Name: Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Aprenda a analisar redes de astrócitos acoplados em estruturas cerebrais usando ImageJFIJI. Este método minimiza vieses e quantifica tamanho, forma e direcionalidade das células para estudos de neurociência.

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Este trabalho é financiado por institutos canadenses de pesquisa saúde, Grant/prêmio número: 14392.

<ol><li>Condamine, S., Lavoie, R., Verdier, D., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+rhythmogenic+domains+defined+by+astrocytic+networks+in+the+trigeminal+main+sensory+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional rhythmogenic domains defined by astrocytic networks in the trigeminal main sensory nucleus.</a> Glia. 66 (2), 311-326 (2018).</li>
<li>Verkhratsky, A., Orkand, R. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+calcium%3A+homeostasis+and+signaling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Review%22%5BJournal%5D)">Glial calcium: homeostasis and signaling function.</a> Physiological Review. 78 (1), 99-141 (1998).</li>
<li>Christensen, R. K., Petersen, A. V., Perrier, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+glial+cells+contribute+to+motor+control%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">How do glial cells contribute to motor control?</a> Current Pharmaceutical Design. 19 (24), 4385-4399 (2013).</li>
<li>Verkhratsky, A., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Review%22%5BJournal%5D)">Ion channels in glial cells.</a> Brain Research Review. 32 (2-3), 380-412 (2000).</li>
<li>Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitter+Release+from+Astrocytes%3A+Functional%2C+Developmental%2C+and+Pathological+Implications+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional, Developmental, and Pathological Implications in the Brain.</a> Frontiers Neuroscience. 9, 499(2015).</li>
<li>Montero, T. D., Orellana, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemichannels%3A+new+pathways+for+gliotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hemichannels: new pathways for gliotransmitter release.</a> Neuroscience. 286, 45-59 (2015).</li>
<li>Araque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotransmitters+travel+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gliotransmitters travel in time and space.</a> Neuron. 81 (4), 728-739 (2014).</li>
<li>Augustin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anisotropic+panglial+networks+in+the+lateral+superior+olive%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Functional anisotropic panglial networks in the lateral superior olive.</a> Glia. 64 (11), 1892-1911 (2016).</li>
<li>Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction-mediated+astrocytic+networks+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex.</a> Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).</li>
<li>Roux, L., Benchenane, K., Rothstein, J. D., Bonvento, G., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+astroglial+networks+in+olfactory+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">Plasticity of astroglial networks in olfactory glomeruli.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America. 108 (45), 18442-18446 (2011).</li>
<li>Morquette, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+astrocyte-dependent+mechanism+for+neuronal+rhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An astrocyte-dependent mechanism for neuronal rhythmogenesis.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 844-854 (2015).</li>
<li>Brocard, F., Verdier, D., Arsenault, I., Lund, J. P., Kolta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+intrinsic+bursting+in+trigeminal+sensory+neurons+parallels+the+acquisition+of+mastication+in+weanling+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Emergence of intrinsic bursting in trigeminal sensory neurons parallels the acquisition of mastication in weanling rats.</a> Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2410-2424 (2006).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+properties+of+astrocyte+gap+junction+coupling+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Science%22%5BJournal%5D)">Spatial properties of astrocyte gap junction coupling in the rat hippocampus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Science. 369 (1654), (2014).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Rouach, N., Koulakoff, A., Abudara, V., Willecke, K., Giaume, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+metabolic+networks+sustain+hippocampal+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astroglial metabolic networks sustain hippocampal synaptic transmission.</a> Science. 322 (5907), 1551-1555 (2008).</li>
<li>Claus, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barreloid+Borders+and+Neuronal+Activity+Shape+Panglial+Gap+Junction-Coupled+Networks+in+the+Mouse+Thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Barreloid Borders and Neuronal Activity Shape Panglial Gap Junction-Coupled Networks in the Mouse Thalamus.</a> Cerebral Cortex. 28 (1), 213-222 (2018).</li>
<li>Cameron, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+Incubation+of+Acute+Neuronal+Tissue+for+Electrophysiology+and+Calcium-imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), (2017).</li>
<li>Kafitz, K. W., Meier, S. D., Stephan, J., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+profile+and+properties+of+sulforhodamine+101--Labeled+glial+cells+in+acute+brain+slices+of+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Developmental profile and properties of sulforhodamine 101--Labeled glial cells in acute brain slices of rat hippocampus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 169 (1), 84-92 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods in Enzymology. , 123-131 (1992).</li>
<li>Giaume, C., Leybaert, L., Naus, C. C., Saez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+and+pannexin+hemichannels+in+brain+glial+cells%3A+properties%2C+pharmacology%2C+and+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin and pannexin hemichannels in brain glial cells: properties, pharmacology, and roles.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 88(2013).</li>
<li>Torres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Ca%282%29%28%2B%29+acts+as+a+mediator+of+communication+from+neurons+to+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Extracellular Ca(2)(+) acts as a mediator of communication from neurons to glia.</a> Science Signaling. 5 (208), ra8(2012).</li>
<li>Ye, Z. C., Wyeth, M. S., Baltan-Tekkok, S., Ransom, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+hemichannels+in+astrocytes%3A+a+novel+mechanism+of+glutamate+release%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional hemichannels in astrocytes: a novel mechanism of glutamate release.</a> Journal of Neuroscience. 23 (9), 3588-3596 (2003).</li>
<li>Ma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+coupling+confers+isopotentiality+on+astrocyte+syncytium%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gap junction coupling confers isopotentiality on astrocyte syncytium.</a> Glia. 64 (2), 214-226 (2016).</li>
<li>Meme, W., Vandecasteele, M., Giaume, C., Venance, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling+between+hippocampal+astrocytes+in+rat+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling between hippocampal astrocytes in rat brain slices.</a> Neuroscience Research. 63 (4), 236-243 (2009).</li>
<li>Ransom, B. R., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+coupling%2C+without+dye+coupling%2C+between+mammalian+astrocytes+and+oligodendrocytes+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Electrical coupling, without dye coupling, between mammalian astrocytes and oligodendrocytes in cell culture.</a> Glia. 3 (4), 258-266 (1990).</li>
<li>Audesirk, G., Audesirk, T., Bowsher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+frequent+failure+of+lucifer+yellow+to+pass+between+two+electrically+coupled+neurons+in+Lymnaea+stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Variability and frequent failure of lucifer yellow to pass between two electrically coupled neurons in Lymnaea stagnalis.</a> Journal of Neurobiology. 13 (4), 369-375 (1982).</li>
<li>Ewadinger, N., Syed, N., Lukowiak, K., Bulloch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Tracer+Coupling+between+Pairs+of+Identified+Neurones+of+the+Mollusc+Lymnaea+Stagnalis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Tracer Coupling between Pairs of Identified Neurones of the Mollusc Lymnaea Stagnalis.</a> Journal of Experimental Biology. 192 (1), 291-297 (1994).</li>
<li>Griemsmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Panglial+Gap+Junction+Networks+in+the+Thalamus%2C+Neocortex%2C+and+Hippocampus+Reveals+a+Unique+Population+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Characterization of Panglial Gap Junction Networks in the Thalamus, Neocortex, and Hippocampus Reveals a Unique Population of Glial Cells.</a> Cerebral Cortex. 25 (10), 3420-3433 (2015).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329 (5991), 571-575 (2010).</li>
<li>Forsberg, D., Ringstedt, T., Herlenius, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+release+prostaglandin+E2+to+modify+respiratory+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Astrocytes release prostaglandin E2 to modify respiratory network activity.</a> eLife. 6, (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Existe um número de métodos eletrofisiológicos para avaliar funcional acoplamento entre astrócitos23,24. No entanto, esses métodos não fornecem informações sobre o arranjo anatômico das redes hamartomas. Vários estudos já mostraram que "corante ou marcador-acoplamento", como feito aqui, ocorre apenas em uma fração de juntamente com as células que são detectadas por métodos eletrofisiológicos25,26,</s...

