Name: A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda a purificação de afinidade em tandem para isolar complexos proteicos de células eucarióticas com alta pureza. Este método permite identificar novos interagentes e modificações pós-traducionais reguladoras.

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A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (NIAID) do NIH sob o número de concessão R01AI114362 e pela concessão I-1782 da Fundação Welch a Iván D'Orso.

1. Células chapeamento <ol><li> Um dia antes da transfecção, placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T em 10 ml de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal de bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml estoque) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm pratos por experiência / condição para garantir a recuperação de proteína suficiente. NOTA: O número de placas tem que ser determinada para cada experiência / condição, que vai contar com os níveis de expressão e a solubilidade do complexo proteína de interesse. Alternativamente, se a purificação é necessária maior escala, as linhas celulares podem ser adaptadas para crescer em suspensão em frascos rotativos de 2, mas este método não funciona para transfecções transientes. </li></ol> 2. Indução de transfecção de células ou linhas celulares estáveis <ol><li> No dia seguinte, verifique as células ao microscópio. As células devem ser 70 - 80% confluentes antes de proceeding. </li><li> Transfectar as células com uma mistura total de 7 ug de ADN de plasmídeo e 21 uL de reagente de transfecção por placa de 100 mm. Transfectar as células com um vector que expressa GFP (Tabela 1) como um controlo para a eficiência da transfecção. NOTA: Se for utilizada uma linha celular estável semelhante HEK293-T-REX ou que induz a expressão de dois ou mais complexos subunidades em resposta à doxiciclina 14, 15, o indutor terá de ser adicionado às células e incubado durante 48 h. Do mesmo modo, uma linha celular estável que induz a expressão de GFP após a adição do indutor também seria necessária para fins de validação. Avance para o passo 2.7. </li><li> Preparar a mistura de transfecção por placa de 100 mm. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 500 ul de DMEM suplementada com 7 ug de ADN plasmídeo total (correspondendo a dois ou mais plasmídeos). Num tubo de microcentrífuga separado, misturar 500 ul de DMEM sem suplementos with 21 ul de reagente de transfecção. Repita para cada reacção de transfecção. </li><li> Pipetar a solução de reagente de transfecção para a solução de DNA de plasmídeo (não misturar soluções na ordem inversa). Misturar por pipetagem de pelo menos 4 vezes. </li><li> Incubar esta mistura à temperatura ambiente durante 10 - 15 minutos, mas não mais do que 15 min. </li><li> Inclinar a placa para criar um reservatório de meios de comunicação e cuidadosamente pipetar a mistura de transfecção gota a gota, sobre o lado interior da placa, sem perturbar as células. Devolver o prato à sua posição original plana e homogeneizar suavemente para distribuir a mistura. </li><li> Incubar as células a 37 ° C numa incubadora de cultura de célula humidif içada com 5% de CO 2 (esta condição é a seguir referido como &quot;tecido incubadora de cultura&quot;). Substitua a mídia 5 horas após a transfecção (opcional). </li></ol> 3. A transfecção corrente ou Eficiência Indução <ol><li> Às 24 h pós-transfecção, visualizar as células sob uma gripemicroscópio orescent para verificar a eficiência de transfecção (ou indução de linha de células estável controle HEK293T-Rex expressando GFP). Incubar por mais 24 horas. </li></ol> 4. Purificação de Afinidade STREP (STREP AP) <ol><li> Recolher as células <ol><li> Em 48 horas após a transfecção, remova a mídia e adicionar 8 ml de solução salina 1x frio fosfato tamponada (PBS). Pipeta-se para baixo e para separar as células a partir da placa. </li><li> Recolha e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar a células para baixo a 800 * g durante 4 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante de PBS. Repetir a rotação para baixo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar qualquer PBS residual. Armazenar o sedimento de células a -80 ° C para uso futuro ou siga o procedimento a seguir para continuar a purificação de proteínas. </li></ol></li><li> Lisar as células <ol><li> Ressuspender as peletes de células utilizando 5 x o volume de sedimento de células (~ 250 mL por placa) de Passive Lysis Buffer(PLB: Tris-HCl 20 pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, protease de cocktail inibidor de comprimido, 5% v / v de glicerol, e 1,0% de NP-40) e transferir a suspensão de células para uma 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Resumidamente vortex a suspensão e nutar durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Girar a suspensão de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transfira os lisados ​​solúveis para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e descartar os sedimentos celulares. Guardar a 10% do volume final do lisado solúvel como &quot;entrada STREP AP.