Name: Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Aprenda a monitorar interações proteína-proteína dinâmicas em células vivas usando reticulação fotoquímica específica do sítio em E. coli. Este método captura parceiros de interação transientes com resolução temporal.

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Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais.

1. Construção de plasmídeo
<ol>
	<li>Depois de clonar um gene que codifica uma proteína de interesse em um vetor de expressão apropriado, introduza mutações âmbar nos locais desejados usando um kit de mutagênese dirigida ao local. 
	NOTA: Informações estruturais e previsões de exposição à superfície podem servir como guias úteis para determinar as posições das mutações. Como a eficiência da supressão e reticulação do âmbar pode variar consideravelmente, as mutações do âmbar devem ser introduzidas em várias posições. Além disso, como o Bpa é um análogo da tirosina e da fenilalanina, tente introduzir mutações âmbar em posições que normalmente codificam grandes aminoácidos hidrofóbicos para minimizar as perturbações da estrutura e função das proteínas. Finalmente, ao escolher um vetor de expressão, lembre-se de que a superprodução de uma proteína de interesse em um nível muito alto pode limitar a eficiência da incorporação de Bpa.</li>
</ol>
2. Preparação da cultura
<ol>
	<li>Use eletroporação para transformar uma cepa apropriada de E. coli com um plasmídeo que codifica o sistema de supressão âmbar (pDULE-p Bpa; ver referência4) e um plasmídeo compatível que codifica a proteína de interesse com uma mutação âmbar.</li>
	<li>Células em placas em ágar LB contendo antibióticos apropriados (use 5 μg/ml de tetraciclina para selecionar pDULE-p Bpa). Incubar as placas O/N a 37 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, iniciar as culturas O/N a partir de colónias únicas em 3-5 ml de meio M914 contendo 0,2% de glicerol, todos os L-aminoácidos, exceto metionina e cisteína (40 μg/ml) e antibióticos. Incubar a 37 °C.</li>
	<li>No dia seguinte, centrifugue culturas O/N a 2.500 x g por 5 min em RT para granular células. Ressuspender as células em 5 ml de meio M9 fresco e repetir a centrifugação. 
	NOTA: Esta etapa de lavagem é crítica para manter os plasmídeos que codificam a resistência à ampicilina porque pequenas quantidades de b lactamase presentes no meio das culturas O/N degradam a ampicilina recém-adicionada antes que ocorra um crescimento celular significativo.</li>
	<li>Ressuspender as células em 2 ml de meio fresco e medir a concentração celular num espectrofotómetro (OD550).</li>
	<li>Adicionar células a um frasco de Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio M9 e antibióticos a OD550=0,03. Incubar as culturas a 37 °C em banho-maria agitado.</li>
</ol>
3. Incorporação de BPA e Preparação para Fotocrosslinking
NOTA: O protocolo descrito abaixo é para um curso de tempo de amostra que tem três pontos de tempo (0, 1 e 5 min). Ajuste os volumes de acordo se desejar um número diferente de pontos de tempo. Um esboço do procedimento é ilustrado na Figura 1.
<ol>
	<li>Enquanto as culturas estão crescendo, prepare uma solução fresca de 1 M (1.000x) de Bpa em NaOH 1 M (27 mg de Bpa em 100 μl de NaOH 1 M). Use um tubo de paredes escuras para manter a solução no escuro.</li>
	<li>Quando as culturas atingirem a fase inicial a intermediária (OD550 = 0,2), adicione 50 μl 1 M Bpa a cada cultura. Adicione Bpa uma gota de cada vez enquanto gira o frasco para evitar precipitação. Em seguida, adicione quaisquer indutores necessários para impulsionar a expressão do mutante âmbar. Continue a incubar as culturas a 37 °C por mais 30 min.</li>
	<li>Durante o período de indução de 30 minutos, rotule seis tubos de centrífuga descartáveis de 15 ml com o ponto de tempo (0 min, 1 min, 5 min) e "+ UV" ou "- UV". Coloque os tubos no gelo.</li>
	<li>Encha um segundo balde de gelo com gelo e coloque uma placa de cultura de tecidos de 6 poços em cima do gelo.</li>
	<li>Descongele a alta atividade específica (1.000 mCi / mmol) 35S-metionina e 35S-cisteína (ou uma mistura pré-fabricada dos dois compostos) para a marcação do pulso e prepare (ou descongele) uma solução de L-cisteína e L-metionina não radioativas (100 mM cada) para a perseguição.</li>
	<li>Ligue a lâmpada UV cinco minutos antes da radiomarcação. 
