Avaliando Retinal microglia fagocítica Função In Vivo Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função fagocítica da microglia retiniana in vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia, como se certos compostos alteram a função fagocítica da microglia em um ambiente fisiológico. A principal vantagem desta técnica é que utiliza citometria de fluxo, permitindo uma análise quantitativa rápida e precisa da fagocitose microglial.

Ajudando-me a demonstrar o procedimento estará Susumu Sakimoto, um pós-doutorado do meu laboratório. Comece carregando uma agulha e seringa de calibre 33 com 0,5 microlitros de solução de partículas marcadas com fluorescência. Em seguida, coloque um camundongo anestesiado de lado sobre material macio sob um microscópio cirúrgico e confirme o nível apropriado de sedação por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.

Em seguida, use uma pinça para aplicar pressão cuidadosamente ao redor de uma pálpebra, de modo que o globo ocular saia ligeiramente da órbita. Em seguida, segure a cabeça com dois dedos logo acima da orelha e pela mandíbula do animal, e estique suavemente a pele paralela às pálpebras para manter o olho ligeiramente saliente para fora da órbita. As injeções intravítreas são desafiadoras e, se não forem realizadas corretamente, levarão a resultados tendenciosos e variáveis.

Para reduzir o trauma ocular, segure o animal em uma posição estável com o mínimo de movimento da cabeça. Para perfurar o globo ocular, segure suavemente o mouse com uma mão. Em seguida, localize o limbo da córnea onde a córnea e a esclera se conectam, que é visível como um círculo cinza em camundongos pigmentados.

Segurando a seringa na outra mão, insira a agulha no limbo. Em seguida, retraia ligeiramente a agulha para expelir um pequeno volume de fluido vítreo e pressione lentamente o êmbolo para injetar as partículas. Quando todas as esferas tiverem sido entregues, retire lentamente a seringa para evitar o refluxo do material injetado e aplique gotas hidratantes para manter o olho hidratado assim que o olho se retrair de volta ao lugar.

Em seguida, coloque o animal em uma almofada de aquecimento em sua própria gaiola com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Três horas após a injeção intravítrea, use uma pinça de ângulo de 45 graus para pressionar suavemente contra a pálpebra para proptose o globo ocular. Posicione a pinça atrás do globo ocular e puxe.

Em seguida, transfira o globo ocular para a área seca de uma placa de Petri, contendo um pequeno volume de PBS com cálcio e magnésio sob um microscópio de dissecação. E use uma ponta de uma pinça superfina para perfurar o olho no limbo da córnea. Em seguida, segurando o globo ocular com uma pinça fina em ângulo de 45 graus, use uma tesoura de mola para cortar ao redor do limbo da córnea até que cerca de metade da circunferência seja cortada.

Transfira o globo ocular para PBS e use um segundo par de pinças finas em ângulo de 45 graus para separar a córnea e a esclera. A lente e a retina sairão intactas. Certifique-se de que o cristalino e a retina estejam separados e transfira a retina para um tubo de ensaio de poliestireno de 5,4 mililitros, contendo dois mililitros de PBS com cálcio e magnésio.

Para obter uma suspensão de célula única das células da retina, use um kit de dissociação do tecido neuronal de acordo com as instruções do fabricante e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de coloração. Em seguida, transfira a amostra para um poço de uma placa de fundo em U de 96 poços. Após a centrifugação, inverter a placa para descartar o sobrenadante e bloquear os receptores FC com 25 microlitros de tampão corante contendo CD16, anticorpo CD32 por poço por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, rotule as células com os anticorpos de interesse por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro. Em seguida, coloque as células em pellet e depois lave 200 microlitros de tampão de coloração fresco por poço. Agora ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de manchas e corante de viabilidade e transfira as amostras para tubos de microtitulação de 1,2 mililitro.

Em seguida, lave os poços com mais 100 microlitros de tampão de coloração e corante de viabilidade e agrupe as lavagens com as amostras correspondentes para análise por citometria de fluxo. Este método pode ser usado em camundongos pós-natais ou adultos de 10 a 20 dias de idade e pode ser adaptado para testar o efeito de compostos e/ou a manipulação genética da fagocitose microglial. Por exemplo, neste experimento após o desafio intraperitoneal com doses variadas de LPS, uma dose de 1,42 miligrama por quilograma de LPS foi determinada para induzir um aumento estatisticamente significativo na porcentagem de micróglia fagocítica, em comparação com controles desafiados por veículo.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em seis horas se for executada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como classificação de células seguida de qPCR ou análise proteômica, podem ser usados para responder a outras perguntas sobre as diferenças entre a microglia fagocítica e não fagocítica na retina. Ao desenvolver esta técnica, é nossa expectativa que agora possamos possibilitar que os cientistas da visão e neurologistas explorem ainda mais a função fagocítica microglial in situ e em um contexto fisiologicamente relevante.