Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais
25 de fevereiro de 2014
Para entender a estrutura das redes neuronais, caracterização funcional e morfológica de neurônios individuais é uma necessidade. Aqui, nós demonstramos rotulagem juxtasomal biocitina, que permite que registros eletrofisiológicos na configuração extracelular, mas mantendo a capacidade de rotular intracelular do neurônio para a reconstrução post hoc de dendrítica e arquitetura axonal.
O objetivo geral deste procedimento é associar a atividade de disparo de potenciais de ação específicos de tipo celular na córtex sensorial durante o processamento de informações à identidade morfológica dos neurônios registrados. Isso é realizado primeiramente preparando cirurgicamente a rata para gravações juxta-somáticas. Uma vez preparada, um eletrodo registra atividade espontânea e evocada por estímulos sensoriais, e o neurônio registrado é carregado com biocitina por meio de corrente e injeções.
Posteriormente, o cérebro é processado para coloração com biotina. Por fim, o neurônio preenchido com biotina é reconstruído digitalmente a partir de seções subsequentes para a classificação do tipo celular. Em última instância, gravações juxtasomáticas de neurônios individuais permitem o estudo do processamento sensorial e das informações estruturais dentro da rede cortical.
Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na neurociência, como qual é o papel de tipos celulares individuais e camadas durante o processamento sensorial? Geralmente, indivíduos que precisam deste método enfrentarão dificuldades porque é muito fácil matar neurônios durante o procedimento de preenchimento. As chances de sucesso no preenchimento com biocidina aumentam com o preparo de pipetas de qualidade ideal e, adicionalmente, é necessária uma visão treinada para controlar as injeções de corrente de banda estreita.
Portanto, é necessária experiência para aumentar a taxa de sucesso na recuperação de neurônios bem preenchidos. Para começar, posicione uma rata Wistar anestesiada em um estereotáxico equipado com um tapete aquecido. Confirme a profundidade da sedação testando o reflexo de preensão do dedo do pé.
Em seguida, insira uma sonda retal para manter a temperatura corporal correta. Imobilize a cabeça do animal e remova os pelos do local cirúrgico. Aplique pomada nos olhos para prevenir ressecamento.
Aguarde de três a cinco minutos após a injeção de lidocaína no local da operação e remova a pele que recobre a superfície do crânio. Em seguida, retire qualquer tecido remanescente e limpe minuciosamente o crânio com cloreto de sódio 0,9%. Determine as coordenadas para o córtex somatossensorial primário no hemisfério esquerdo e marque a localização no crânio com uma caneta cirúrgica para marcação da pele.
Use uma broca dentária para raspar o osso da região de interesse. Continue raspando o osso até que ele se torne transparente e os vasos sanguíneos fiquem claramente visíveis. Em seguida, corte uma pequena janela no crânio fino com um bisturi.
Tendo cuidado para não danificar a dura-máter e os vasos sanguíneos. Marque as bordas da craniotomia usando uma caneta cirúrgica para marcação da pele. Para melhorar a visibilidade, aplique uma camada fina de cola instantânea sobre o crânio seco e, em seguida, cimento dental para construir um reservatório.
Ao fechar a craniotomia, corte os vibrissas no lado contralateral exatamente até cinco milímetros para facilitar sua visualização. Realce as vibrissas cortadas com rímel preto antes de iniciar as gravações; faça pipetas de patch a partir de vidro de borosilicato. A morfologia ideal da pipeta é um afunilamento esbelto e gradual, um ângulo cônico baixo e um diâmetro interno da ponta de aproximadamente um mícron.
Carregue a pipeta de patch com ringer normal para rad, suplementado com 2% de biotina, e monte a pipeta de patch em um suporte para pipeta, fixado a uma etapa de cabeça, e conectado a um micromanipulador. Para direcionar especificamente a coluna D dois do S um do rato, ajuste o ângulo do suporte do eletrodo para 34 graus em relação ao plano sagital. Em seguida, posicione a pipeta de patch em proximidade próxima à craniotomia.
Encha o banho com cloreto de sódio a 0,9%. Com o amplificador em modo de ponte, aplique pulsos quadrados com injeção de corrente positiva para determinar a resistência do eletrodo. A resistência ideal do eletrodo situa-se entre três e cinco mega.
Estabeleça uma pressão superior de 100 a 150 milibares e avance a pipeta de patch em passos de um mícron enquanto aplica corrente positiva na forma de pulsos quadrados. Monitore a mudança acentuada na resistência ao estabelecer contato com a dura-máter. Neste momento, defina as coordenadas do micromanipulador como zero para permitir medidas precisas de profundidade.
Avance em modo de passos de um mícron até que a pipeta de patch penetre na dura-máter, indicado por uma queda súbita na resistência do eletrodo. Remova a pressão de retenção da pipeta. Em seguida, procure unidades individuais enquanto avança em passos de um mícron.
