Name: Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-25T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda a quantificar a ligação de peptídeos a proteínas MHC II humanas usando ensaios de alta vazão em placas de 384 poços. Este método acelera a identificação de epítopos imunogênicos para desenvolvimento de vacinas.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-GM-098977 e R21-AI-098122 a CBK e KEG. RSS foi apoiado em parte por uma Luce Foundation Fellowship e, em parte, por um Fellowship Thayer Programa de Inovação da Escola de Engenharia Thayer.

Quatro principais atividades compreendem o ensaio de ligação peptídeo-MHC II: 1-Encadernação: peptídeos de teste competir com peptídeos de controle marcados para a ligação fase de solução de proteínas MHC II solúveis. A ligação é medida ao longo de uma vasta gama de concentrações de péptidos de teste. 2-Captura: Após a reacção de ligação se aproxima do equilíbrio, complexos de péptido-MHC II são capturadas e separadas a partir do péptido não ligado e proteína de reconhecimento dependente da conformação com um anticorpo imobilizado. 3-Detecção: capturado péptido de controlo é quantitativamente detectados utilizando a fluorescência resolvida no tempo. 4-Análise: Os dados espectroscópicos são processados, traçados e analisados ​​para determinar as propriedades de ligação dependente da dose de péptido de teste e proteínas do MHC II. Em vários passos no procedimento abaixo, a utilização de um robô de manipulação líquido é recomendada quando se está disponível. Particularmente em um formato de 384 poços, de distribuição automatizada e diluição de líquidos minimiza erros de utilizador, os resultados em maisconsistentes bem aos poços volumes, e produz mais estreitos intervalos de confiança de 95% para os valores de IC50 em comparação com ensaios manuais de 96 poços (dados não mostrados). Se um robô de manipulação de líquidos não estiver disponível, os passos anotados com &quot;(líquido manipulação robô)&quot; pode ser feito à mão. Do mesmo modo, se possível, um lavador automático de placas, que é compatível com o formato de 384 poços é recomendado. Isso efetivamente padroniza o processo de lavagem da placa. Se uma anilha de chapa não está disponível, as etapas anotados com &quot;(placa de lavagem)&quot; pode ser feito à mão. 1. Cubra a placa ELISA (Dia 1) <ol><li> Dilui-se anticorpo L243 estoque (0,5 mg / ml) em tampão borato a uma concentração de trabalho de 10 ug / ml. <ol><li> Para revestir uma única placa de 384 poços, adicione 200 mL de anticorpo estoque para 9,8 ml de tampão borato. (Veja calculadora planilha complementar para o dimensionamento alternativa). </li></ol></li><li> Adicionar 25 ul da solução do anticorpo L243 a cada poço de um 384-well alta de ligação placa ELISA branco. (Manipulação de líquidos robô) </li><li> Selar a placa com uma película de poliéster e incubar durante a noite a 4 ° C. Nota: Cada placa de ELISA de 384 poços podem acomodar até 15 péptidos de teste em oito diluições para um alelo de MHC II, bem como os controlos positivos e negativos. Isto vai dar finalmente medições em triplicado. </li></ol> 2. Adicione o teste de peptídeo diluições (Dia 1) <ol><li> Começando com um estoque de 10 mM de cada péptido de teste em DMSO, fazer a seguinte diluição em série em tampão de citrato-fosfato, utilizando placas de polipropileno de 384 cavidades (Tabela 1). (Manipulação de líquidos robô) Nota: Um prato cheio de polipropileno de 384 cavidades requer três placas de ELISA separados. Um terço de uma placa de polipropileno, exigirão apenas uma placa de ELISA (Figura 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"> Número de diluição </td><td> Volume to tirar de diluição / estoque antes </td><td> Volume de tampão citrato para adicionar </td><td> Conc. de diluição </td><td> Conc. na reação de ligação </td><td> Conc. em Neutralized ELISA </td></tr><tr><td> (Ul) </td><td> (Ul) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td><td> (UM) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 0,7 </td><td> 35.1 </td><td> 195,531 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 14,3 </td><td> 14,3 </td><td> 97,765 </td><td> 48,883 </td><td> 24,441 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 19,389 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 14,3 </td><td> 14,3 </td><td> 9,695 </td><td> 4,847 </td><td> 2.424 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 1.923 </td><td> 0,961 </td><td> 0,481 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 14,3 </td><td> 14,3 </td><td> 0,961 </td><td> 0,481 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 7.1 </td><td> 28,7 </td><td> 0,191 </td><td> 0,095 </td><td> 0,048 </td></tr><tr><td> 8 </td><td> 14,3 </td><td> 14,3 </td><td> 0,095 </td><td> 0,048 </td><td> 0,024 </td></tr><tr><td colspan="6"> Remova e descarte 7.1 ml de solução de peptídeo a partir do número de diluição 8. </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Preparação do péptido teste da série de diluição. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51308/51308fig1.jpg" /> Figura 1. Placa Mapa do péptido Ensaio de Ligação. (A) Mapa das diluições de peptídeos em placas de polipropileno de 384 cavidades. Cada placa de polipropileno pode acomodar três grupos de 15 peptídeos nas reações de ligação da competição contra a cantar<html> le alelo MHC II. (B) Depois de a reacção de ligação se aproxima do equilíbrio, cada grupo de péptidos são transferidos, em triplicado, numa placa de 384 poços de ELISA separado que foi pré-revestido com um anticorpo anti-MHC de classe II. 3. Prepare o MHC II Master Mix (Dia 1) <ol><li> Faça o Tampão de reacção <ol><li> Adicionar 80 ul de 1 mM PEFA bloco e 60 mg de octil-β-D-glucopyranaside a 3920 ul de tampão fosfato citrato. (Veja calculadora planilha complementar para o dimensionamento alternativa). </li></ol></li><li> Diluir as soluções de selecionados MHC II a 101 nm de Tampão de Reacção usando um tubo de 15 ml (Tabela 2). Nota: concentração de MHC II será finalmente de 50 nM na reacção de ligação e 25 nM no ensaio ELISA neutralizado. As concentrações de amostra de MHC II irá variar de acordo com o número do lote do fabricante. (Veja calculadora planilha suplementar). </li></ol>&quot;&gt; <tbody><tr><td> MHC da classe II de alelos DRB1 *: </td><td> 1501 </td></tr><tr><td> II do MHC da Concentração (mg / ml) </td><td> 1.3 </td></tr><tr><td> II do MHC da Concentração (mM) </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Vol. II MHC Para adicionar (ml) </td><td> 14.65 </td></tr><tr><td> Vol. Tampão de reacção para adicionar (ml): </td><td> 2.885,35 </td></tr><tr><td> MHC II Mistura Concentração (nM) </td><td> 101 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Preparação de mistura principal MHC II. 4. Prepare os controles negativo e positivo (dia 1) <ol><li> Adicionar 21.5 ul de tampão fosfato citrato para o &quot;controlo negativo&quot; poço da placa de polipropileno de 384 cavidades a partir do passo 2.1 (Figura 1A). </li><li> Adicionar 21.5 ul de tampão fosfato citrato para o &quot;controlo positivo&quot; poço da placa de polipropileno de 384 cavidades. Nota: a &quot;posiçãocontrole tiva &quot;será concluída na seção 5, a seguir. </li><li> Remover 49,5 mL da MHC II Master Mix a partir do passo 3.2 e pipeta para um tubo de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Adicionar 0,5 mL de tampão citrato para os 49,5 mL do MHC II Master Mix a partir do passo 4.3. </li><li> Adicionar 21.5 ul de concentração ajustada MHC II Mistura do passo 4.4 para o &quot;controlo negativo&quot; poço da placa de polipropileno de 384 cavidades (Figura 1A). Nota: esta amostra representa o controle negativo do sinal de zero que contém proteína MHC II, NO peptídeo controle, e NÃO peptídeo teste. </li></ol> 5. Adicionar a um controlo adequado Peptide ao MHC II Master Mix (Dia 1) <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> MHC da classe II de alelos DRB1 * </td><td> Biotinylated Controle Peptide </td><td> (Resíduos) </td><td> Seqüência </td></tr><tr><td> 0101 </td><td> Flu-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx) PRYVKQNTLKLAT-amida </td></tr><tr><td> 0301 </td><td> A mioglobina </td><td> (137-148) </td><td> Biotina-(Ahx) - (Ahx)-OH-LFRKDIAAKYKE </td></tr><tr><td> 0401 </td><td> YAR-B </td><td> (1-14) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH YARFQSQTTLKQKT </td></tr><tr><td> 0701 </td><td> TetTox-B </td><td> (830-843) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH QYIKANSKFIGITE </td></tr><tr><td> 1101 </td><td> Flu-HA-B </td><td> (306-318) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx)-amida PRYVKQNTLKLAT </td></tr><tr><td> 1501 </td><td> MBP-B </td><td> (84-102) </td><td> Biotina-(Ahx) (Ahx)-OH NPVVHFFKNIVTPRTPPPS </td></tr></tbody></table> * Recomendamos 10 mg escala encomendar para a economia. Tabela 3. Peptídeos de controle para diversas MHC II alelos. * <ol><li> Dilui-se o péptido de controlo (armazenada a 400 uM em DMSO) a 1:20 em DMSO fresco para produzir um estoque diluído a 20 