Juxtasomal biocitina Labeling para estudar a função Estrutura de Relacionamento Individual neurônios corticais

O objetivo geral deste procedimento é vincular o potencial de ação específico do tipo de célula no córtex sensorial durante o processamento de informações à identidade morfológica dos neurônios registrados. Isso é feito primeiro preparando cirurgicamente o rato para gravações justassomais. Uma vez preparado, um eletrodo registra a atividade espontânea e sensorial de pico evocado, e o neurônio registrado é carregado com biocidina usando corrente e injeções.

Depois, o cérebro é processado para coloração de biotina. Finalmente, o neurônio preenchido com biotina é reconstruído digitalmente a partir de seções subsequentes para classificação do tipo de célula. Em última análise, os registros justos de neurônios individuais permitem o estudo do processamento sensorial e da informação estrutural dentro da rede cortical.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave na neurociência, como qual é o papel dos tipos e camadas de células individuais durante o processamento sensorial? Geralmente, as pessoas que precisam desse método terão dificuldades porque é muito fácil matar neurônios durante o procedimento de preenchimento. As chances de enchimento bem-sucedido de biocidina aumentam com a preparação de pipetas de ótima qualidade e, além disso, é necessário um olho treinado para controlar as injeções de corrente de banda estreita.

Portanto, é preciso experiência para aumentar a taxa de sucesso da recuperação de neurônios bem preenchidos. Para começar, coloque um rato wistar anestesiado em uma estrutura estereotáxica equipada com uma almofada de aquecimento. Confirme a profundidade da sedação testando o reflexo de pinça do dedo do pé.

Em seguida, insira uma sonda retal para manter a temperatura corporal correta. Prenda a cabeça do animal e remova os pelos do local da cirurgia. Aplique pomada nos olhos para evitar o ressecamento.

Aguarde de três a cinco minutos após a injeção de lidocaína no local da operação e remova a pele que cobre a superfície do crânio. Em seguida, limpe qualquer tecido restante e limpe o crânio extensivamente com cloreto de sódio a 0,9%. Determine as coordenadas para o córtex somatossensorial primário no hemisfério esquerdo e marque a localização no crânio com uma caneta marcadora cirúrgica da pele.

Use uma broca dentária para raspar o osso da região de interesse. Continue raspando o osso até que fique transparente e os vasos sanguíneos sejam claramente visíveis. Em seguida, corte uma pequena janela no crânio fino com um bisturi.

Tomando cuidado para não danificar a dura-máter e os vasos sanguíneos. Marque as bordas da craniotomia usando uma caneta marcadora cirúrgica da pele. Para melhorar a visibilidade, aplique uma fina camada de super cola no crânio seco e, em seguida, cimento dental para construir um banho.

Ao fechar a craniotomia, apare os bigodes do lado contralateral em exatamente cinco milímetros para ajudar na visibilidade. Destaque os bigodes aparados com rímel preto antes de iniciar as gravações, faça pipetas de remendo de vidro Boro Silicic. A morfologia ideal da pipeta é um cone delgado gradual, um ângulo de cone baixo e um diâmetro interno da ponta de aproximadamente um mícron.

Carregue a pipeta de remendo com campainha rad normal, suplementada com 2% de biotina, e monte a pipeta de remendo em um suporte de pipeta, fixado a um estágio de cabeça e conectado a um manipulador microm. Para atingir especificamente a coluna D dois do rato S um, defina o ângulo do suporte do eletrodo para 34 graus em relação ao plano sagital. Em seguida, posicione a pipeta de adesivo próximo à craniotomia.

Encha o banho com cloreto de sódio a 0,9%. Com o amplificador no modo ponte, aplique pulsos quadrados com injeção de corrente positiva para determinar a resistência do eletrodo. A resistência ideal do eletrodo fica entre três e cinco mega.

Estabeleça uma sobrepressão de 100 a 150 milibar e avance a pipeta de remendo em etapas de um mícron enquanto aplica corrente positiva na forma de pulsos quadrados. Monitore a mudança de resistência robusta ao estabelecer contato com a dura-máter. Neste ponto, defina as coordenadas do micromanipulador como zero para permitir medições precisas de profundidade.