	NOTA: A lâmpada deve ser ajustável para que possa ser posicionada a ~3-4 cm das amostras na placa multipoços.</li>
	<li>Adicione gelo (~ 2 ml) a cada tubo rotulado como "- UV" e a dois dos poços na placa multipoços. 
	NOTA: O gelo deve ser adicionado a um terceiro poço imediatamente antes do ponto de tempo de 5 minutos. É essencial colocar gelo diretamente nos tubos e poços para interromper as reações intracelulares imediatamente em cada ponto de tempo e, assim, obter "instantâneos" precisos de uma via bioquímica específica.</li>
	<li>No final do período de indução de 30 minutos, transferir 25 ml da cultura para um Erlenmeyer descartável de 125 ml pré-aquecido. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.</li>
</ol>
4. Rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV
NOTA: O protocolo de rotulagem de perseguição de pulso e irradiação UV tem muitas etapas que devem ser executadas em tempo hábil e que exigem considerável organização e preparação antecipada. Todos os reagentes e tubos devem ser facilmente acessíveis. Um protocolo para um experimento que tem pontos de tempo de 0, 1 e 5 minutos é apresentado abaixo.
<ol>
	<li>No momento 0:00 (min:seg), transferir 25 ml de cultura para um balão de 125 ml.</li>
	<li>No tempo 0:30, adicionar 30 μCi/ml de aminoácidos radioactivos; agitar rapidamente para misturar. Colocar o balão no banho-maria agitado a 37 °C.</li>
	<li>No tempo 1:00, adicionar 250 μl da solução de metionina-cisteína a 100 mM; agitar rapidamente para misturar.
	<ol>
		<li>Pipetar imediatamente 4 ml da cultura para um dos alvéolos da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar uma segunda alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "0 min - UV". Volte a colocar o balão no banho-maria.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Às 2:00, pipetar 4 ml da cultura para o segundo poço da placa multipoços refrigerada que contém gelo. Pipetar mais uma alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "1 min - UV". Voltar a colocar o balão no banho-maria.</li>
	<li>Às 6:00, pipetar 4 ml da cultura para o terceiro poço da placa multipoços gelada que contém gelo. Pipetar outra alíquota de 4 ml para o tubo de 15 ml identificado como "5 min - UV".</li>
	<li>Coloque o balde de gelo com a placa multipoços sob a lâmpada UV pré-aquecida e irradie cada amostra individualmente por 4 min. 
	NOTA: Em experimentos em que os pontos de tempo são espaçados pelo menos 4 min, cada amostra deve ser irradiada assim que for pipetada na placa multipoços.</li>
	<li>Transfira as células para os tubos refrigerados de 15 ml rotulados como "0 min + UV", 1 min + UV ", etc.</li>
	<li>Centrifugue as células a 2.500 x g por 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Ressuspender cada amostra em 300 μl de meio M9 ou PBS e adicionar 33 μl de ácido tricloroacético (TCA) 100% frio para precipitar as proteínas. Centrifugue os precipitados de TCA em uma microcentrífuga em velocidade máxima por 10 min e remova o sobrenadante. Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a - 20 °C.</li>
</ol>
5. Imunoprecipitação e Detecção de Produtos de Reticulação
<ol>
	<li>Adicione 50 μl de tampão de solubilização (15% de glicerol, 200 mM de Trisbase, 15 mM de EDTA, 4% de SDS, 2 mM de PMSF) a cada amostra e aqueça com agitação a 95 ° C por 5 min para solubilizar a proteína precipitada.</li>
	<li>Adicione 1 ml de tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 1,0% Igepal CA-630, 0,5% desoxicolato, 0,1% SDS) e execute imunoprecipitações padrão15 usando um quinto a metade de cada amostra. 
