Monitorando a montagem de um fator de virulência bacteriana secretado usando reticulação específica do local

O objetivo geral do experimento a seguir é examinar a dinâmica das interações proteína-proteína dentro de uma célula viva. Isso é conseguido expressando primeiro uma proteína de interesse em e coli, incorporando o análogo do aminoácido benzoilfenil alanina na proteína em um local específico e realizando a marcação de rádio de perseguição de pulso para marcar uma pequena população de moléculas de proteína sintetizadas de forma síncrona. Como um segundo passo.

Alíquotas de células coletadas em vários pontos de tempo durante a perseguição são irradiadas para desencadear a formação de ligações covalentes entre a proteína de interesse e quaisquer fatores com os quais ela esteja interagindo. As proteínas seguintes são imunoprecipitadas com anticorpos específicos e resolvidas por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS para identificar fatores de interação, são obtidos resultados que mostram mudanças nas interações entre a proteína de interesse e outros fatores intracelulares ao longo do tempo com base em mudanças na mobilidade eletroforética de produtos de reticulação. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como co-imunoprecipitação ou reticulação química, é sua capacidade de gerar informações temporais sobre as interações que ocorrem entre um resíduo específico em uma proteína de interesse e outras moléculas.

Esses dados são especialmente valiosos ao estudar a progressão de uma proteína por meio de uma via de montagem em várias etapas e para identificar intermediários de montagem. Embora esse método tenha sido otimizado para uso em E. coli, ele também pode ser usado em outros sistemas, incluindo outras bactérias, leveduras e células de mamíferos. Detalhes para preparação da cultura podem ser encontrados no protocolo de texto.

Prepare brevemente cinco mililitros de meio M nove contendo 0,2% de glicerol, todos os aminoácidos el, exceto metionina e cistina, e antibióticos começam as culturas noturnas adicionando e coli transformada com um plasmídeo que codifica a proteína de interesse com uma mutação âmbar e o plasmídeo que codifica para o sistema de supressão de âmbar incubar a 37 graus Celsius. No dia do experimento, adicione uma quantidade adequada de células da cultura noturna a um frasco erlenmeyer de 250 mililitros contendo 50 mililitros de meio M nine e antibióticos para obter uma densidade óptica de 550 nanômetros de 0,03. Incube as culturas a 37 graus Celsius em banho-maria agitado.

Quando as culturas atingirem a fase logarítmica inicial a intermediária, adicione 50 microlitros de um molar benzoil-fenilalanina ou BPA a cada cultura. Adicione BPA uma gota de cada vez enquanto gira o frasco para evitar precipitação. Em seguida, adicione quaisquer indutores necessários para impulsionar a expressão do mutante âmbar.

Continue a incubar as culturas a 37 graus Celsius por mais 30 minutos durante o período de indução de 30 minutos. Rotule seis tubos de centrífuga descartáveis de 15 mililitros com o ponto de tempo e mais UV ou menos UV. Coloque os tubos rotulados no gelo.

Coloque uma placa de cultura de tecidos de seis poços em cima de um segundo balde de gelo cheio de gelo. Ligue a lâmpada UV cinco minutos antes da rotulagem do rádio. Em seguida, adicione aproximadamente dois mililitros de gelo a cada tubo rotulado menos UV e a dois dos poços na placa de vários poços.

É essencial arejar o gelo diretamente nos tubos e poços para interromper as reações intracelulares imediatamente em cada ponto de tempo e, assim, obter um instantâneo preciso da via bioquímica no final do período de indução de 30 minutos. Transfira 25 mililitros da cultura para um erlenmeyer descartável pré-aquecido de 125 mililitros. Colocar o balão no banho-maria com agitação a 37 graus Celsius.

As etapas na marcação de perseguição de pulso e irradiação UV devem ser realizadas em tempo hábil e requerem organização considerável e preparação avançada. Adicione 30 micro curies por mililitro de metionina e cisteína marcadas com S 35 à cultura e agite rapidamente para misturar de cada vez. Um minuto zero segundos.

Adicione 250 microlitros de uma solução não radioativa de cisteína de metionina a 100 milimolares e agite rapidamente. Para misturar imediatamente, pipetar quatro mililitros da cultura em um dos poços da placa de vários poços resfriados que contém gelo, pipetar uma segunda alíquota de quatro mililitros no tubo de 15 mililitros rotulado como zero minutos menos UV de cada vez. Dois minutos zero segundos.