&quot; Armazenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrando as contas STREP NOTA: Use STREP esferas para o primeiro passo AP! Complexos puxado para baixo com contas STREP recuperar significativamente mais proteína do que as puxou para baixo com contas de bandeira. <ol><li> Retire (N × 40 ul) + N ul da suspensão STREP talão 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Use de toda a mdicas outhed a esferas de pipeta. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de PLB às pérolas. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. <ol><li> Repetir para um total de 3 lavagens. Ressuspender as esferas em PLB para um volume final de 40 ul N ×. </li></ol></li><li> Adicionar 40 ul de 50% de pasta STREP talão para cada amostra de ligado celular e nutar durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Spin down solução a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Remover o sobrenadante e armazenar como &quot;STREP-AP por meio de fluxo (FT)&quot; a 4 ° C. </li><li> Adicionar 500 ul de Tampão de Lavagem STREP AP I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, MgCl2 1,5 mM, DTT 1 mM, 5% de glicerol e 0,2% de NP-40) para os grânulos. Nutar a mistura grânulos durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. <ol><li> Repetir para um total de 4 lavagens. <br/&gt; NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo de proteína. Este passo é essencial. </li></ol></li><li> Adicionar 500 ul de tampão de lavagem II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, e EDTA 1 mM) e equilibrar as contas por inversão dos tubos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante. </li><li> Eluir a proteína de interesse com 50 ul de tampão de eluição STREP (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, destiobiotina 2,5 mM e). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Girar as esferas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recolhe-se o sobrenadante. Esta fracção corresponde à amostra &quot;A eluição STREP AP&quot;. </li><li> Guardar a fracção de esferas, a 4 ° C durante uma segunda eluição, que pode produzir-se a metade da quantidade de proteína obtida com a primeira eluição. Alíquota de 10% do AP STREP eluição por coloração com prata e / ou transferência de western16. </li></ol></li><li> Equilibrando as contas BANDEIRA <ol><li> Retire (nx 16 ul) + n ul de solução de esferas de FLAG (n = número de amostras) e girar a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Use dicas de boca larga a contas pipeta. </li><li> Remover o sobrenadante e adicionar 500 mL de tampão de lavagem FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, e 0,1% de NP-40) para os grânulos. Girar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 3 lavagens. </li><li> Ressuspender as pérolas em tampão de lavagem FLAG para um volume final de 16 ul NX. </li><li> Adicionar 16 ul da suspensão FLAG grânulo para o restante eluição STREP AP e durante a noite a 4 ° nutar C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Spin down a suspensão esferas BANDEIRA a 1.500 g durante 2 min a 4 ° C. Salve o sobrenadante e armazenar como a &quot;bandeira IP Flow-through&quot; (FT) a 4 ° C. </li><li> Adicionar 50081; l de tampão de lavagem FLAG para a solução. Nutar durante 5 min a 4 ° C e centrifugação a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repetir para um total de 4 lavagens e remover o sobrenadante depois de cada lavagem. NOTA: Antes da quarta lavagem, transferir a solução de proteína de grânulos para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5 ml para reduzir o fundo. Este passo é essencial. </li><li> Retirar o sobrenadante do centrifugação final e adicionar 30 uL de tampão de lavagem FLAG contendo 200 ng / mL de péptido FLAG nas pérolas. Vortex a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Girar a suspensão a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Colher o sobrenadante e armazenar a 4 ° C como o &quot;BANDEIRA IP eluição.