	NOTA: Igepal CA-630 (octilfenil-polietilenoglicol) é usado no lugar do NP-40, que não está mais disponível comercialmente. Os dois compostos são quimicamente indistinguíveis.</li>
	<li>Resolva proteínas imunoprecipitadas por SDS-PAGE. Colora, desmancha e seca géis.</li>
	<li>Exponha os géis a uma tela de fósforo O/N e detecte proteínas radioativas (incluindo produtos de reticulação) com um gerador de imagens de fósforo.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+large-scale+data+sets+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions.</a> Nature. 417, 399-403 (2002).</li>
<li>Chin, J. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+a+photocrosslinking+amino+acid+to+the+genetic+code+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Addition of a photocrosslinking amino acid to the genetic code of Escherichia coli.</a> PNAS. 99, 11020-11024 (2002).</li>
<li>Farrell, I. S., Toroney, R., Hazen, J. L., Mehr, R. A., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-cross-linking+interacting+proteins+with+a+genetically+encoded+benzophenone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone.</a> Nat. Methods. 2 (5), 377-384 (2005).</li>
<li>Wittelsberger, A., Mierke, D. F., Rosenblatt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+ligand-receptor+interfaces%3A+approaching+the+resolution+limit+of+benzophenone-based+photaffinity+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Mapping ligand-receptor interfaces: approaching the resolution limit of benzophenone-based photaffinity scanning.</a> Chem. Biol. Drug Des. 71, 380-383 (2008).</li>
<li>Ieva, R., Tian, P., Peterson, J. H., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+and+spatially+restricted+interactions+of+assembly+factors+with+an+autotransporter+beta+domain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Sequential and spatially restricted interactions of assembly factors with an autotransporter beta domain.</a> PNAS. 108, 383-391 (2011).</li>
<li>Wang, F., Robbins, S., Guo, J., Shen, W., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Deiters, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+amino+acids+with+novel+reactivity+to+the+genetic+code+of+Saccharyomycescerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharyomycescerevisiae.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 11782-11783 (2003).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Brock, A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+repertoire+of+the+methylotrophic+yeast+Pichiapastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic repertoire of the methylotrophic yeast Pichiapastoris.</a> Biochemistry. 48 (12), 2643-2653 (2009).</li>
<li>Hino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+photo-cross-linking+in+mammalian+cells+by+site-specific+incorporation+of+a+photoreactive+amino+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid.</a> Nat. Methods. 2 (3), 201-206 (2005).</li>
<li>Liu, W., Brock, A., Chen, S., Chen, S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+incorporation+of+unnatural+amino+acids+into+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells.</a> Nat. Methods. 4 (3), 239-244 (2007).</li>
<li>Leyton, D. L., Rossiter, A. E., Henderson, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+self+sufficiency+to+dependence%3A+mechanisms+and+factors+important+for+autotransporter+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">From self sufficiency to dependence: mechanisms and factors important for autotransporter biogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 10 (3), 213-225 (2012).</li>
<li>Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+an+autotransporter+passenger+domain+with+BamA+during+its+translocation+across+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Interaction of an autotransporter passenger domain with BamA during its translocation across the bacterial outer membrane.</a> PNAS. 106, 19120-19125 (2009).</li>
