Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a organização de redes astrócitos em estruturas cerebrais. A principal vantagem dessa técnica é que ela propõe um método imparcial para contar células rotuladas e documentar sua organização anatômica dentro de uma estrutura definida. Abra ImageJFIJI, selecione o arquivo desejado e clique em OK na janela de opções de importação do formato biológico.

Para redefinir uma pilha Z que conterá apenas as fatias ópticas necessárias para a pilha Z final, selecione primeiro o projeto STK e Z e, em seguida, clique no botão de pilha na barra de ferramentas. Selecione a intensidade máxima na configuração do tipo de projeção. Salve o arquivo e nomeie-o em pilha de arquivo.

Se o arquivo de imagem contiver vários canais, use a cor da imagem e canais divididos para mostrar apenas o canal com a imagem da rede astróctica. Verifique as configurações dos pixels da imagem selecionando imagem, propriedades, pixel, com uma para a dimensão pixel. Em seguida, use a ferramenta de fundo subtraída, abrindo o processo e subtraindo o fundo para remover a rotulagem de biocitina em segundo plano.

Use a função de visualização para definir o raio da bola rolando, que geralmente é definido em 50 pixels. Se for necessária uma redução adicional de ruído após a etapa de fundo subtraída, selecione o processo, o ruído e remova os outliers. Selecione o brilho na configuração de outliers e use a função de visualização para definir o raio e o limiar.

Tenha cuidado usando a ferramenta removendo outlier, uma vez que pode desfocar os dados, como mostrado aqui. Ajuste o limiar usando imagem, ajuste, limiar. Selecione o modo padrão e B e W.

Clique em se candidatar. Converta a imagem em uma imagem binária com a ferramenta binário de processo selecionando processo, binário e tornar binário. Salve o arquivo como um arquivo de tiff e nomeie-o arquivo binário.

Para contar as células, primeiro defina o tipo de medição clicando em analisar e definir a medição. Em seguida, selecione a opção centroid. Certifique-se de que o arquivo binário está aberto na tela.

Novamente, abra o menu de análise e, desta vez, selecione analisar partículas. Em seguida, selecione o show e os contornos. Isso gera um novo arquivo que mostra o resultado da detecção.

Otimize os parâmetros para refinar a detecção. Para detectar apenas células, use um valor de tamanho entre 30 e 6000, e circularidade entre zero a um, onde se define um círculo perfeito e zero uma forma aleatória. Execute a detecção clicando em OK. Duas tabelas aparecerão, um resumo intitulado tabela que fornece o número de células detectadas e uma tabela intitulada resultados que fornece as coordenadas X e Y de cada célula.

Copie os valores e cole-os em um aplicativo de planilha. Salve esta tabela sob a tabela de detecção de nomes. Um arquivo com um lote de células detectadas também aparecerá.

Salve este arquivo como um arquivo de disputa no arquivo de detecção de nome. Se um grupo de duas ou mais células rotuladas for detectado como uma única célula com a ferramenta de partículas de análise, use a ferramenta de bacia hidrográfica na imagem binária selecionando processo, binário e bacia hidrográfica antes de aplicar a ferramenta de partículas de análise. Para medir a área de superfície das redes, use o arquivo de detecção no ImageJ.

Clique no mouse para selecionar a ferramenta de seleção de polígonos na barra de ferramentas. Clique à esquerda novamente para começar a traçar uma região de interesse, ou ROI, que conecta todas as células localizadas na periferia externa da rede. Clique com o botão direito do mouse para fechar o polígono.

Abra a janela de medição do conjunto e selecione a opção de área. Em seguida, abra o gerenciador de ROI e adicione o polígono rastreado no gerenciador de ROI clicando em adicionar. Execute a medição clicando na medida de roi.

A medição da área aparecerá em uma tabela e será expressa em pixels. Não se esqueça de converter esse valor com um fator de conversão para o microscópio usado para obter o valor em micrômetros quadrados. Abra o arquivo de pilha no ImageJFIJI e identifique a célula corrigida com sua intensidade de rotulagem mais forte.