uM. <ol><li> Adicionar 25 uL de 400 uM de péptido de controle475 ul de DMSO. Nota: este é um grande excesso, mas permite uma manipulação precisa de soluções em DMSO viscosos. </li></ol></li><li> Além disso diluir o Peptídeo de Controle do passo 5.1 (20 mM) de 1:100 para o MHC II Master Mix a partir do passo 3.2. <ol><li> Adicionar 28.8 ul de Controlo Peptide diluídas no passo 5.2 para os restantes 2,850.5 ul de MHC II Master Mix. </li></ol></li><li> Adicionar 21.5 ul de MHC II Master Mix com o péptido de controlo (passo 5.2) para o poço de controlo positivo da placa de polipropileno de 384 cavidades (passo 4.2) (Figura 1A). Nota: esta amostra representa o controle positivo de alto sinal contendo proteína MHC II, peptídeo controle, e NÃO peptídeo teste. </li></ol> 6. Faça a reação de ligação (Dia 1) <ol><li> Adicionar a mistura padrão de MHC II contendo Controlo Péptido (passo 5.2), para cada uma das diluições de teste peptídicos (passo 2.1) em uma proporção de 1:1 para criar a reacção de ligação. <ol><li> Adicionar 21,5 mL de MHC II Master Mix contendo Control peptídeo do passo 5,2-21,5 ul de cada diluição de teste com peptídeo do passo 2.1. (Manipulação de líquidos robô) </li></ol></li><li> Selar a reacção de ligação com um filme de poliéster e incubar 12-24 horas em um não-CO 2 incubador controlado a 37 ° C sem agitação. </li></ol> 7. Neutralizar e transferir a reação de ligação (dia 2) <ol><li> Remova a placa de polipropileno de 384 cavidades contendo a reacção de ligação (passo 6.2) da incubadora a 37 ° C. </li><li> Diluir a 1:01 reação de ligação com Neutralização Buffer. (Manipulação de líquidos robô) <ol><li> Adicionar 43 mL do tampão de neutralização para cada reacção de ligação bem. </li></ol></li><li> Remova a placa de ELISA (passo 1.3) a partir de 4 ° C e lavar 3x com 60 mL / poço de PBS-Tween 20 0,05%. (Lavadora) </li><li> Transferir 25 uL de cada reacção de ligação neutralizada do passo 7.2 em poços em triplicado de a placa revestida de anticorpo de 384 poços de ELISA a partir do passo 7.3. (Figura 1 </strong&gt;) (líquido manuseio robô) </li><li> Cobrir a placa de ELISA com uma película de poliéster e, em lugar de uma incubadora a 37 ° C durante 2,5 horas ou num frigorífico a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 8. Desenvolvimento de ELISA (Dia 2 ou 3) <ol><li> Remova a placa de ELISA a partir do passo 7.5, lava-se 3 vezes com 60 ul / poço de PBS-Tween a 0,05%. (Lavadora) </li><li> Diluir solução Estreptavidina-európio estoque (0,1 mg / ml de estreptavidina, 7 Eu 3 + / estreptavidina) 1000 vezes no tampão de ensaio de DELFIA. <ol><li> Para uma placa de 384 poços, diluem-se 10 ul de estreptavidina-európio, em 10 ml de Tampão de Ensaio. </li></ol></li><li> Adicionar 25 ul da diluído Estreptavidina-európio a cada poço da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.1. (Manipulação de líquidos robô) </li><li> Cobrir a placa com uma película de poliéster e lugar no escuro e à temperatura ambiente durante 1 hora. Nota: Durante a incubação de 1 hora, retire a solução Aperfeiçoamento da geladeira e reserve 10 ml / placa no escuro a rotemperatura om. </li><li> A seguir à incubação de 1 h, lavar a placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.3 3x com 60 ul / poço de PBS-Tween a 0,05%. (Lavadora) </li><li> Adicionar 25 ul de solução de melhoria para cada poço da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.5. (Manipulação de líquidos robô) </li><li> Cobrir a placa ELISA de 384 poços com um filme de poliéster e permitir que a placa de sentar-se no escuro à temperatura ambiente por 10-15 min. </li><li> Após a incubação de 10-15 min, ler a fluorescência da placa de 384 poços de ELISA a partir do passo 8.7 utilizando um leitor fluorescente resolvida no tempo com as configurações de placa de európio (por exemplo, Start Int.: 200, Pare Int.:. 1,000, Ex 340, Em . 615, Cutoff: Nenhum, PMT: Auto, Lê / Bem: 50). </li></ol> 9. Análise de Dados <ol><li> Insira os dados em formato de gráfico XY com 3 valores replicar em colunas lado a lado (X = teste de concentração peptídeo; Y = medição de fluorescência). </li><li> Entrar transformar os valores de X para todos os dados: X = log (X) </li><li> Coloque os tra lognsformed dados com o modelo de ligação competitiva de um local para extrair o valor de IC 50. </li><li> Restringir o valor inferior ao valor médio de controlo negativo. </li><li> Globalmente ajustar o valor superior e assegurar que o parâmetro global ajuste é inferior ou igual ao do controlo positivo. </li></ol>

