que foi marcada com uma marca de 6X-histidina. O protocolo envolve a utilização de duas colunas distintas de íons metálicos imobilizados para a purificação da proteína marcada.

Purificação de afinidade de uma proteína marcada com 6X-His usando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida 

Aprenda a purificação de afinidade em tandem para isolar complexos proteicos de células eucarióticas com alta pureza. Este método permite identificar novos interagentes e modificações pós-traducionais reguladoras.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Explorar mais vídeos