<li>Pavlova, O., Peterson, J. H., Ieva, R., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+link+between+barrel+assembly+and+the+initiation+of+autotransporter+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mechanistic link between barrel assembly and the initiation of autotransporter secretion.</a> PNAS. 110, (2013).</li>
<li>Harlow, D., Lane, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHarlow%2C+D+%22Using+antibodies%3A+a+laboratory+manual%22">Using antibodies: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laborator Press. Cold Spring Harbor, NY. (1999).</li>
<li>Barnard, T. J., Dautin, N., Lukacik, N., Bernstein, P., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autotransporter+structure+reveals+intra-barrel+cleavage+followed+by+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Autotransporter structure reveals intra-barrel cleavage followed by conformational changes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 14 (12), 1214-1220 (2007).</li>
<li>Akiyama, Y., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SecY+protein%2C+a+membrane-embedded+secretion+factor+of+E.+coli%2C+is+cleaved+by+the+ompT+protease+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is cleaved by the ompT protease in vitro.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 167 (2), 711-715 (1990).</li>
</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este artigo descreve um método que combina fotoreticulação específica do local com marcação de perseguição de pulso para examinar a dinâmica das interações entre uma proteína de interesse e outros componentes de uma célula viva. O método é especialmente útil para estudar processos de várias etapas nos quais a proteína interage sequencialmente com outros fatores. Ao contrário das abordagens tradicionais de reticulação química, a fotoreticulação específica do local fornece informações detalhadas sobre o status de segmentos...

Muitas vezes é essencial identificar e caracterizar interações entre uma proteína de interesse e outros componentes celulares para definir seu papel em uma via biológica, entender sua montagem ou elucidar seu mecanismo de ação. Uma ampla variedade de abordagens é comumente usada para estudar as interações proteína-proteína, mas todas têm suas limitações. O método imparcial mais simples para identificar proteínas que se ligam a uma proteína de interesse é a copurificação (ou coimunoprecipitação), mas essa abordagem requer que um complexo proteico permaneça intacto durante o procedimento de purificação. Interações proteicas fracas ou transitórias podem ser estabilizadas por meio de reticulação química, mas esse método normalmente requer o uso de compostos que ligam proteínas por meio de aminas primárias que estão amplamente espalhadas na sequência de proteínas. Padrões complicados de reticulação que são difíceis de interpretar podem ser gerados, especialmente quando proteínas de interesse são componentes de complexos multiproteicos. Além disso, como os braços espaçadores dos reticuladores químicos geralmente excedem 10 Å de comprimento, as ligações covalentes podem ser formadas com proteínas localizadas nas proximidades, mas não interagem diretamente com a proteína de interesse. Métodos como cromatografia de afinidade e telas de dois híbridos também são frequentemente úteis para identificar interações proteína-proteína. A primeira abordagem, no entanto, requer condições de reprodução que promovam interações fisiologicamente significativas e não pode ser usada para detectar interações fracas. A última abordagem requer que as interações de ligação possam ser replicadas no organismo hospedeiro e sejam mantidas quando uma proteína de interesse e seus parceiros de ligação são colocados no contexto de uma proteína de fusão. Os métodos de dois híbridos também tendem a gerar resultados falso-positivos2. Uma vez que uma interação proteína-proteína tenha sido estabelecida, muitas vezes é necessário um trabalho considerável para mapear o local da interação. Talvez a desvantagem mais significativa das abordagens tradicionais seja que elas não fornecem nenhuma informação sobre a sequência temporal das interações intermoleculares ou a cinética de ligação.