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<li>Parker, A. S., Griswold, K. E., Bailey-Kellogg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+therapeutic+proteins+to+delete+T-cell+epitopes+while+maintaining+beneficial+residue+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bioinform.+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimization of therapeutic proteins to delete T-cell epitopes while maintaining beneficial residue interactions.</a> J. Bioinform. Comput. Biol. 9, 207-229 (2011).</li>
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</ol>

Leonard Moise é empregado por e possui opções de ações em EpiVax, Inc., uma empresa de biotecnologia de propriedade privada localizada em Providence, RI. O trabalho contidas neste relatório de pesquisa é livre de qualquer preconceito que possa ser associada com as metas comerciais da empresa.

Biotherapeutics se estabeleceram como um dos pilares da medicina moderna, o que representa quatro dos cinco melhores vendendo drogas em 2012 32. O setor biopharmaceutics tem mostrado um crescimento sustentado por vários anos 6, eo desenvolvimento contínuo de novos agentes, bem como o surgimento de biossimilares ampliou pipelines biofarmacêutica. Olhando para o futuro, avaliar e mitigar a imunogenicidade de proteínas terapêuticas vai se tornar parte integrante da fase inicial de desenvolvimento biot...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.
Step 3.1.1 in the Protocol was updated from:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 mg of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
to:
Add 80 &#181;l of 1 mM Pefa Bloc and 60 &#181;g of octyl-&#946;-D-glucopyranaside to 3,920 &#181;l of Citrate Phosphate Buffer. (See supplemental spreadsheet calculator for alternative scaling).
Step 5.2&#160;in the Protocol was updated from:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 mM) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
to:
Further dilute the Control Peptide from step 5.1 (20 &#181;M) 1:100 into the MHC II Master Mix from step 3.2.
Table 2 was updated from:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mM)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (ml)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (ml):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
to:
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="376">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MHC II Allele DRB1*:</td>
			<td>1501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (mg/ml)</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Stock Concentration (&#956;M)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. MHC II Stock to Add (&#956;l)</td>
			<td>14.65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vol. Reaction Buffer to Add (&#956;l):</td>
			<td>2885.35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHC II Master Mix Concentration (nM)</td>
			<td>101</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/51308/a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis">A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes</a>.&#160; There were typos in the Protocol section and Table 2.

