Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a ligação de peptídeos curtos com proteínas imunes do MHC humano tipo dois, utilizando um ensaio de alta produtividade em placas de 384 poços. Isso é realizado primeiramente por meio de ensaios de ligação por competição em fase líquida com os peptídeos de interesse. Na segunda etapa, os complexos de peptídeo-MHC tipo dois em equilíbrio são capturados por um anticorpo anti-MHC tipo dois imobilizado em placas ELIZA de alta ligação.

Em seguida, os complexos capturados são incubados com estreptavidina marcada com opiáceo e, então, a estreptavidina não ligada é removida por lavagem e o opiáceo capturado é ativado. Por fim, a fluorometria com resolução temporal pode ser utilizada para quantificar os níveis do peptídeo controle MHC dois capturado. Este método pode fornecer insights preliminares sobre o potencial imunogênico de proteínas-alvo.

É particularmente útil para validar a saída de preditores in silico, inicie o procedimento adicionando 25 microlitros de solução de anticorpo L 2 43 recém-diluída a cada poço de uma placa ELIZA branca de alta ligação com 3 84 poços. Sobreponha a placa com um filme de poliéster e incube-a durante a noite a quatro graus Celsius. Em seguida, inicie com um estoque de 10 milimolar de cada teste.

Peptídeo e DMSO fazem a seguinte série de diluições e tampão citrato fosfato utilizando 3 placas de polipropileno de 84 poços. Observe que uma placa completa de 84 poços de polipropileno requer três placas EIA separadas, conforme ilustrado. Em seguida, dilua as soluções estoque selecionadas de MHC dois para uma concentração de 101 nanomolar no tampão de reação utilizando um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, dilua o peptídeo controle de 20 micromolar para uma proporção de um para 100 na mistura mestra recém-preparada de MHC II e adicione 21,5 microlitros da mistura mestra de MHC II com peptídeo controle ao controle positivo. Poço da placa de polipropileno de 3 84 poços, adicione a mistura mestra de MHC II contendo o peptídeo controle a cada uma das diluições de peptídeo de teste em uma proporção de um para um para criar a reação de ligação neste momento também. Por fim, feche hermeticamente a reação de ligação com um filme de poliéster e incube a placa por 12 a 24 horas em uma incubadora sem controle de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, sem agitação.

No dia seguinte, dilua os poços da reação de ligação na placa de 3 84 poços em uma proporção de um para um com tampão de neutralização. Em seguida, lave a placa Eliza três vezes com 60 microlitros por poço de PBS 0,05% entre 20 a próxima transferência, 25 microlitros de cada solução de reação de ligação neutralizada da placa de 3 84 poços em triplicata para a placa de 3 84 revestida com anticorpo.

Em seguida, incubar a placa Eliza coberta com filme de poliéster a quatro graus Celsius durante a noite após a incubação. Lavar a placa Eliza três vezes conforme acabou de ser demonstrado e, então, adicionar 25 microlitros de estreptavidina diluída recentemente a cada poço. Incubar a placa coberta com filme de poliéster ao abrigo da luz, em temperatura ambiente, por uma hora.

Durante a incubação, aqueça 10 mililitros de solução de realce por placa até a temperatura ambiente, também no escuro, após uma hora, lave a placa ELIZA conforme demonstrado e, em seguida, adicione 25 microlitros de solução de realce a cada poço e incube a placa coberta com filme de poliéster por 10 a 15 minutos no escuro. Finalmente, leia a fluorescência com um leitor de placas fluorescente com resolução temporal com configurações opium. Neste experimento representativo, uma sequência peptídica madura da enterobactéria Cloe P noventa e nove beta-lactamase foi analisada quanto a possíveis ligantes peptídicos para o alelo MHC dois.

Foram identificados 117 peptídeos não ou DRB1*15:01 com um resíduo âncora obrigatório na posição P1, necessário para a ligação ao MHC II, apenas em um limiar de 5%. Peptídeos com pontuações maiores ou iguais a 2,6 são prováveis ligantes. Assim, apenas no limiar de 5%, os 11 peptídeos superiores são preditos para se ligarem ao MHC II DRB1*15:01.

Um painel representativo de epítopos previstos foi selecionado para análise neste ensaio de ligação ao MHC dois. Fragmentos peptídicos da beta-lactamase com esses 15 resíduos foram sintetizados quimicamente de modo que epítopos putativos do MHC dois com nove aminoácidos estivessem inseridos dentro dos fragmentos proteicos sintéticos. A capacidade desses peptídeos sintéticos de competir com um peptídeo controle biotinilado da proteína básica da mielina B pela ligação ao MHC dois DRB 1 15 0 1 foi então analisada conforme demonstrado anteriormente.

As curvas de ligação competitiva para os peptídeos sintéticos são ilustradas aqui. Os valores de IC50 foram calculados ajustando os dados transformados em log utilizando a função de ajuste não linear de ligação competitiva de um sítio do Prism. Conforme demonstrado na tabela e observado no gráfico, os peptídeos se dividiram naturalmente em três grupos: ligantes fortes com IC50 inferior a um micromolar, ligantes moderados com IC50 maior ou igual a um micromolar, mas inferior a 100 micromolares, e ligantes fracos com IC50 maior ou igual a 100 micromolares. Após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores nas áreas de imunologia molecular e design de biofármacos explorarem mais plenamente os eventos-chave de reconhecimento molecular que sustentam as respostas imunes anti proteína em pacientes humanos.