Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a ligação de peptídeos curtos com MHC humano duas proteínas imunes usando um ensaio de placa de alto rendimento de 3 a 84 poços. Isso é feito realizando primeiro ensaios de ligação de competição de fase de solução com os peptídeos de interesse. Na segunda etapa, os complexos do peptídeo MHC equilibrado dois são capturados com um anticorpo anti MHC dois imobilizado em placas ELIZA de alta ligação.

Em seguida, os complexos capturados são incubados com a estreptavidina marcada com ópio e, em seguida, a estreptavidina não ligada é lavada e o ópio capturado é ativado. Em última análise, a fluorometria resolvida no tempo pode ser usada para quantificar os níveis de MHC dois peptídeos de controle capturados. Este método pode fornecer informações preliminares sobre o potencial imunogênico das proteínas-alvo.

É particularmente útil para validar a saída de preditores in silico, Comece o procedimento adicionando 25 microlitros de solução de anticorpo L 2 43 recém-diluída a cada poço de um 3 84. A placa ELIZA branca de alta ligação selou a placa com um filme de poliéster e incubou-a durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, começando com um estoque de 10 milimolares de cada teste.

O peptídeo e o DMSO fazem a seguinte série de diluição e tampão de fosfato de citrato usando 3 placas de polipropileno de 84 poços. Observe que uma placa de polipropileno completa de 3 84 poços requer três placas EIA separadas, conforme ilustrado. Em seguida, dilua as duas soluções de estoque de MHC selecionadas para uma concentração de 101 nanomolares em tampão de reação usando um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, dilua o peptídeo de controle de 20 micromolares para uma proporção de um para 100 na mistura mestre MHC dois recém-preparada e adicione 21,5 microlitros da mistura mestre MHC dois com peptídeo de controle ao controle positivo. Poço da placa de polipropileno de 3 84 poços, adicione a mistura principal de dois MHC contendo peptídeo de controle a cada uma das diluições do peptídeo de teste em uma proporção de um para um para criar a reação de ligação neste momento também. Finalmente, sele a reação de ligação com um filme de poliéster e incube a placa por 12 a 24 horas em uma incubadora não controlada por dióxido de carbono a 37 graus Celsius sem agitar.

No dia seguinte, diluir os poços de reação de ligação no 3 84. Placa de poço na proporção de um para um com tampão de neutralização. Em seguida, lave a placa Eliza três vezes com 60 microlitros por poço de PBS 0,05% entre 20 próximas transferências, 25 microlitros de cada solução de reação de ligação neutralizada da placa de 3 84 poços em triplicado para o anticorpo revestido 3 84.

Bem, a placa Eliza incuba a placa ELIZA coberta com filme de poliéster a quatro graus Celsius durante a noite após a incubação. Lave a placa ELIZA três vezes como acabamos de demonstrar e, em seguida, adicione 25 microlitros de ópio estreptocócico recém-diluído a cada uma. Bem, incube a placa coberta com um filme de poliéster no escuro em temperatura ambiente por uma hora.

Durante a incubação, leve 10 mililitros de solução de realce por placa à temperatura ambiente também no escuro após uma hora, lave a placa ELIZA conforme demonstrado e, em seguida, adicione 25 microlitros de solução de realce a cada poço e incube a placa coberta com filme de poliéster por 10 a 15 minutos no escuro. Por fim, leia a fluorescência com um leitor de placas fluorescentes com resolução de tempo com configurações de ópio. Neste experimento representativo, uma sequência de peptídeos maduros de enterobacter Cloe P nove nove beta-lactamase foi analisada para possíveis ligantes peptídicos ao alelo MHC dois.

DRB um quinze oh cento e dezessete não ou peptídeos foram identificados com um resíduo obrigatório de P uma âncora na posição um que é necessário para a ligação do MHC dois em um limite de apenas 5%. Peptídeos com escores maiores ou iguais a 2,6 são provavelmente aglutinantes. Assim, no limite de 5%, apenas os 11 principais peptídeos estão previstos para se ligar ao MHC dois DRB 1 15 0 1.

Um painel representativo de epítopos previstos foi selecionado para análise neste ensaio de ligação de dois MHC. Fragmentos de peptídeos beta-lactamase desses 15 resíduos foram sintetizados quimicamente de tal forma que os epítopos putativos nonamer MHC dois foram incorporados em seus fragmentos de proteínas sintéticas. A capacidade desses peptídeos sintéticos de competir com um peptídeo de controle da proteína B básica de mielina biotinilada para se ligar ao MHC dois DRB 1 15 0 1 foi então analisada como acabamos de demonstrar.

As curvas de ligação competitivas para os peptídeos sintéticos são ilustradas aqui. Os valores de IC 50 foram calculados ajustando os dados da transformação logarítmica usando a função de ajuste não linear de ligação competitiva de um local do prisma. Conforme demonstrado na tabela como visto no gráfico, os peptídeos naturalmente particionados em três grupos, ligantes fortes com um IC 50 de menos de um micromolar ligantes moderados com um IC 50 maior ou igual a um micromolar, mas menor que 100 micromolares e ligantes fracos com um IC 50 maior ou igual a 100 micromolares Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de imunologia molecular e design bioterapêutico explorarem mais completamente os principais eventos de reconhecimento molecular subjacentes às respostas imunes antiproteicas em pacientes humanos.