Muitos estudos têm descrito como o diálogo do neurônio-astrocyte em um nível celular sub ou sináptico pode ter implicações em funções neuronais e a transmissão sináptica. Está bem estabelecido que astrócitos são sensíveis ao redor de atividade neuronal; na verdade, eles possuem receptores para muitos neurotransmissores incluindo glutamato, GABA, acetilcolina e ATP (ver comentários publicados anteriormente2,3,4). Em troca, hamartomas processa sináptica elementos ensheath e influência de atividade neuronal ambos lá e em locais extrasynaptic regulação homeostase iónica extracelular e soltando vários fatores ou transmissores, tais como o glutamato, D-serina e ATP 5 , 6 , 7.
Surgiu a ideia de que astrócitos também podem modular a função neuronal no nível da rede, com evidências de que o acoplamento hamartomas espacialmente é regulamentado e corresponde à segmentação neuronal em áreas caracterizadas por uma clara anatômica compartimentação (como áreas com representações sensoriais), indicando que astrócitos combinar para outros astrócitos, servindo a mesma função, em vez de apenas aqueles que estão por perto. Na oliva superior lateral, por exemplo, redes mais hamartomas são orientadas ortogonalmente ao tonotopic eixo8, Considerando que em glomérulos barril córtex ou olfactoty, a comunicação entre os astrócitos é muito mais forte dentro de barris ou glomérulos e mais fraco entre adjacentes uns9,10. Em ambos os casos, as redes hamartomas são orientadas em direção ao centro do glomerule ou barril9,10.
Recentemente mostramos que a atividade hamartomas modula disparo neuronal, diminuindo a concentração de extracelular Ca2 + ([Ca2 +]e), presumivelmente através da liberação de S100β, uma Ca2 +-ligação proteína11. Este efeito, o que foi demonstrado em uma população de neurônios rhythmogenic trigeminal na parte dorsal das principais trigeminal sensorial núcleo (NVsnpr, pensado para desempenhar um papel importante na geração de movimentos de mastigação), resulta do fato de que fuzilamento rítmico nestes neurônios depende de um persistente at+ atual que é promovido por diminuições de [Ca2 +]11,e12. Fuzilamento rítmico nestes neurônios pode ser eliciado "fisiologicamente" estimulação de suas entradas ou diminuição artificial da [Ca2 +]e. Nós revelou ainda que hamartomas acoplamento foi necessário para acionamento rítmico neuronal1. Isso levantou a possibilidade que as redes hamartomas podem formar circunscritos domínios funcionais, onde a atividade neuronal pode ser sincronizada e coordenada. Para avaliar esta hipótese, precisamos primeiro desenvolver um método para documentar rigorosamente a organização destas redes dentro de NVsnpr.
Estudos anteriores sobre redes hamartomas principalmente descreveu a extensão do acoplamento em termos de número de célula e a densidade e a área coberta. As tentativas de avaliar a forma de redes hamartomas e a direção da tintura-acoplamento principalmente foram realizadas comparando o tamanho das redes ao longo de dois eixos (x e y) do barril córtex9, hipocampo13,14, 15, barreloid campos do tálamo16, oliva superior lateral8, glomérulos olfativos10e o córtex14. Os métodos descritos aqui permitem imparciais acusações de pilhas etiquetadas em uma rede e uma estimativa da área que eles cobrem. Também desenvolvemos ferramentas para definir a orientação preferencial do acoplamento dentro de uma rede e avaliar se a orientação preferencial é em direção ao centro do núcleo, ou em uma direção diferente. Em comparação com métodos utilizados anteriormente, este protocolo fornece um meio para descrever a organização e a orientação das redes hamartomas em estruturas como o núcleo sensorial principal trigeminal dorsal que não têm um conhecido clara anatômico compartimentalização. Nos estudos acima, a orientação de rede é descrita como uma relação com a forma da estrutura em si que já está documentada (ex., o barreloid no tálamo, barris no córtex, camadas no hipocampo e córtex, glomérulos em o bulbo olfatório, etc.). Além disso, análise vectorial permite comparações de orientações reveladas sob diferentes condições de acoplamento. Para analisar se estes parâmetros alterados de acordo com a posição da rede dentro do núcleo, nós também desenvolvemos um método para substituir cada rede em referência os limites do núcleo. Estas ferramentas podem ser facilmente adaptadas para outras áreas para investigar redes de células acopladas.