Erratum: A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

As proteínas são a classe que mais cresce de agentes terapêuticos 6, e da rápida expansão de dutos bioterapêuticos tem se concentrado cada vez mais atenção sobre os desafios associados com o desenvolvimento e uso de drogas de proteína. Uma consideração única deriva do facto de que, em um sistema imunitário saudável e funcionamento, todas as proteínas extracelulares são recolhidos por células apresentadoras de antígenos (APCs). Uma vez internalizado por APCs, uma proteína é clivada em fragmentos de péptidos pequenos, e segmentos imunogénicas putativos são carregados para dentro da ranhura de classe II principais proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHC II). Os complexos de péptido-MHC II são, então, exibidos na superfície da APC, e os verdadeiros péptidos imunogénicos, denominados epitopos de células T, receptores de células formar complexos ternários II do MHC-peptídeo T-CD4 com receptores da superfície celular cognato 7. Este evento crítico reconhecimento molecular inicia uma cascata de sinalização complexo, que resulta na activação de células T, a libertação de citocinas, a maturação de células B mediada por células T CD4 e, finalmente, a produção de anticorpos IgG circulantes que se ligam e limpar a proteína exógena ofensivo. Assim, as proteínas imunogénicas pode ser deimmunized por identificar epitopos de células T constituintes e mutando resíduos chave responsáveis ​​pela formação de complexos MHC II. Vale a pena notar, no entanto, que os epitopos de células T podem ser numerosas e amplamente distribuídos em todo proteínas imunogénicas, e a maioria das mutações-exclusão de epitopo são susceptíveis de provocar uma perda inadvertida da função da proteína ou estabilidade. Portanto, engenharia deimmunized bioterapias pode ser um objetivo complexo e tecnicamente difícil, mas existem vários exemplos de sucesso T epitopos de células projetos de eliminação 3,5,8-12. Ao contrário à base de enxerto de &quot;humanização&quot;, o qual é restrita a terapêutica do anticorpo, epitopo deleção pode ser aplicado a essencialmente qualquer proteína alvo, independentemente da sequência, estrutura, função ou disponibilidade de homólogonos andaimes humanos. O primeiro passo para implementar tal abordagem é a identificação de epítopos peptídicos principais incorporados dentro da sequência da proteína alvo. Alto rendimento ensaios bioquímicos, utilizando peptídeos sintéticos e moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidas idéias preliminares para identificação e mitigação epítopo 1,3-5. Estes ensaios do tipo ELISA pode ser um poderoso complemento de outros design e desenvolvimento de ferramentas de proteína / vacinas. Por exemplo, uma bem estabelecida abordagem experimental para mapeamento de epítopos depende de tempo, trabalho e recursos intensivos ex vivo ensaios de proliferação celular 15. Resumidamente, a sequência primária de uma proteína-alvo é primeiramente dividido em um painel de péptidos que se sobrepõem, muitas vezes de 15-meros com 12 resíduos de sobreposição entre os péptidos adjacentes. O painel de péptidos quimicamente sintetizados e a imunogenicidade de cada peptídeo é testado em um de vários imunoensaios diferentes que empregam bloo periféricaAs células mononucleares de d (PBMC) isoladas a partir de dadores humanos 13,14. Para proporcionar uma maior confiança nos resultados, os peptídeos são normalmente testadas em replicar com PBMC de 50 ou mais doadores diferentes. Nos casos em que deimmunization é o objetivo final, o trabalho é agravado ainda mais pela necessidade de produzir painéis adicionais de peptídeos mutantes e testar os novos painéis de peptídeos em ensaios de PBMC antes de introduzir quaisquer mutações deimmunizing na proteína de comprimento total para a análise funcional posterior 10. Embora estes ensaios celulares continuam a ser o padrão-ouro para avaliar o potencial imunogênico em pacientes humanos, a eficiência de uma abordagem exaustiva pode ser melhorada através de pré-filtragem epítopos imunogênicos putativos usando uma rápida e alta taxa de transferência ensaio de ligação MHC II-peptídeo. Da mesma forma, os ensaios de ligação bioquímicas péptido-MHC II pode ser combinado com métodos de previsão em silico para acelerar o processo de identificação radicalmente epitopo.Existem uma variedade de ferramentas computacionais para a predição epitopo de célula T; exemplos incluem ProPred 16, MHCPred 17, SVRMHC 18, ARB 19, SMM-alinhar 20, NetMHCIIpan 21, bem como ferramentas proprietárias, como EpiMatrix por EpiVax 22. Da mesma forma, os preditores de epítopos foram recentemente combinada com outras ferramentas de bioinformática e modelagem molecular para produzir algoritmos deimmunization proteína integrados projetados para reduzir o risco de que as mutações deimmunizing pode afectar a estrutura e função da proteína 23-26. Enquanto vários preditores epitopos têm provado ser razoavelmente precisa 27,28, resultados computacionais invariavelmente necessitam de validação experimental. Rápido, alto rendimento, e de baixo custo métodos experimentais são mais adequados como um filtro preliminar no previsões epítopos silico. Na mesma linha, os preditores de epítopos pode dirigir seleção antígeno para vaccinolo reversagy 29,30. Por exemplo, os avanços em bioinformática produziram telas genoma inteiro que identifica rapidamente os candidatos de vacina sob a forma de proteínas inteiras ou epitopos peptídicos extraídos do proteoma dos agentes patogénicos. Embora esta tecnologia capacitadora está reformulando a descoberta e desenvolvimento de vacinas protetoras, introduz um novo desafio na forma de intratável grandes listas de candidatos a vacinas imunogênicas. Ensaios de ligação alta capacidade peptídeo-MHC II podem orientar a seleção epítopo quantificando afinidade de ligação de peptídeos e promiscuidade de ligação entre alelos múltiplos MHC II. Tal como acontece com deimmunization proteína, tais métodos experimentais são em última instância é necessária para validar previsão computacional de ligações vacina promissora. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II em escala para o formato de 384 poços é descrito. O protocolo é altamente paralelizado e reduz o custo dos reagentes por 75% em relação ao anteriormente descrito 96 cavidades formatos de placa 1,3-5. Usando um único liquid manuseamento robô, este método permite que um investigador para analisar facilmente aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Este artigo descreve a configuração de uma placa de 384 poços de ELISA para análise de sete péptidos experimentais contra um alelo de MHC II, mas calculadoras folha distribuídos são fornecidos como material suplementar, de modo a dimensionar facilmente o experimento de qualquer número de péptidos e / ou MHC desejadas moléculas II.