Monitore continuamente a resistência do eletrodo aplicando pulsos de 200 milissegundos ligado-desligado, e o aumento na resistência do eletrodo geralmente indica a proximidade de um neurônio individual; avance o eletrodo até que potenciais de ação positivos com formas de onda de aproximadamente dois milivolts sejam registrados. Opcionalmente, registre a atividade espontânea de disparo e determine a atividade de disparo relacionada aos vibrissas desviando suavemente vibrissas individuais usando um dispositivo piezoelétrico para obter condições ideais para o preenchimento juxtasomal.
Avance o eletrodo até que a resistência esteja entre 25 e 35 megaohms e os picos tenham amplitudes de três a oito milivolts para iniciar o preenchimento juxtasomal. Aplique pulsos de corrente quadrados positivos começando em um nanoampère.
Aumente lentamente e gradualmente a corrente em etapas de 0,1 nanoampère, monitorando a forma de onda e a frequência do potencial de ação. Monitore a abertura da membrana por meio de um aumento evidente na frequência do potencial de ação durante a fase de ligação do pulso de bloqueio; a forma de onda do pico durante o preenchimento mostra uma largura aumentada e hiperpolarização pós-potencial reduzida. Aumente ou diminua a corrente durante o preenchimento para manter uma infusão estável de biotina; reduza ou interrompa os pulsos de corrente diante de um aumento súbito da frequência do potencial de ação, a fim de evitar toxicidade causada pelo excesso de influxo de íons extracelulares, como íons sódio.
É importante observar que cada neurônio responderá de maneira diferente ao procedimento de preenchimento. Portanto, os parâmetros de marcação juxtasomal devem ser ajustados conforme a condição de gravação. Monitore atentamente o sinal após interromper a injeção de corrente.
A forma de onda do potencial de ação após uma sessão de preenchimento geralmente é alargada e apresenta uma pós-hiperpolarização fortemente reduzida, aguardando a recuperação do neurônio, o que é evidente quando a forma de onda do potencial de ação retorna às suas propriedades originais, reduzindo qualquer estresse mecânico à célula. Retraia a pipeta de gravação em etapas de um mícron até que a amplitude do potencial de ação diminua; aguarde pelo menos uma hora para que a biotina difunda-se intracelularmente, monitorando atentamente a temperatura corporal e a respiração do animal. Finalmente, amostras cerebrais são obtidas e processadas para revelar a qualidade da marcação juxtasomal.
Essas imagens mostram neurônios preenchidos juxtamembrana no córtex somatossensorial primário. Esta vista tangencial de um neurônio parametal demonstra a diferença de tamanho entre dendritos e axônios. Nesta reconstrução digital de um neurônio marcado juxta-somali, a imagem da projeção neuronal é mostrada em alta resolução, mas baixa ampliação, com reconstrução digital automatizada sobreposta, axônio em azul e dendrito em vermelho, respectivamente.
Aqui, a região da caixa é ampliada para mostrar o botão axonal ao longo de todo o comprimento do axônio. Nesta animação final, exemplificamos o pipeline de reconstrução para um neurônio parametal espesso e ramificado da camada cinco de córtex somatossensorial primário de rato. O pipeline envolve o reconstrução da morfologia dendrítica e axonal com aumento de 100 vezes e os contornos do barril com aumento de quatro vezes.
O resultado é uma reconstrução tridimensional completa, que posteriormente é registrada em um referencial padronizado para realizar análise quantitativa das características morfológicas. Assim, a marcação juxtasomal in vivo permite uma qualidade excepcional de marcação para reconstrução confiável da morfologia tridimensional completa. Aqui demonstramos o método em animais anestesiados com uretano.
No entanto, as gravações juxtasomáticas também podem ser utilizadas em animais acordados com a cabeça imobilizada para estudar o papel de tipos celulares individuais e camadas durante a exploração ativa do ambiente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de como realizar a marcação com Biocidina em neurônios individuais para identificação pós-morte e reconstrução morfológica.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se em vincular a despolarização do potencial de ação no córtex sensorial à identidade morfológica dos neurônios. Ao utilizar a marcação juxtasomal com biocitina, os pesquisadores podem registrar a atividade neuronal enquanto também marcam os neurônios para uma análise estrutural detalhada.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Morfologia Neuronal
Antecedentes
- A compreensão das redes neuronais exige caracterização funcional e morfológica.
- Os registros juxtasomáticos permitem o estudo da atividade de neurônios individuais.
- A marcação com biocitina permite a reconstrução pós-hoc das estruturas neuronais.
- Essa abordagem auxilia na classificação de tipos celulares com base em sua morfologia e atividade.
Objetivo do Estudo
- Conectar o processamento sensorial à identidade estrutural dos neurônios.