Em seguida, abra a tabela de detecção nomeada arquivo em um aplicativo de planilha e encontre o número associado à célula corrigida e suas coordenadas correspondentes. Se não conseguir determinar com precisão a célula remendada, use a ferramenta polígono para cercar a área onde o depósito de biocittina é mais denso, e consulte esta posição como a da célula remendada. Use o gerenciador de ROI como antes para desenhar um ROI no local da célula corrigida e adicioná-lo ao gerenciador de ROI.

Em seguida, defina a medição e selecione a opção centroid. No rio gestor, clique na medida para obter as coordenadas do centroide da área traçada. Use essas coordenadas como ponto de referência para esta rede específica.

Use esta fórmula para calcular as coordenadas de cada célula em referência ao astrócito remendado. Expressar as coordenadas de cada célula em referência ao astrócito remendado é um passo importante para calcular o vetor dos astrócitos remendados. Use esta fórmula para calcular as coordenadas do vetor principal da orientação preferencial.

O principal vetor de orientação preferencial da rede é a soma de todos os vetores previamente calculados para cada célula composta na rede. Divida o comprimento do vetor principal pelo número das células na rede, menos uma para excluir a célula remendada, para normalizar os valores e permitir comparações entre redes. Para determinar a posição de cada rede no núcleo de interesse, primeiro abra a imagem quatro x com um editor de imagens vetorial.

Multiplique as dimensões na janela de dimensão por cinco para aumentar o tamanho da imagem de quatro x. Aqui, a imagem foi amostrada em 800 por 800 pixels, e assim a resolução amostral é alterada para 4000 por 4000 pixels. Exporte o arquivo em formato de tiff e nomeize quatro x.

Alinhe o canto superior esquerdo da imagem de quatro x redimensionada com o canto inferior esquerdo do documento Adobe Illustrator. O software fornece coordenadas de um ponto referencial inferior do canto esquerdo. Abra a imagem 20 x da rede.

Use o arquivo binário ou o arquivo de detecção porque eles são mais fáceis de alinhar. Em seguida, jogue com a ferramenta de opacidade no arquivo binário da imagem de 20 x para alinhá-la com a imagem de quatro x redimensionada. Quando o alinhamento estiver pronto, selecione e segure a ferramenta pipeta para que a ferramenta de medida apareça e selecione-a na barra de ferramentas esquerda.

Use a ferramenta de medida para clicar no canto superior esquerdo da imagem 20 x para obter as coordenadas do ponto referencial de 20 x para a imagem de quatro x redimensionada. Estas 20 x coordenadas referenciais são úteis para expressar a posição de cada rede em um desenho esquemático do núcleo. Para resumir os dados, é utilizada a normalização do núcleo como retângulo.

Para isso, use a ferramenta polígono para cercar o núcleo na imagem de quatro x redimensionada. Em seguida, abra o gerenciador de ROI e adicione o ROI desenhado. Use a imagem com luzes transparentes se as bordas do núcleo não puderem ser vistas, nesse caso lembre-se de redimensioná-la primeiro.

Na medição definida, selecione a opção retângulo delimitadora para calcular o menor retângulo dentro do núcleo desenhado. Por fim, clique na medida e siga os passos do protocolo escrito para expressar as coordenadas das células rotuladas em um núcleo normalizado representado pelo retângulo delimitante. Um único astrócito na parte dorsal do núcleo sensorial principal trigêmeo, rotulado por SR101, foi direcionado para gravação de células inteiras e preenchido com biocittina de 0,2%.

A estimulação elétrica do quinto trato aumentou a rotulagem de biocittina na parte dorsal do núcleo sensorial principal trigêmeo, representando um aumento no número de células acopladas. As redes astrócitos permanecem confinadas dentro da parte dorsal do núcleo sensorial principal trigêmeo e sua orientação principal. Esta técnica foi desenvolvida para posicionar redes astrócitos dentro de uma estrutura definida, mas pode ser usada para expressar a posição da população de células rotuladas em qualquer estrutura.