<table><tbody><tr><td>Tetraborato de sódio decahidratado</td><td>Sigma</td><td>221732</td><td></td></tr><tr><td>ácido cítrico</td><td>Sigma</td><td>C1901</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>OmniPur</td><td>9310</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>100% DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Octyl-& beta;-D-Glucopyranaside</td><td>Fischer</td><td>29836-26-8</td><td></td></tr><tr><td>Pefa Bloc SCF</td><td>Roche</td><td>1158591600</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 10x Tampão Salino Tampolado com Fosfato</td><td>Invitrogen</td><td>14200-166</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Ensaio DELFIA</td><td>Perkin Elmer</td><td>4002-0010</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de Aprimoramento DELFIA</td><td>Perkin Elmer</td><td>4001-0010</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina Marcada com Európio</td><td>Perkin Elmer</td><td>1244-360</td><td></td></tr><tr><td>L243 anticorpo anti-HLA-DR</td><td>Biolegend</td><td>307602</td><td></td></tr><tr><td>Biotinilado Peptídeos traçadores</td><td>21st Century Biochemicals</td><td>Pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Peptídeos de teste (1-4 mg, 85% de pureza)</td><td>Genscript</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Monômeros HLA-DRB1 purificados (não biotinilados)</td><td>Benaroya Research Institute*</td><td>Custom Order</td><td></td></tr><tr><td>Placa EIA/RIA branca de 384 poços</td><td>Thermo</td><td>460372</td><td></td></tr><tr><td>Polipropileno 384 poços placa Costar</td><td></td><td>3656</td><td></td></tr><tr><td>Filme, AxySeal, 80 &micro; m, Aplicador ELISA&nbsp;</td><td>Axygen Ascientific</td><td>PCR-SP</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Epimotion Liquid Handler (ou similar)</td><td>Eppendorf</td><td>5075</td><td></td></tr><tr><td>Select TS Plate Washer (ou similar)</td><td>BioTek</td><td>405</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini Microplate Reader (ou similar)</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Moléculas humanas recombinantes de MHC II podem ser obtidas no Benaroya Tetramer Core Laboratory.&nbsp; Veja: https://www.benaroyaresearch.org/our-research/core-resources/tetramer-core-laboratory</td></tr></tbody></table>