- Aprimorar a compreensão das redes corticais por meio da análise individual de neurônios.
- Utilizar a marcação com biocitina para estudos morfológicos detalhados.
Métodos Utilizados
- Preparação cirúrgica de ratos para gravações juxtasomais.
- Gravações eletrofisiológicas de atividade espontânea e induzida por estímulos sensoriais.
- Carregamento de biocitina em neurônios gravados por meio de injeções de corrente.
- Processamento do tecido cerebral para coloração com biotina e reconstrução digital.
Resultados Principais
- Gravação bem-sucedida de potenciais de ação associados a dados morfológicos.
- Reconstrução detalhada da arquitetura neuronal a partir da marcação com biocitina.
- Compreensão dos mecanismos de processamento sensorial em redes corticais.
- Classificação de neurônios com base em suas propriedades estruturais e funcionais.
Conclusões
- Os registros juxtasomáticos fornecem um método poderoso para estudar neurônios individuais.
- A associação entre morfologia e função aprimora a compreensão dos papéis neuronais no processamento sensorial.
- Essa abordagem pode ser aplicada para investigar mais profundamente as redes neuronais em diversos contextos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Relacionar a atividade neuronal à identidade estrutural permite a redução de riscos mecanicistas na validação de alvos ao esclarecer os papéis específicos de tipos celulares em circuitos de processamento sensorial. Essa abordagem reforça a confiança preditiva em modelos pré-clínicos ao fornecer dados morfológicos e funcionais quantitativos para testes de hipóteses. Ela aborda um desafio fundamental na fase de descoberta: elucidar como subtipos neuronais individuais contribuem para o processamento de informações em nível de rede em sistemas relevantes para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao relacionar padrões de disparo de potenciais de ação à morfologia neuronal durante o processamento sensorial.
- Valor Operacional: Permite a redução de riscos biológicos mediante a identificação pós-hoc de neurônios registrados para classificação por tipo celular.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao esclarecer as relações estrutura-função em microcircuitos corticais relevantes para alvos neuropsiquiátricos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para a padronização de ensaios subsequentes, estabelecendo perfis morfológicos e eletrofisiológicos de referência.
- Valor Operacional: Melhora a prontidão para triagem por meio de condições reprodutíveis de gravação juxtasomal em diferentes estados comportamentais.
- Reutilização da Plataforma: Facilita a aplicação escalonável em modelos acordados, com restrição da cabeça e livremente móveis, para estudos longitudinais de engajamento de alvos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece continuidade em sistemas relevantes para doenças ao permitir a engenharia reversa de redes corticais a partir de dados funcionais para estruturais.
- Valor Operacional: Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco por meio da reconstrução morfológica tridimensional quantitativa e do registro em referencial padronizado.
- Confiabilidade Preditiva: Fortalece o alinhamento de biomarcadores translacionais ao correlacionar saídas eletrofisiológicas com a arquitetura anatômica no córtex sensorial.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a verificação inicial da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes, permitindo a redução de riscos mecanicistas de alvos neuronais em vias de processamento sensorial.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a clarificação de vias ao correlacionar disparos evocados por estímulos sensoriais com a morfologia dendrítica e axonal.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio de configurações juxtasomáticas estáveis e análise quantitativa das formas de onda dos potenciais de ação durante os procedimentos de preenchimento.
- Análises: Gera saídas mensuráveis, incluindo amplitude, frequência e largura do potencial de ação, para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio da reconstrução pós-hoc, permitindo análise quantitativa da arquitetura neuronal em referenciais padronizados.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma capacidade reutilizável para validação iterativa de alvos em condições anestésicas, sedadas, despertas e com movimento livre.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução de riscos mecanicistas das relações estrutura-função em neurônios corticais.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros controlados de injeção de corrente e protocolos de preparação de pipetas.
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de avançar/não avançar ao reduzir riscos biológicos em estágios avançados no desenvolvimento de alvos neuropsiquiátricos.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco por meio de conjuntos integrados de dados funcionais e morfológicos para validação de alvos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, microcirurgia e reconstrução morfológica para gerenciar injeções de corrente de banda estreita e evitar toxicidade neuronal.
- Depende de micropipetas de alta qualidade com diâmetros de ponta submicrométricos e condições estáveis do banho para selamento juxtasomal.
- Necessita padronização entre equipes de eletrofisiologia e histologia para protocolos consistentes de difusão e coloração com biocitina.
- As considerações para adaptação incluem o ajuste dos parâmetros de preenchimento com base na variabilidade da resposta neuronal entre condições de gravação e estados comportamentais.
- As limitações práticas incluem riscos de estresse mecânico durante a retirada da pipeta e a necessidade de períodos de recuperação pós-preenchimento para garantir a qualidade da marcação.