&quot; NOTA: As amostras de eluição pode ser confirmada por coloração de prata e / ou transferência de Western utilizando protocolos padrão de 16, e está pronto para mais ensaios de proteína. Ao configurar um western blot, execute todas as seguintes amostras: (1) STREP AP entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) BANDEIRA IP FT, e (5) BANDEIRA IP eluição. Volumes carregados terá de ser determinado para cada experimento. Todas as amostras recolhidas e contas podem ser armazenadas a 4 ° C para armazenagem a curto prazo e a -80 ° C para armazenamento a longo prazo. Amostras de TAP podem ser analisados por espectrometria de massa para verificar a identidade dos seus componentes, para identificar novas modificações pós-traducionais (PTMs), e / ou para descobrir qualquer interacção nova proteína com o complexo purificado 2, 17. Para este efeito, após a execução de um gel de mancha de Coomassie ou prata, as bandas podem ser excisadas a partir do gel utilizando um bisturi limpa. Vários excelentes comentários que discutem métodos de espectrometria de massa foram publicados anteriormente 18, 19. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
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<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
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<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O protocolo aqui descrito para a expressão e o isolamento de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas não se limita à caracterização bioquímica de tais conjuntos moleculares, mas também pode ser utilizado para a identificação de novos interactores e modificações pós-traducionais que poderia regular a sua função. A utilização de etiquetas de afinidade não se restringe ao que é mencionado neste protocolo; mas a experiência sugere que o uso de STREP como o primeiro passo AP aumenta significativamente o rendi...

<html> Interações proteína-proteína (IBP) são fundamentais para a regulação precisa de processos biológicos 1, e mais estudos sobre estas PPIs poder informar sobre a sua função 2. Várias abordagens têm sido desenvolvidos para o estudo e caracterização de IPP, bem como para a identificação de novo de novos componentes de proteínas reguladoras. Em 1989, Stanley Campos e colegas relataram a levedura de dois híbridos (Y2H) ensaio 3. Esta abordagem permite a identificação imparcial e abrangente de interactianos (de caçar) para uma proteína definida de interesse (isca) em Saccharomyces cerevisiae. Para além da sua utilidade notável para a descoberta de IPP, o ensaio Y2H pode ser utilizado para caracterizar pares de proteínas em células de levedura, que define o mínimo de domínios interactuantes, e a identificação de mutações que abolem essas interacções. Ao modificar o ensaio Y2H, IPP também pode ser estudado em células de mamíferoclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Variações do ensaio Y2H (por exemplo, sistema de levedura de três híbridos) também pode ser aplicada ao estudo de proteínas e de ARN-ligante orgânico proteína-pequeno em células. Outra ferramenta utilizada para estudar os IPP num sistema homólogo é o ensaio de co-imunoprecipitação (co-IP) 5. Ao utilizar um anticorpo para imunoprecipitar uma proteína de interesse, o ensaio de co-IP permite aos investigadores monitorar IPP em células para diferentes condições ambientais e experimentais situações. A utilização de proteínas marcadas no epitopo (por exemplo, FLAG, Myc, estreptococos e HA, entre outros), a purificação por afinidade (AP) métodos facilitou o isolamento de proteínas a partir de misturas complexas de proteínas para vários ensaios a jusante, incluindo Western blot, coloração de prata , e análise enzimática. No entanto, nenhuma destas abordagens anteriores permitem o isolamento de grandes quantidades de complexos de proteínas para caracterização adicional in vitro incluindo umssays, descoberta de subunidades reguladoras por espectrometria de massa, e a identificação de modificações pós-traducionais. Uma versão melhorada do método de AP AP é chamado tandem (TAP), que é uma técnica de purificação para o estudo de IPP através da criação de uma proteína de fusão com dois epitopos que se purifica por meio de dois pontos de acesso subsequentes 6, 7. Neste artigo, apresentamos uma variação do método TAP para complexos de proteína de purificação em que duas subunidades são marcadas com epítopos diferentes e depois purificado através de dois APs sequenciais (STREP AP seguido por FLAG IP). Em primeiro lugar, proporcionar uma visão minimalista da TAP (Figura 1) e, em seguida, uma descrição detalhada de todas as etapas experimentais (Figura 2), de modo que os investigadores possam aplicá-las a seu complexo de proteína de interesse. Para demonstrar a aplicabilidade do método de TAP, nós escolhemos um bem caracterizado ciclina-CDK complexa (referido como PTEFB quinase), que é composta da subunidade reguladora da ciclina T1 (CycT1) e uma cinase (CDK9), e está envolvido na regulação da transcrição por ARN-polimerase II (pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila o domínio C-terminal de pol II e os seus associados factores de alongamento negativos, o que alivia a pausa da transcrição no promotor e facilita assim a transcrição de alongamento 11, 12, 13. Com essa interação conhecida em mente, STREP-marcado CycT1 e CDK9 marcado com FLAG foram mais expressos em células HEK293T. Uma experiência recíproca TAP foi realizada com CDK9 marcaram-STREP e marcado com FLAG CycT1 para validar ainda mais que a interacção da proteína é independente dos epítopos utilizados. As células foram recolhidas e lisadas 48 h após a transfecção. O ligado solúvel foi purificado por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada e proteínas purificadas foram analisadas por Western blot e por coloração com prata (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal</td><td>bovino GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de eluição STREP-tag</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &vezes; 20 mm estilo de cultura de células de poliestireno não pirogênico tratado 20/manga</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Misturador Digital de Vórtice</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Rack de espuma de tubo micro de 48 furos</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Agitador Labquake rotisserie&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td>Rolamento 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

a purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

A purificação dos complexos de ácido nucleico de proteína-proteína-proteína activa e é essencial para a caracterização das actividades enzimáticas e de identificação de novo de novas subunidades e as modificações pós-traducionais. sistemas bacterianos para permitir a expressão e purificação de uma grande variedade de polipéptidos simples e complexos de proteínas. No entanto, este sistema não permite a purificação de subunidades proteicas que contêm modificações pós-translacionais (por exemplo, fosforilação e acetilação), e a identificação de novas subunidades reguladoras que estão apenas presentes / expressas no sistema eucariota. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um romance, robusta e eficiente método de purificação de afinidade em tandem (TAP), utilizando Streptomyces e proteínas marcada com Flag que facilita a purificação de complexos de proteínas com proteínas marcadas no epitopo transiente ou estavelmente expresso a partir de células eucarióticas. Este protocolo pode ser aplicado para caracterizar Protein funcionalidade complexa, para descobrir modificações pós-translacionais sobre subunidades complexas, e para identificar novos componentes complexos de regulação por espectrometria de massa. Notavelmente, este método TAP pode ser aplicado para estudar complexos proteicos formados por componentes eucarióticas ou patogénicos (viral e bacteriana), obtendo-se assim uma grande variedade de oportunidades experimentais jusante. Propomos que os investigadores que trabalham com complexos de proteína poderia utilizar esta abordagem de muitas maneiras diferentes.

Neste artigo, demonstrar a aplicabilidade do método de TAP para o bem caracterizado CycT1-CDK9 complexo (também conhecida como P-TEFb quinase). Os plasmídeos que codificam ciclina T1-STREP (CycT1: S) e CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) e ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabela 1), foram transfectados em células HEK293T . Os controlos negativos incluíram as transfecções com um vector vazio e o CDK9: F ou ...

Descrevemos aqui um método novo, robusto e eficiente de purificação por afinidade em tandem (TAP) para a expressão, isolamento e caracterização de complexos proteicos de células eucarióticas. Este protocolo pode ser utilizado para a caracterização bioquímica de complexos discretos, bem como a identificação de novos interagentes e modificações pós-traducionais que regulam sua função.