Este artigo descreve um método simples que supera algumas das limitações de outras abordagens usadas para estudar as interações proteína-proteína. Inicialmente, uma única mutação âmbar é introduzida no gene que codifica uma proteína de interesse. O mutante âmbar é então coexpresso com um tRNA supressor de âmbar e uma amino acil-tRNA sintetase derivada de Methanococcus jannaschii que foram projetados para incorporar o análogo de aminoácido fotoativável p-benzoilfenilalanina (Bpa) apenas em códons âmbar3. A irradiação de células com luz ultravioleta (UV) de comprimento de onda longo (~ 365 nm) facilita a formação de uma ligação covalente entre Bpa e proteínas que estão dentro de ~ 3-8 Å4,5. Em alguns contextos experimentais, também podem ser formadas ligações cruzadas entre o Bpa ativado e componentes não proteicos das células, como lipídios e ácidos nucléicos6. As moléculas que terminam no códon âmbar geralmente devem ser facilmente distinguíveis da proteína de comprimento total no SDS-PAGE e não podem ser reticuladas com outras proteínas. Ao submeter as células à radiomarcação de pulso antes da reticulação e, em seguida, imunoprecipitação ou produtos de reticulação purificadores de afinidade, a sequência e a duração das interações proteína-proteína podem ser estabelecidas. A capacidade de gerar informações temporais sobre interações intermoleculares é especialmente valiosa para estudar a progressão de uma proteína de interesse através de qualquer via ordenada de montagem, tráfego ou sinalização em várias etapas e para identificar intermediários da via. Assim como a reticulação química, a reticulação específica do local detecta interações proteína-proteína que ocorrem em condições fisiológicas, mas a introdução de um reticulador em uma única posição facilita a análise das interações entre segmentos individuais de uma proteína e outros fatores. Essa característica única de reticulação específica do local é especialmente vantajosa quando a proteína de interesse tem vários segmentos ou domínios que têm o potencial de interagir com parceiros de ligação distintos. Além disso, a reticulação específica do local pode ser usada em combinação com métodos como espectrometria de massa para mapear os resíduos que medeiam as interações proteína-proteína com precisão. Embora esse método seja otimizado para uso em E. coli, a incorporação de análogos de aminoácidos fotaciváveis em proteínas por supressão de âmbar tem sido relatada em células de Mycobacterium, leveduras e mamíferos7-11. Assim, em princípio, nosso método pode ser usado em outros sistemas.
Usamos esse método extensivamente para identificar interações intermoleculares que facilitam a biogênese de EspP, um fator de virulência O157:H7 de E. coli. EspP é um membro de uma superfamília de proteínas conhecidas como "autotransportadores" que contêm um grande domínio extracelular N-terminal ("domínio passageiro") e domínio aC-terminal ("domínio b") que se dobra em uma estrutura cilíndrica de barril b e ancora a proteína à membrana externa (MO) 12 . O mecanismo pelo qual o domínio do passageiro é translocado através do OM tem sido um mistério de longa data. Como todas as proteínas da superfície celular bacteriana, o EspP deve ser transportado através da membrana interna, transportado através do periplasma (o espaço entre as membranas interna e externa) e direcionado para o OM em uma série de eventos ordenados. Após sua translocação através do OM, o domínio passageiro EspP também é separado do domínio b por uma clivagem proteolítica e liberado da superfície celular. Ao combinar a reticulação específica do local com a radiomarcação de perseguição de pulso, mostramos que ambos os domínios da proteína interagem inicialmente com a chaperona molecular Skp no periplasma6. Posteriormente, segmentos discretos do domínio b interagem de forma estereoespecífica com componentes de um heterooligômero chamado complexo Bam, que catalisa a integração de proteínas do barril b na MO bacteriana por um mecanismo desconhecido. Talvez o mais interessante seja que descobrimos que o domínio do passageiro está em contato com uma das subunidades do complexo Bam (BamA) à medida que atravessa o OM13. Nossos resultados nos permitiram construir um modelo detalhado para a montagem do autotransportador14 e implicaram o complexo Bam no transporte do domínio de passageiros através do OM.