um ensaio de ligação de alto rendimento ii do mhc para análise quantitativa de peptide epitopes

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou desenho 1,2. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II é dimensionado para o formato de 384 poços. O protocolo reduzida reduz o custo dos reagentes de 75% e é mais elevado do que o rendimento descrito anteriormente protocolos de 96 poços 1,3-5. Especificamente, o delineamento experimental permite uma análise robusta e reprodutível de até 15 péptidos contra um alelo de MHC II por 384 poços de placas de ELISA. Utilizando uma única manipulação robô líquido, este método permite que um investigador para analisar aproximadamente noventa péptidos de teste, em triplicado, durante um intervalo de oito concentrações e quatro tipos de alelos do MHC II, em menos de 48 horas. Outros que trabalham nas áreas de deimmunization proteína ou projeto e desenvolvimento de vacinas pode achar o protocolo a ser útil para facilitar o seu próprio trabalho. Em particular, as instruções passo-a-passo eo formato visualde Jove deve permitir que outros usuários para estabelecer de forma rápida e facilmente esta metodologia em seus próprios laboratórios.

A sequência do péptido maduro de Enterobacter cloacae P99 beta-lactamase (BLA) (GenBank ID # X07274.1) foi analisada com ProPred 16 por ligantes peptídicos putativos para MHC II alelo DRB1 * 1501 (Tabela 4). ProPred identificado 117 peptídeos nonâmero com um resíduo P1 âncora obrigatória (isto é, uma M, L, I, V, F, Y ou W na posição 1, que é necessária para MHC II 31 de ligação). Em um limiar de 5%, apenas peptídeos com pontuação maior ou igual a 2,6 são ligantes ...

Ensaios bioquímicos com moléculas recombinantes humanos MHC II pode proporcionar rápidos, insights quantitativos em identificação epítopo imunogênico, exclusão ou design. Aqui, um ensaio de ligação ao péptido de MHC-II dimensionado para placas de 384 poços é descrito. Este formato de baixo custo deve ser útil nos campos da deimmunization proteína e design e desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar a ligação de peptídeos curtos com proteínas imunes do MHC humano tipo dois, utilizando um ensaio de alta produtividade em placas de 384 poços. Isso é realizado primeiramente por meio de ensaios de ligação por competição em fase líquida com os peptídeos de interesse. Na segunda etapa, os complexos de peptídeo-MHC tipo dois em equilíbrio são capturados por um anticorpo anti-MHC tipo dois imobilizado em placas ELIZA de alta ligação.Em seguida, os complexos capturados são incubados com estreptavidina marcada com opiáceo e, então, a estreptavidina não ligada é removida por lavagem e o opiáceo capturado é ativado. Por fim, a fluorometria com resolução temporal pode ser utilizada para quantificar os níveis do peptídeo controle MHC dois capturado. Este método pode fornecer insights preliminares sobre o potencial imunogênico de proteínas-alvo.É particularmente útil para validar a saída de preditores in silico, inicie o procedimento adicionando 25 microlitros de solução de anticorpo L 2 43 recém-diluída a cada poço de uma placa ELIZA branca de alta ligação com 3 84 poços. Sobreponha a placa com um filme de poliéster e incube-a durante a noite

a-high-throughput-mhc-ii-binding-assay-for-quantitative-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve o uso de péptido: MHC tetrâmeros e microesferas magnéticas para isolar populações de baixa frequência de células T específicas para epitopo e analisá-las por citometria de fluxo. Este método permite o estudo direto de endógenos populações de células T de interesse...

Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

Este vídeo demonstra uma técnica que aplica a tecnologia de microarray de peptídeos para traçar o perfil da especificidade dos anticorpos que reconhecem modificações pós-traducionais (PTMs) em peptídeos de histonas. Uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas conjugados com fluoróforo imobilizado com combinações conhecidas de PTM é tratada com anticorpos específicos de PTM alvo. Esse processo ajuda a identificar a especificidade do anticorpo para o alvo e sua potencial reatividade...

Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

Aqui, descrevemos métodos que comumente empregamos em laboratório para determinar como a natureza da interação entre o receptor de células T e os antígenos tumorais, apresentada por antígenos leucocitários humanos, governa a funcionalidade das células T; esses métodos incluem produção de proteínas, cristalografia de raios-X, biofísica e experimentos funcionais de células T.

Usando cristalografia de raios X, Biofísica, e os ensaios funcionais para determinar a célula T mecanismos que regem o reconhecimento do receptor de Câncer Antígenos

Aqui, descrevemos um ensaio cromatográfico, juntamente com a separação de mobilidade do íon de precursores de peptídeo seguido de alta resolução (~ 30.000) MS-detecção de fragmentos de peptídeo para a quantificação dos padrões de peptídeo cravado em um anticorpo monoclonal digerir.

Um ensaio de HS-MRM para a quantificação de proteínas de célula hospedeira em biofármacos de proteínas por espectrometria de massa líquida cromatografia iônica mobilidade QTOF

Aqui, os autores apresentam um protocolo simples e eficiente para definir um epítopo antigênico linear usando um anticorpo monoclonal purificado e varredura peptídica por meio de hibridização dot-blot. O epítopo identificado pode então ser usado em aplicações terapêuticas e diagnósticas.

Identificação de um epítopo de célula B linear Monoclonal Antibody-péptido reconhecido Digitalização-assistida

Biopanning bacteriana exibir bibliotecas é uma técnica comprovada para a descoberta dos reagentes de afinidade do peptide, uma alternativa robusta para anticorpos. O método de classificação semi-automatizadas aqui simplificou biopanning para diminuir a ocorrência de falsos positivos. Aqui ilustramos o processo de pensamento e técnicas aplicadas na avaliação de candidatos e minimizando a análise a jusante.

Biopanning semi-automático de exibição bacteriana bibliotecas para peptídeo afinidade reagente descoberta e análise dos isolados resultantes

QA-1 (HLA-E em humanos) pertence a um grupo de moléculas de 1b complexo principal de histocompatibilidade não-clássica. Imunização com resumos de Qa-1-ligação foi mostrada para aumentar o tecido-específica Regulamento imune e amenizar várias doenças auto-imunes. Neste documento descrevemos uma estratégia de biblioteca de peptídeo sobreposição para a identificação de epitopos de Qa-1 em uma proteína.

Biblioteca de peptídeo sobreposição para mapear os resumos de Qa-1 em uma proteína

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

Quantificação simultânea de vetor anti e Antiespecíficas do transgene CD8+ T células Via MHC tetrâmero coloração após a vacinação com um vetor Viral

Com base em uma matriz de peptídeos derivadas do vírus da hepatite B (HBV), as respostas de células T CD4 específicas do HBV poderiam ser avaliadas em paralelo com a identificação de epítopos de células T CD4 específicas do HBV.

Análise das respostas e identificação de epítopos de células T T específicas do HBV com base em uma matriz de peptídeos

Aqui, apresentamos um protocolo para a purificação dos complexos de peptídeos classe I e CLASSE II da classe I, fornecendo dados de imunopeptidomias de alta qualidade. O protocolo se concentra na preparação da amostra usando anticorpos disponíveis comercialmente.

Imunopeptidomics: Isolamento de Peptídeos MHS de classe I e II associados para análise de espectrometria de massa

Aprenda a quantificar a ligação de peptídeos a proteínas MHC II humanas usando ensaios de alta vazão em placas de 384 poços. Este método acelera a identificação de epítopos imunogênicos para desenvolvimento de vacinas.

Um Ensaio de Ligação de Alto Rendimento II do MHC para análise quantitativa de Peptide Epitopes

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