Pipete quatro mililitros da cultura em um segundo poço da placa de vários poços resfriada que contém gelo. Em seguida, pipete outra alíquota de quatro mililitros no tubo de 15 mililitros rotulado um minuto menos UV imediatamente antes do ponto de tempo de cinco minutos em aproximadamente dois mililitros de gelo para um terceiro poço na placa de vários poços às vezes seis minutos zero segundos. Pipete quatro mililitros da cultura no terceiro poço da placa de vários poços resfriada que contém o tubo de gelo.

Tinha outra alíquota de quatro mililitros no tubo de 15 mililitros rotulado cinco minutos menos uv. Coloque o balde de gelo com a placa de vários poços sob a lâmpada UV pré-aquecida e irradie cada amostra individualmente por quatro minutos. Transfira as células para os tubos resfriados de 15 mililitros rotulados como zero minutos mais UV, um minuto mais UV e assim por diante.

Em seguida, centrifugue as células a 2.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Ressuspenda cada amostra em 300 microlitros de meio M nove ou PBS e 33 microlitros de ácido tricloroacético 100% frio ou TCA para precipitar as proteínas centrifugar o TCA precipita em uma micro fuga em velocidade máxima por 10 minutos. Antes de remover o sate, adicione 50 microlitros de tampão de solubilização a cada amostra e aqueça com agitação a 95 graus Celsius por cinco minutos para solubilizar a proteína precipitada.

Depois de adicionar um mililitro de ensaio de imunoprecipitação de rádio, o tampão realiza imunoprecipitações padrão usando um quinto a metade de cada amostra. Resolva as proteínas imunoprecipitadas por sulfato ESAL de sódio, eletroforese em gel de poliacrilamida ou página SDS. Finalmente, exponha os géis corados e secos a uma tela de fosfato durante a noite e para detectar proteínas radioativas, incluindo produtos de reticulação com um gerador de imagens de fosfo.

Para este experimento, os códons de pH alanina nos resíduos 1113 e 1214 do domínio beta do ESPP foram substituídos por códons âmbar. A estrutura cristalina do domínio beta do ESPP mostra que os dois resíduos estão ambos no lado periplasmático do barril beta, separados por aproximadamente 120 graus. Dois polipeptídeos diferentes foram imunoprecipitados de células irradiadas e controle pelo anti ESPP terminal C e soro.

Inicialmente, uma forma precursora de aproximadamente 135 kilodalton da proteína que contém domínios passageiros e beta covalentemente ligados predominou em pontos posteriores. O nível de PRO ESPP diminuiu e o domínio beta livre começou a predominar, pois o domínio passageiro foi trans localizado através da membrana externa e separado do domínio beta por uma clivagem proteolítica. As amostras irradiadas por UV I, no entanto, claramente tinham bandas de peso molecular mais altas que não estavam presentes nas amostras de controle.

Essas bandas resultam da reticulação de PRO ESPP para proteínas em interação com base na mobilidade desses polipeptídeos, os tamanhos das proteínas em interação foram estimados para testar se eles podem corresponder a fatores conhecidos de montagem de proteínas da membrana externa. Foram realizadas imunoprecipitações adicionais usando anticera gerada contra os supostos parceiros de interação. Um polipeptídeo de aproximadamente 150 kilodalton que foi observado quando o BPA foi incorporado em ambos os resíduos 1113 e 1214 pode ser imunoprecipitado com um anti-soro contra o salto de chaperona periplasmática de 17 kilodalton.

Além disso, descobrimos que polipeptídeos maiores que foram observados quando o BPA foi incorporado em apenas uma das duas posições poderiam ser imunoprecipitados com anticera contra as subunidades do complexo BAM, BAM B e BAM D, respectivamente. Depois de realizar este procedimento, os produtos de reticulação podem ser purificados e outros métodos, incluindo espectrometria de massa, podem ser realizados para ajudar a identificar fatores que interagem com uma proteína de interesse. Depois de assistir com o vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como combinar com sucesso a rotulagem de perseguição de pulso com a reticulação de fotos específicas do local para estudar a dinâmica de interação de sua proteína, de interesse com outras moléculas dentro da célula viva.