A purificação de afinidade em tandem de complexos de proteínas a partir de células eucarióticas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

O objetivo geral deste método de purificação por afinidade em tandem é isolar complexos proteicos expressos em células eucarióticas para caracterização bioquímica e montagem molecular, além da identificação de novos interatores e modificações pós-traducionais que regulam sua função. Este método permite a purificação de complexos proteicos intactos a partir de células eucarióticas, visando identificar novos interatores e modificações pós-traducionais regulatórias que ajustam finamente sua função. A principal vantagem desta técnica é que ela possibilita alta pureza e rendimento de complexos proteicos para aplicações downstream in vitro, a fim de estudar sua função e atividade.As células são coletadas a partir da purificação por afinidade com STREP 48 horas após a transfeção. Remova o meio e adicione oito mililitros de PBS frio. Pipete para cima e para baixo para destacar as células da placa.Colete e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros e centrifugue as células a 800 ×g durante quatro minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante de PBS. Centrifugue novamente a 800 ×g durante um minuto a quatro graus Celsius para eliminar qualquer resíduo de PBS.Para iniciar este procedimento, re-suspenda cada pellet celular em cinco vezes o volume do pellet de tampão de lise passiva, ou PLB. Transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Vortexe brevemente a suspensão e incube em agitação suave por 30 minutos a quatro graus Celsius.Centrifugar a suspensão celular a 10.000 vezes g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Transferir o lisado solúvel para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e descartar o pellet celular. Reservar 10% do volume final do lisado solúvel como entrada de STREP-AP e armazená-lo a quatro graus Celsius.É importante usar as microesferas STREP na primeira etapa de purificação por afinidade, porque os complexos obtidos com as microesferas STREP recuperam significativamente mais proteína do que aqueles obtidos com as microesferas FLAG. Utilizando uma ponteira de boca larga, remova a quantidade apropriada da suspensão de microesferas STREP a 50% para a purificação por afinidade. Centrifugue a 1.500 × g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de PLB às esferas. Agite suavemente a mistura de esferas por cinco minutos a quatro graus Celsius. Centrifugue novamente.Após a terceira lavagem, remova o sobrenadante e re-suspenda as microesferas em PLB até um volume final de n vezes 40 microlitros, em que n é o número de amostras. Adicione 40 microlitros de suspensão de microesferas de STREP a 50% a cada amostra de lisado celular e incube sob agitação suave por duas horas a quatro graus Celsius. Durante esta etapa de produção e recuperação da proteína, podem ser utilizadas múltiplas placas de células, e amostras da mesma proteína lisadas a partir de placas diferentes podem ser combinadas com uma única porção de microesferas durante a purificação por afinidade com STREP.Após a incubação das misturas de lisado celular e suspensão de microesferas STREP por duas horas, centrifugue-as a 1.500 × g durante dois minutos a quatro graus Celsius. Guarde o sobrenadante como fluxo passante do STREP AP e armazene a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitros do tampão de lavagem STREP AP um às microesferas.Nutre as esferas na mistura de tamp&atilde;o por cinco minutos a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 &times; g por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de tamp&atilde;o de lavagem STREP AP um. Ap&oacute;s a terceira lavagem, transfira a solu&ccedil;&atilde;o de esferas para um novo tubo microcentr&iacute;fugo de 1,5 mililitro para reduzir o fundo proteico.Lave pela quarta vez com o tamp&atilde;o de lavagem STREP AP um. Ap&oacute;s a centrifuga&ccedil;&atilde;o, remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros do tamp&atilde;o de lavagem dois. Equilibre os gr&acirc;nulos invertendo os tubos e, em seguida, centrifugue a 1.500 &times; g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante. Elua a proteína de interesse com 50 microlitros de tampão de eluição STREP. Vortexe a 800 rpm durante 15 minutos a quatro graus Celsius.Centrifugar as microesferas a 1.500 × g durante um minuto a quatro graus Celsius. Coletar o sobrenadante. Esta fração corresponde à amostra de eluição STREP AP.Guarde a fração de esferas a quatro graus Celsius para uma segunda eluição. Aliquote 10% da eluição STREP AP para coloração com prata e/ou