A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

O objetivo geral deste método de purificação por afinidade em tandem é isolar complexos proteicos expressos de células eucarióticas para caracterização bioquímica e montagens moleculares e identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função. Este método possibilita a purificação de complexos proteicos intactos de células eucarióticas, para identificar novos interagentes e modificações regulatórias pós-traducionais que ajustam sua função. A principal vantagem desta técnica é que ela permite alta pureza e rendimento de complexos proteicos para aplicações in vitro a jusante para estudar sua função e atividade.

As células são coletadas da purificação de afinidade STREP 48 horas após a transfecção. Remova a mídia e adicione oito mililitros de PBS frio. Pipete para cima e para baixo para separar as células da placa.

Colete e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e gire as células a 800 vezes g por quatro minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante PBS. Gire para baixo a 800 vezes g por um minuto a quatro graus Celsius para eliminar qualquer PBS residual.

Para iniciar este procedimento, ressuspenda cada pellet celular em cinco vezes o volume do pellet celular do tampão de lise passiva, ou PLB. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Breve vórtice da suspensão e nutate por 30 minutos a quatro graus Celsius.

Gire para baixo a suspensão celular a 10.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o lisado solúvel para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e descarte o pellet celular. Economize 10% do volume final do lisado solúvel como entrada STREP-AP e armazene-o a quatro graus Celsius.

É importante usar grânulos STREP para a primeira etapa de purificação de afinidade porque os complexos puxados para baixo com grânulos STREP recuperam significativamente mais proteína do que aqueles puxados para baixo com os grânulos FLAG. Usando uma ponta de pipeta de boca larga, remova a quantidade apropriada de pasta de esferas 50% STREP para a purificação de afinidade. Gire para baixo a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.

Remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de PLB aos grânulos. Nute a mistura de contas por cinco minutos a quatro graus Celsius. Gire para baixo novamente.

Após a terceira lavagem, remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos em PLB até um volume final de n vezes 40 microlitros, em que n é o número de amostras. Adicione 40 microlitros de pasta de esferas 50% STREP a cada amostra de lisado celular e nutato por duas horas a quatro graus Celsius. Durante esta produção e recuperação de proteínas, várias placas de células podem ser usadas, e as mesmas amostras de proteínas lisadas de diferentes placas podem ser combinadas com uma porção de grânulos durante a purificação da afinidade STREP.

Depois que as misturas de lisado celular e pasta de grânulos STREP forem incubadas por duas horas, gire-as a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Salve o sobrenadante enquanto o STREP AP flui e armazene a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem STREP AP um aos grânulos.

Nute as esferas na mistura tampão por cinco minutos a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de tampão de lavagem STREP AP um. Após a terceira lavagem, transfira a solução de esferas para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para reduzir o fundo proteico.

Lave uma quarta vez com o tampão de lavagem STREP AP um. Após a centrifugação, retire o sobrenadante e adicione 500 microlitros de manteiga de lavagem dois. Equilibre as contas invertendo os tubos e depois gire para baixo a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante. Eluir a proteína de interesse com 50 microlitros de tampão de eluição STREP. Vórtice a 800 rpm por 15 minutos a quatro graus Celsius.

Gire as contas a 1.500 vezes g por um minuto a quatro graus Celsius. Colete o sobrenadante. Esta fração corresponde à amostra de eluição STREP AP.

Guarde a fração de grânulos a quatro graus Celsius para uma segunda eluição. Alíquota 10% da eluição STREP AP para coloração de prata e/ou Western blotting. Para aumentar a quantidade de material de partida para a imunoprecipitação FLAG subsequente, a primeira e a segunda eluições STREP podem ser agrupadas para uma recuperação mais eficiente da eluição FLAG.

Comece este procedimento usando uma ponta de pipeta de boca larga para transferir a quantidade apropriada de solução de esferas FLAG para um tubo de microcentrífuga. Gire para baixo a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG aos grânulos.

Gire para baixo a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e lavar novamente com tampão de lavagem FLAG. Após a terceira lavagem, remover o sobrenadante e ressuspender os grânulos no tampão de lavagem FLAG até um volume final de n vezes 16 microlitros, em que n é o número de amostras.

Adicione 16 microlitros da pasta de esferas FLAG à eluição STREP AP restante e nutate durante a noite a quatro graus Celsius. Após uma incubação noturna da pasta de esferas FLAG e eluição STREP AP, prossiga com a imunoprecipitação FLAG. Gire a suspensão do talão FLAG a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.

Salve o sobrenadante enquanto o FLAG IP flui e armazene a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG aos grânulos. Nutate por cinco minutos a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.

Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG. Após a terceira lavagem, transfira a solução de esferas de proteína para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para reduzir o fundo. Lave uma quarta vez com o tampão de lavagem FLAG.

Remova o sobrenadante da centrifugação final e adicione aos grânulos 30 microlitros de tampão de lavagem FLAG contendo 200 nanogramas por microlitro de peptídeo FLAG. Vórtice a 800 rpm por duas horas a quatro graus Celsius. Após duas horas, gire a suspensão a 1.500 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.

Colher o sobrenadante e conservar a quatro graus Celsius como eluição FLAG IP. Neste vídeo, a purificação de afinidade Tandem, ou método TAP, foi aplicada ao complexo Cyclin-T1 CDK9. A ciclina-T1 marcada com STREP e a CKD9 marcada com FLAG foram superexpressas em células T HEK293.

Um experimento recíproco também foi realizado com STREP marcado com CDK9 e FLAG marcado com Cyclin-T1. A análise de Western blot mostra que FLAG marcou CKD9 coeluído com STREP marcou Cyclin-T1 dos grânulos STREP, mas não no controle negativo, AP sem STREP marcou Cyclin-T1. Ambas as proteínas foram detectadas na eluição FLAG, o que confirmou ainda mais a formação do complexo.

Os resultados recíprocos do TAP mostram que a ciclina-T1 marcada com FLAG coeluída com a CDK9 marcada com STREP, validando ainda mais que a interação ciclina-T1 CDK9 é independente dos epítopos utilizados. Os resultados do TAP e do TAP recíproco também foram analisados por coloração de prata. Os asteriscos indicam impurezas coeluídas.

FLAG marcado com CKD9 coeluído com STREP marcado com Cyclin-T1 fora dos grânulos STREP, mas não do controle AP.In eluição FLAG subsequente, STREP marcado com Cyclin-T1 coeluído com FLAG marcado com CDK9 fora dos grânulos FLAG. Da mesma forma, o FLAG marcou Cyclin-T1 coeluído com o STREP marcou CDK9 fora dos grânulos STREP, mas não do AP de controle. E o complexo proteína-proteína foi recuperado de forma eficiente após a segunda etapa do FLAG IP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em dois dias, começando quando as células estiverem prontas para serem coletadas, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de aumentar o número de placas celulares por experimento de acordo para garantir que proteína suficiente possa ser recuperada e detectada. Por exemplo, identificar as novas subunidades regulatórias e/ou estudar as modificações pós-traducionais em subunidades complexas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam interações proteína-proteína explorarem novos interagentes e modificações pós-traducionais em células eucarióticas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e caracterizar proteínas usando as tags STREP e FLAG.