<table><tbody><tr><td>Kit de Mutagênese Dirigida ao Local QuikChange II</td><td>Agilent</td><td>200521</td><td></td></tr><tr><td>BPA (H-p-Bz-Phe-OH)</td><td>Bachem</td><td>F-2800</td><td></td></tr><tr><td>TRAN35S-LABEL, Reagente de Marcação Metabólica (35S-L-metionina e 35S-L-cisteína, >1.000 Ci/mmol)</td><td>MP Biomedicals</td><td>51006</td><td></td></tr><tr><td>Spectroline SB-100P Lâmpada UV de Intensidade Super-Alta, 365 nm</td> Bulbo de Substituição <td>Spectroline SB-110P</td><td></td>da <td>Spectronics Corporation</td></tr><tr><td>100S</td> Placa de Cultura de Tecidos Falcon <td>11-992-15</td><td></td>da <td>Spectronics Corporation</td></tr><tr><td>, 6 poços</td><td>Becton Dickinson</td><td>Labware 353046</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer Descartável</td><td>Corning</td><td>430421</td><td></td></tr><tr><td>Innova 3100 banho-maria agitado</td><td>Novo Brunswick Scientific</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

Este artigo descreve um método para detectar e analisar interações dinâmicas entre uma proteína de interesse e outros fatores in vivo. Nosso método é baseado na tecnologia de supressão de âmbar que foi originalmente desenvolvida por Peter Schultz e colegas1. Uma mutação âmbar é introduzida pela primeira vez em um códon específico do gene que codifica a proteína de interesse. O mutante âmbar é então expresso em E. coli junto com genes que codificam um tRNA supressor de âmbar e uma amino acil-tRNA sintetase derivada de Methanococcus jannaschii. Usando este sistema, o análogo de aminoácido fotoativável p-benzoilfenilalanina (Bpa) é incorporado no códon âmbar. As células são então irradiadas com luz ultravioleta para ligar covalentemente o resíduo de Bpa a proteínas localizadas dentro de 3-8 Å. A fotoreticulação é realizada em combinação com a marcação de pulso e imunoprecipitação da proteína de interesse, a fim de monitorar as mudanças nas interações proteína-proteína que ocorrem em uma escala de tempo de segundos a minutos. Otimizamos o procedimento para estudar a montagem de um fator de virulência bacteriana que consiste em dois domínios independentes, um domínio que é integrado à membrana externa e um domínio que é translocado para o espaço extracelular, mas o método pode ser usado para estudar muitos processos de montagem e vias biológicas diferentes em células procarióticas e eucarióticas. Em princípio, fatores de interação e até mesmo resíduos específicos de fatores de interação que se ligam a uma proteína de interesse podem ser identificados por espectrometria de massa.

Utilizamos photocruzamento específico em sítios para identificar proteínas que interagem com EspP durante seu trajeto até a membrana externa (OM). Nos experimentos aqui apresentados, códons de fenilalanina nos resíduos 1113 e 1214 foram substituídos por códons âmbar. Ambas as posições estão localizadas no domínio β, que se integra à OM e atua como uma âncora de membrana. A estrutura cristalográfica do domínio β de EspP16 mostra que os dois resíduos estão no lado periplasmático do barril β, mas separados por ap...

Este artigo ilustra o uso de marcação de rádio de perseguição de pulso em combinação com fotocrosslinking específico do local para monitorar as interações entre uma proteína de interesse e outros fatores em E. coli. Ao contrário dos métodos tradicionais de reticulação química, essa abordagem gera "instantâneos" de alta resolução de uma via de montagem ordenada em uma célula viva.

Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a dinâmica das interações entre proteínas no interior de uma célula viva. Isso é alcançado primeiramente pela expressão de uma proteína de interesse em *E. coli*, incorporando o análogo do aminoácido benzoyl fenil alanina na proteína em um local específico e realizando marcação por pulso e corte com radionuclídeos para rotular uma pequena população de moléculas de proteína sintetizadas de forma sincronizada. Como segundo passo.Aliquotas de células coletadas em vários pontos temporais durante o período de "chase" são irradiadas para induzir a formação de ligações covalentes entre a proteína de interesse e quaisquer fatores com os quais ela esteja interagindo. Em seguida, as proteínas são imunoprecipitadas com anticorpos específicos e separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS, a fim de identificar os fatores interagentes. Os resultados obtidos mostram alterações nas interações entre a proteína de interesse e outros fatores intracelulares ao longo do tempo, com base em mudanças na mobilidade eletroforética dos produtos de reticulação. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como co-imunoprecipitação ou reticulação química, é sua capacidade de gerar informações temporais sobre as interações que ocorrem entre um resíduo específico em uma proteína de interesse e outras moléculas.Esses dados são especialmente valiosos ao estudar a progressão de uma proteína por meio de uma via de montagem de múltiplas etapas e para identificar intermediários da montagem. Embora este método tenha sido otimizado para uso em *E. coli*, ele também pode ser utilizado em outros sistemas, incluindo outras bactérias, leveduras e células de mamíferos. Os detalhes para o preparo do cultivo podem ser encontrados no protocolo textual.Prepare brevemente cinco mililitros de meio M nove contendo 0,2% de glicerol, todos os aminoácidos el exceto metionina e cistina e antibióticos. Inicie culturas sobrevivência adicionando E. coli transformada com um plasmídeo que codifica para a proteína de interesse com uma mutação âmbar e o plasmídeo que codifica para o sistema de supressão âmbar. Incube a 37 graus Celsius. No dia do experimento, adicione uma quantidade apropriada de células da cultura sobrevivência a um frasco erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio M nove e antibióticos para obter uma densidade óptica a 550 nanômetros de 0,03. Incube as culturas a 37 graus Celsius em banho-maria agitado.Quando as culturas atingirem a fase logarítmica inicial a média, adicione 50 microlitros de benzil fenilalanina ou BPA a um molar a cada cultura. Adicione o BPA uma gota por vez, agitando o frasco para evitar precipitação. Em seguida, adicione os indutores necessários para promover a expressão do mutante âmbar.Continue a incubação das culturas a 37 graus Celsius por mais 30 minutos durante o período de indução de 30 minutos. Rotule seis tubos descartáveis de centrífuga de 15 mililitros com o ponto de tempo e com mais UV ou menos UV. Coloque os tubos rotulados sobre gelo.Coloque uma placa de cultura de tecidos de seis poços sobre um segundo balde de gelo cheio de gelo. Ligue a lâmpada UV cinco minutos antes da marcação com radiação. Em seguida, adicione aproximadamente dois mililitros de gelo a cada tubo identificado como sem UV e a dois dos poços da placa de múltiplos poços.É essencial soprar gelo diretamente para dentro dos tubos e poços para interromper imediatamente as reações intracelulares em cada ponto temporal e, assim, obter um registro preciso da via bioquímica ao final do período de indução de 30 minutos. Transfira 25 mililitros da cultura para um frasco erlenmeyer descartável de 125 mililitros previamente aquecido. Coloque o frasco em banho-maria agitado a 37 graus Celsius.Os passos do marcação por pulso e perseguição e da irradiação por UV devem ser realizados em tempo hábil e exigem organização considerável e preparação avançada. Adicione 30 microcuries por mililitro de metionina e cisteína marcadas com S 35 ao cultivo e agite rapidamente para misturar no tempo de um minuto e zero segundos.Adicione 250 microlitros de uma solução não radioativa de metionina-cisteína 100 milimolar e agite rapidamente. Para misturar imediatamente, pipete quatro mililitros da cultura em um dos poços da placa multipoços gelada que contém gelo; pipete um segundo alíquota de quatro mililitros no tubo de 15 mililitros rotulado zero minutos sem UV no tempo. Dois minutos e zero