Uma tecnologia de microarray de peptídeos para perfis de especificidade de anticorpos

Pegue uma lâmina de microarray contendo peptídeos de histonas com modificações pós-traducionais alvo e não-alvo ou PTMs.

Os peptídeos são imobilizados via biotina conjugada em pontos específicos da lâmina de vidro funcionalizada com estreptavidina.

As manchas também contêm um fluoróforo verde conjugado com biotina imobilizado, facilitando a identificação das manchas.

Introduzir um tampão de bloqueio, evitando a interação inespecífica de anticorpos.

Remova o tampão e centrifugue para secar a lâmina.

Dentro de uma impressora de cera, borda a matriz com cera.

Equilibre a matriz com um buffer de hibridização.

Incubar com os anticorpos primários específicos para um PTM alvo.

Introduza anticorpos secundários conjugados com fluoróforo vermelho que se ligam aos anticorpos primários.

Remova os anticorpos não ligados e centrifugue para secar a lâmina.

Visualize a lâmina usando um scanner de microarray. A fluorescência verde ajuda a identificar as manchas, enquanto a fluorescência vermelha indica interação PTM-anticorpo, demonstrando especificidade de anticorpos.

O reconhecimento do PTM alvo demonstra especificidade de anticorpos, enquanto o reconhecimento de PTMs não-alvo indica reatividade cruzada de anticorpos.

Guiado pelo mapa da placa de origem, carregue de 1 a 2 microlitros de cada característica peptídica nos poços designados de uma ou mais placas de pequeno volume de 384 poços. Dilua cada recurso dez vezes com 1x tampão de impressão de microarray de proteína, suplementado com albumina de soro bovino a 1% e 5 microgramas por microlitro de biotina marcada com fluoresceína. Em seguida, centrifugue as placas a 500 vezes g à temperatura ambiente por 2 minutos. Em seguida, esvazie o recipiente de resíduos da impressora de microarray. Encha a solução de lavagem em recipientes umidificadores com água destilada estéril. Insira os parâmetros do slide da matriz no software da impressora microarray.

Defina o procedimento de lavagem para uma lavagem de 1 segundo com uma única imersão, a pós-lavagem para recortar os pinos cinco vezes e a umidade para 60%. Em seguida, insira lâminas de vidro revestidas com estreptavidina nas placas do substrato. Carregue as placas no elevador de placas. Insira as placas de origem nos suportes de placa e carregue os suportes no elevador de placa de origem. Execute o processo de impressão.

Em seguida, remova as placas do substrato do instrumento. Bloqueie as lâminas impressas com 1x tampão de bloqueio de microarray de proteína por 30 minutos enquanto agita. Em seguida, lave as lâminas em solução salina tamponada com fosfato pH 7,6 em temperatura ambiente por 10 minutos. Repita a lavagem com um novo lote de PBS. Seque as lâminas por centrifugação durante 30 segundos à temperatura ambiente.

Em seguida, pré-aqueça uma impressora de cera de microarray a 85 graus Celsius por 30 minutos ou até que a cera derreta. Em seguida, insira uma lâmina, com o lado impresso voltado para baixo, no suporte e alinhe o suporte com o molde da impressão. Coloque o molde em contato com a lâmina e segure por dois segundos. Em seguida, remova rapidamente a lâmina do suporte e inspecione as bordas de cera para verificar se as matrizes estão devidamente fechadas. Armazene as lâminas particionadas a 4 graus Celsius em uma área seca e escura.

Para iniciar o procedimento de hibridização, coloque uma lâmina de matriz particionada em um prato de plástico e cubra a lâmina com tampão de hibridização. Equilibre o slide por 30 minutos a 4 graus Celsius enquanto agita em baixa velocidade. Seque a lâmina girando em uma centrífuga de lâmina de microarray à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 5 microlitros de cada solução de anticorpo PTM de histona a pelo menos dois poços da matriz e incube a 4 graus Celsius por uma hora.

Após a incubação, remova a solução de anticorpos e lave a matriz com PBS frio três vezes, por 5 minutos cada, a 4 graus Celsius. Em seguida, incube a matriz em uma solução de anticorpo secundário conjugado com corante fluorescente por 30 minutos a 4 graus Celsius, na ausência de luz. Lave a lâmina três vezes com PBS frio como antes.

Mergulhe a matriz em temperatura ambiente 0,1x PBS para remover o excesso de sais e seque a lâmina por centrifugação breve em temperatura ambiente. Visualize a lâmina com um scanner de microarray com uma resolução de pelo menos 25 mícrons.