<table><tbody><tr><td>Produtos químicos Fisher NaCl</td><td></td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Produtos químicos</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Produtos químicos Fisher</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Produtos químicos</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Produtos químicos</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>C6H12O6 Dextrose anidra</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 di-hidratado</td><td>Sigma</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td></td><td>Sigma S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sal de potássio de ácido D-glucônico</td><td>Sigma</td><td>G45001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 anidro</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>ATPTris Sal</td><td>Sigma</td><td>A9062</td><td></td></tr><tr><td>GTPTris Sal</td><td>Sigma</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Carbenoxolone dissódico</td><td>sal Sigma</td><td>C4790</td><td></td></tr><tr><td>complexo avidina-biotina: kit ABC</td><td>Vestor laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-alexa 594</td><td>Sondas Moleculares</td><td>S11227</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Fisher Chemicals</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher Chemicals</td><td>X5-1</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem aquoso 1: Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem de resina sintética à base de toluen: Permount</td><td>Fisher Chemicals</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Slide Drying Bench</td><td>Fisherbrand</td><td>11-474-470</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544A</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de microscópio ColorFrost</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-413</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Fisherchemicals</td><td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FluoView FV 1000 Microscópio confocal</td><td>Lente</td> de imersão em água Olympus <td></td><td></td></tr><tr><td>40X</td><td>Lente</td> de imersão em água <td>Olympus LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>20X</td><td>Lente</td> de imersão em água <td>Olympus XLUMPLFL20XW</td><td></td></tr><tr><td>4X</td><td>Micropipeta Olympus</td><td>XLFLUOR4X/340</td><td></td></tr><tr><td> extrator</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP 225</td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD</td><td>Sony</td><td>CX-ST50</td><td></td></tr><tr><td>Monitor preto e branco</td><td>Sony</td><td>SSM-125</td><td></td></tr><tr><td>Digidata</td><td>Molecular devices</td><td>1322A</td><td></td></tr><tr><td>Patch Clamp amplificador</td><td>Axon instrument</td><td>Mulitclamp 700A</td><td></td></tr><tr><td>Software de aquisição de eletrofisiologia</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>pClamp 8</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de eletrofisiologia</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>Clampfit 8</td><td></td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>ImageJFIJI</td><td>Software de código aberto. Versão FIJI incluindo pacote plug-in.</td><td></td></tr><tr><td>Editor de imagens vetoriais</td><td>Adobe</td><td>Illustrator CS4</td><td></td></tr><tr><td>Aplicativo de planilha</td><td>Microsoft Office</td><td>Excel 2010</td><td></td></tr></tbody></table>

analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

Tornou-se cada vez mais claro que os astrócitos modulam função neuronal não só a nível sináptico e célula única, mas também no nível da rede. Astrócitos são fortemente ligados uns aos outros através de junções e acoplamento através destes cruzamentos é dinâmico e altamente regulamentado. Um conceito emergente é que funções hamartomas são especializadas e adaptadas para as funções do circuito neuronal com o qual eles estão associados. Portanto, métodos para medir vários parâmetros das redes hamartomas são necessários para melhor descrever as regras que regem a sua comunicação e acoplamento e a entender melhor as suas funções.
Aqui, usando o software de análise de imagem (ex., ImageJFIJI), descrevemos um método para analisar imagens confocal de redes hamartomas reveladas pela tintura-acoplamento. Estes métodos permitem 1) uma detecção automatizada e imparcial de pilhas etiquetadas, 2) cálculo do tamanho da rede, 3) cálculo da orientação preferencial da tintura espalhar dentro da rede e 4) reposicionamento da rede dentro da área de interesse .
Esta análise pode ser usada para caracterizar redes hamartomas de uma determinada área, comparar as redes de diferentes áreas associadas a diferentes funções ou comparar redes obtidas em condições diferentes que têm efeitos diferentes sobre o acoplamento. Estas observações podem levar a importantes considerações funcionais. Por exemplo, analisamos as redes hamartomas de um núcleo trigeminal, onde anteriormente mostramos que hamartomas acoplamento é essencial para a capacidade dos neurônios mudar seus padrões de fuzilamento de tónico para ruptura rítmica1. Ao medir o tamanho, confinamento e orientação preferencial das redes hamartomas esse núcleo, podemos construir hipóteses sobre domínios funcionais que eles delimitam. Vários estudos sugerem que várias outras áreas do cérebro, incluindo o córtex de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos e núcleos sensoriais no tálamo e no córtex visual, para citar alguns, podem beneficiar de uma análise semelhante.

Acoplamento entre as células do cérebro não é estático, mas prefiro dinamicamente regulamentado por muitos fatores. Os métodos descritos foram desenvolvidos para redes hamartomas reveladas sob diferentes condições de analisar e entender sua organização em NVsnpr. Estes resultados foram já publicados1. Biocytin enchimento de astrócitos único foram realizadas na parte dorsal do NVsnpr em três condições diferentes: em repouso (em controlar as condições na ausência de ...

Aqui nós apresentamos um protocolo para avaliar a organização de redes hamartomas. O método descrito minimiza o viés para fornecer medidas descritivas dessas redes tais como a contagem de células, tamanho, área e posição dentro de um núcleo. Anisotropia é avaliada com uma análise vectorial.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a organização de redes astrócitos em estruturas cerebrais. A principal vantagem dessa técnica é que ela propõe um método imparcial para contar células rotuladas e documentar sua organização anatômica dentro de uma estrutura definida. Abra ImageJFIJI, selecione o arquivo desejado e clique em OK na janela de opções de importação do formato biológico.Para redefinir uma pilha Z que conterá apenas as fatias ópticas necessárias para a pilha Z final, selecione primeiro o projeto STK e Z e, em seguida, clique no botão de pilha na barra de ferramentas. Selecione a intensidade máxima na configuração do tipo de projeção. Salve o arquivo e nomeie-o em pilha de arquivo.Se o arquivo de imagem contiver vários canais, use a cor da imagem e canais divididos para mostrar apenas o canal com a imagem da rede astróctica. Verifique as configurações dos pixels da imagem selecionando imagem, propriedades, pixel, com uma para a dimensão pixel. Em seguida, use a ferramenta de fundo subtraída, abrindo o processo e subtraindo o fundo para remover a rotulagem de biocitina em segundo plano.Use a função de visualização para definir o raio da bola rolando,