segundos.Pipete quatro mililitros da cultura em um segundo poço da placa multipoços resfriada que contém gelo. Em seguida, pipete outro alíquota de quatro mililitros no tubo de 15 mililitros rotulado um minuto menos UV imediatamente antes do ponto de tempo de cinco minutos, adicionando aproximadamente dois mililitros de gelo a um terceiro poço da placa multipoços no momento seis minutos zero segundos. Pipete quatro mililitros da cultura no terceiro poço da placa multipoços resfriada que contém gelo.Adicione mais uma alíquota de quatro mililitros ao tubo de 15 mililitros rotulado cinco minutos sem uv. Coloque o balde de gelo com a placa de múltiplos poços sob a lâmpada UV pré-aquecida e irradie cada amostra individualmente por quatro minutos. Transfira as células para os tubos de 15 mililitros resfriados rotulados zero minuto com uv, um minuto com UV e assim por diante.Em seguida, centrifugue as células a 2.500 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Re-suspenda cada amostra em 300 microlitros de meio M nove ou PBS e 33 microlitros de ácido tricloroacético a 100% frio ou TCA para precipitar as proteínas; centrifugue os precipitados de TCA em um microcentrífuga na velocidade máxima durante 10 minutos. Antes de remover o sobrenadante, adicione 50 microlitros de tampão de solubilização a cada amostra e aqueça com agitação a 95 graus Celsius por cinco minutos para solubilizar a proteína precipitada.Após adicionar um mililitro de tampão de radioimunoprecipitação, realize imunoprecipitações padrão utilizando de um quinto a metade de cada amostra. Separe as proteínas imunoprecipitadas por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Por fim, exponha os géis corados e secos a uma tela fosforescente durante a noite e detecte as proteínas radioativas, incluindo os produtos de reticulação, utilizando um fosfoimager. A foto-reticulação específica por sítio foi utilizada para identificar proteínas que interagem com ESPP durante seu trajeto até a membrana externa.Para este experimento, os códons de alanina em pH nos resíduos 1113 e 1214 do domínio beta ESPP foram substituídos por códons Âmbar. A estrutura cristalina do domínio beta ESPP mostra que os dois resíduos estão ambos no lado periplásmico do barril beta, separados por aproximadamente 120 graus. Duas polipeptídios diferentes foram imunoprecipitados tanto de células irradiadas quanto de células controle pelo soro anti-ESPP da extremidade C-terminal.Inicialmente, uma forma precursora de aproximadamente 135 quilodaltons da proteína que contém os domínios ligantes e beta ligados covalentemente predominou em pontos temporais posteriores. O nível de PRO ESPP diminuiu e o domínio beta livre começou a predominar à medida que o domínio ligante foi translocado através da membrana externa e separado do domínio beta por uma clivagem proteolítica. As amostras irradiadas com UV I, no entanto, apresentavam claramente bandas de peso molecular mais alto que não estavam presentes nas amostras controle.Essas bandas resultam da reticulação de PRO ESPP com proteínas interagentes com base na mobilidade desses polipeptídeos, sendo estimados os tamanhos das proteínas interagentes para testar se poderiam corresponder a fatores conhecidos de montagem de proteínas da membrana externa. Foram realizadas imunoprecipitações adicionais utilizando anticorpos anti-cera gerados contra os parceiros interagentes putativos. Um polipeptídeo de aproximadamente 150 kilodaltons que foi observado quando o BPA foi incorporado nos resíduos 1113 e 1214 pôde ser imunoprecipitado com um antisoro contra a chaperona periplasmática de 17 kilodaltons skip.Além disso, descobrimos que polipeptídeos maiores, observados quando o BPA era incorporado em apenas uma das duas posições, podiam ser imunoprecipitados com anticorpos contra as subunidades do complexo BAM, BAM B e BAM D, respectivamente. Após realizar este procedimento, os produtos de reticulação podem ser purificados e outros métodos, incluindo espectrometria de massas, podem ser realizados para ajudar a identificar fatores que interagem com uma proteína de interesse. Após assistir ao vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar com sucesso a marcação por pulso e perseguição com a reticulação fotoquímica específica de sítio para estudar a dinâmica da interação de sua proteína de interesse com outras moléculas dentro da célula viva.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

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