Western blot. Para aumentar a quantidade de material inicial para a imunoprecipitação com FLAG subsequente, as primeiras e segundas eluições STREP podem ser reunidas para uma recuperação mais eficiente da eluição com FLAG.Inicie este procedimento utilizando uma ponteira de pipeta de boca larga para transferir a quantidade apropriada da solução de microesferas FLAG para um tubo de microcentrífuga. Centrifugue a 1.500 × g durante dois minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante e adicione 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG às microesferas.Centrifugue a 1.500 × g durante dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante e lave novamente com o tampão de lavagem FLAG. Após a terceira lavagem, remova o sobrenadante e ressuspenda as microesferas em tampão de lavagem FLAG até um volume final de n vezes 16 microlitros, em que n é o número de amostras.Adicione 16 microlitros da suspensão de microesferas FLAG à eluição STREP AP restante e agite suavemente durante a noite a quatro graus Celsius. Após uma incubação durante a noite da suspensão de microesferas FLAG e da eluição STREP AP, prossiga com a imunoprecipitação FLAG. Centrifugue a suspensão de microesferas FLAG a 1.500 ×g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Guarde o sobrenadante como o fluxo passante do IP de FLAG e armazene a quatro graus Celsius. Adicione 500 microlitros de tampão de lavagem de FLAG às esferas. Incube em agitação suave por cinco minutos a quatro graus Celsius e centrifugue a 1.500 × g por dois minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante e lave novamente com 500 microlitros de tampão de lavagem FLAG. Após a terceira lavagem, transfira a solução de perlas de proteína para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro para reduzir o fundo. Lave pela quarta vez com tampão de lavagem FLAG.Remova o sobrenatante da última centrifugação e adicione aos grânulos 30 microlitros de tampão de lavagem FLAG contendo 200 nanogramas por microlitro de peptídeo FLAG. Agite em vórtex a 800 rpm durante duas horas a quatro graus Celsius. Após duas horas, centrifugue a suspensão a 1.500 × g durante dois minutos a quatro graus Celsius.Colete o sobrenatante e armazene a quatro graus Celsius como o eluato da imunoprecipitação com FLAG. Neste vídeo, o método de purificação por afinidade em tandem, ou método TAP, foi aplicado ao complexo Cyclin-T1 CDK9. Cyclin-T1 com marcação STREP e CDK9 com marcação FLAG foram superexpressos em células HEK293 T.Um experimento recíproco também foi realizado com CDK9 marcado com STREP e Ciclina-T1 marcada com FLAG. A análise por Western blot mostra que CDK9 marcado com FLAG coeluiu com Ciclina-T1 marcada com STREP das perlas STREP, mas não no controle negativo, AP sem Ciclina-T1 marcada com STREP. Ambas as proteínas foram detectadas na eluição com FLAG, o que confirmou ainda mais a formação do complexo.Os resultados de TAP recíproco mostram que a Ciclina-T1 marcada com FLAG coeluiu com a CDK9 marcada com STREP, validando ainda mais que a interação entre Ciclina-T1 e CDK9 é independente dos epítopos utilizados. Os resultados do TAP e do TAP recíproco também foram analisados por coloração com prata. Os asteriscos indicam impurezas coeluídas.CDK9 com marcação FLAG coeluiu com Ciclina-T1 com marcação STREP a partir das microesferas STREP, mas não a partir do AP controle. Na subsequente eluição com FLAG, Ciclina-T1 com marcação STREP coeluiu com CDK9 com marcação FLAG a partir das microesferas FLAG. De forma semelhante, Ciclina-T1 com marcação FLAG coeluiu com CDK9 com marcação STREP a partir das microesferas STREP, mas não a partir do AP controle. E o complexo proteína-proteína foi eficientemente recuperado após o segundo passo de IP com FLAG. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em dois dias, começando quando as células estão prontas para serem coletadas, se for executada corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de aumentar o número de placas de células por experimento de forma adequada, para garantir que seja possível recuperar e detectar quantidade suficiente de proteína. Por exemplo, identificar novas subunidades regulatórias e/ou estudar as modificações pós-traducionais nas subunidades do complexo. Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores que estudam interações proteína-proteína explorarem novos interatores e modificações pós-traducionais em células eucarióticas.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e caracterizar proteínas utilizando as marcações STREP e FLAG.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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