analyzing-size-shape-directionality-networks-coupled

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Descrevemos aqui uma adaptação de protocolos utilizados para induzir plasticidade homeostático em neurónios para o estudo da plasticidade dos receptores acoplados à proteína G astrocíticos. Recentemente usado para examinar as mudanças no grupo I astrocitário mGluRs em ratos juvenis, o método pode ser aplicado para medir o dimensionamento de vários GPCRs astrocitárias, em tecidos de camundongos adultos in situ e in vivo, e para obter uma melhor apreciação da sensibilidade dos receptores...

Induzir Plasticidade de astrocítica Receptores de Manipulação de Neuronal queima de moeda

Os astrócitos no SNC mudam suas propriedades funcionais e estruturais em resposta a estímulos nocivos. Este relato apresenta um protocolo para avaliação da morfologia tridimensional de astrócitos em condições de doença ou após intervenções terapêuticas.

Protocolo para tridimensional confocal morfométrica Análise de astrócitos

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia

Vamos mostrar o desenvolvimento de feixes Self montados, tridimensionais do somata hamartomas alinhado longitudinalmente e processos dentro de um invólucro de biomaterial romance. Estas engenharia "vida andaimes", exibindo o diâmetro do mícron-escala ainda estendendo centímetros de comprimento, pode servir como teste-camas para estudar os mecanismos do desenvolvimento neurológico ou facilitar Epilepsias pelo diretor de migração neuronal e/ou axonal Pathfinding.

Engenharia de tecidos tridimensionais alinhado Astrocyte redes para recapitular os mecanismos do desenvolvimento e facilitar a regeneração do sistema nervoso

O protocolo AWESAM descrito aqui é ideal para o cultivo de astrócitos murino em isolamento de outras células do cérebro de forma rápida, simples e barato. Astrócitos AWESAM exposição espontânea Ca2 + sinalização, morfologia e gene expressão perfis semelhantes de astrócitos na vivo.

Cultivo In Vivo-gosto murino astrócitos usando o protocolo AWESAM rápida, simples e barato

Neste protocolo, nosso objetivo é descrever um método reprodutível para os neurônios de células-tronco derivadas de pluripotentes humanas combinando dissociado e astrócitos juntos em 3D sphere cocultures, mantendo estas esferas em condições de flutuação livre e, posteriormente medindo a atividade sináptica circuito das esferas com immunoanalysis e gravações de matriz multielectrode.

Modelagem de microcircuito sináptica com Cocultures 3D de astrócitos e neurônios de células-tronco pluripotentes humanas

Os astrócitos são células morfologicamente complexas, exemplificadas por seus múltiplos processos e territórios Bushy. Para analisar sua morfologia elaborada, apresentamos um protocolo confiável para a realização de iontoforese intracelular de Lúcifer amarelo em tecido levemente fixo.

Visualizando morfologia Astrocitante usando Lúcifer iontoforese amarela

Aqui nós descrevemos um método vivo-imagem latente in vitro para visualizar o transporte intracelular das organelas e o tráfico de proteínas da membrana de plasma em astrocytes murino. Este protocolo também apresenta uma metodologia de análise de imagem para determinar itinerários de transporte de carga e cinética.

Visualizando e analisando o transporte intracelular de organelas e outras cargas em astrócitos

A combinação de transdução vetorial viral e limpeza cerebral usando o método CLARITY permite a investigação de um grande número de neurônios e astrócitos simultaneamente.

Investigação da interação espacial entre astrócitos e neurônios em cérebros limpos

Este protocolo descreve métodos de seção, coloração e seções de tecido flutuante de imagem do cérebro do camundongo, seguido por uma descrição detalhada da análise do volume de território de astrócito e da sobreposição de território de astrócito.

Análise do volume do território de astutação e revestimento em seções de tecido livre grossa

Aprenda a analisar redes de astrócitos acoplados em estruturas cerebrais usando ImageJFIJI. Este método minimiza vieses e quantifica tamanho, forma e direcionalidade das células para estudos de neurociência.

Analisando o tamanho, forma e direcionalidade das redes de astrócitos acoplados

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