Avance no modo de passo de um mícron até que a pipeta de remendo penetre na dura-máter indicada por uma queda repentina na resistência do eletrodo. Remova a pressão de retenção da pipeta. Em seguida, procure unidades únicas enquanto avança em etapas de um mícron.

Monitore a resistência do eletrodo continuamente aplicando 200 milissegundos em pulsos desligados e o aumento na resistência do eletrodo normalmente indica a proximidade de um único neurônio avançando o eletrodo até uma ação positiva. Formas de onda potenciais de aproximadamente dois milivolts são registradas. Opcionalmente, registre a atividade espontânea de pico e determine a atividade de pico revogada pelo bigode desviando coddly os bigodes individuais usando um dispositivo elétrico pizo para obter as condições ideais para o enchimento justossomal.

Avance o eletrodo até que a resistência seja de 25 a 35. Mega ohms e picos têm amplitudes de três a oito milivolts para iniciar o enchimento somal justaposto. Aplique pulsos de corrente quadrada positiva começando em um nano amper.

Aumente lenta e gradualmente a corrente em etapas de 0,1 nano amperes enquanto monitora a forma e a frequência da onda AP. Monitore a abertura da membrana como um claro aumento na frequência AP durante a fase ligada do pulso de bloco, a forma de onda de pico durante o enchimento mostra uma largura aumentada e reduzida após a hiperpolarização, aumente ou diminua a corrente durante o enchimento para manter a infusão de biotina estável, reduza ou pare os pulsos de corrente após o aumento repentino da frequência AP. Para evitar toxicidade por influxo excessivo de íons extracelulares, como íons de sódio.

É importante notar que cada neurônio responderá de maneira diferente ao procedimento de enchimento. Portanto, os parâmetros de rotulagem justassomal devem ser ajustados dependendo da condição de gravação. Monitore de perto o sinal após interromper a injeção de corrente.

A forma de onda de pico após uma sessão de enchimento é geralmente ampliada e mostra uma forte redução após a hiperpolarização esperar pela recuperação do neurônio, o que é aparente quando a forma de onda de pico retorna às suas propriedades originais para reduzir qualquer estresse mecânico na célula. Retraia a pipeta de adesivo em etapas de um mícron até que a amplitude do pico diminua, espere pelo menos uma hora para que a biotina se difunda intracelularmente enquanto monitora de perto a temperatura corporal e a respiração do animal. Finalmente, amostras de cérebro são obtidas e processadas para revelar a qualidade da marcação justa do somal.

Essas imagens mostram imagens de neurônios justamaticamente preenchidos no córtex somatossensorial primário. Essa visão tangencial de um neurônio parametálico demonstra a diferença de tamanho entre dendritos e axônios. Nesta reconstrução digital de um neurônio marcado com somália justa, a imagem de projeção do neurônio é mostrada em alta resolução, mas com baixa ampliação, e com reconstrução digital automatizada sobreposta ao axônio em azul, dendrito em vermelho, respectivamente.

Aqui, a região da caixa é expandida para mostrar o axônio bhuton em todo o comprimento do axônio. Nesta animação final, exemplificamos o pipeline de reconstrução para um neurônio parametálico tufado espesso de uma camada cinco do córtex somatossensorial primário de ratos. O pipeline envolve a reconstrução da morfologia dendrítica e axonal com ampliação de 100 vezes e contornos de barril com ampliação de quatro vezes.

O resultado é uma reconstrução 3D completa, que é posteriormente registrada em um sistema de referência padronizado para realizar análises quantitativas de características morfológicas. Assim, a marcação justa de somais in vivo permite uma qualidade de rotulagem excepcional para uma reconstrução confiável da morfologia 3D completa. Aqui mostramos o método em animais anestesiados com uretano.

No entanto, as gravações Jux Somal também podem ser usadas em animais acordados com a cabeça contida para estudar o papel de tipos e camadas de células individuais durante a exploração ativa do ambiente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma melhor compreensão de como realizar a marcação de biocidina em neurônios individuais para identificação pós-guerra e reconstrução morfológica.