Avaliando Retinal microglia fagocítica Função

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a função fagocítica da micróglia retiniana in vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da oftalmologia, como se certos compostos alteram a função fagocítica da micróglia em um ambiente fisiológico. A principal vantagem desta técnica é que utiliza citometria de fluxo, permitindo uma análise quantitativa rápida e precisa da fagocitose microlial.

Ajude-me a demonstrar o procedimento Susumu Sakimoto, um pós-doutorando do meu laboratório. Comece carregando uma agulha e seringa de 33 gauge com 0,5 microlitros de solução de partículas marcadas com fluoróforo. Em seguida, posicione um camundongo anestesiado de lado sobre um material macio sob um microscópio cirúrgico e confirme o nível adequado de sedação pela ausência de resposta ao aperto dos dedos dos pés.

Em seguida, use uma pinça para aplicar cuidadosamente pressão ao redor de uma pálpebra, fazendo com que o globo ocular saia ligeiramente da órbita. Em seguida, segure a cabeça com dois dedos logo acima da orelha e na mandíbula do animal, e estique suavemente a pele paralelamente às pálpebras para manter o olho ligeiramente saliente da órbita. As injeções intravitreais são difíceis, e se não forem realizadas corretamente, levarão a resultados enviesados e variáveis.

Para reduzir o trauma ao olho, mantenha o animal em uma posição estável com movimento mínimo da cabeça. Para perfurar o globo ocular, segure suavemente o camundongo com uma mão. Em seguida, localize o limbo corneano, onde a córnea e a esclera se conectam, visível como um círculo acinzentado em camundongos pigmentados.

Com a seringa na outra mão, insira a agulha no limbo. Em seguida, recue levemente a agulha para expelir um pequeno volume de fluido vítreo e pressione lentamente o êmbolo para injetar as partículas. Quando todas as microesferas tiverem sido administradas, retire lentamente a seringa para evitar refluxo do material injetado e aplique gotas umectantes para manter o olho hidratado assim que ele retornar à posição original.

Em seguida, coloque o animal sobre uma manta térmica na sua própria gaiola com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. Três horas após a injeção intravítrea, use uma pinça em ângulo de 45 graus para pressionar suavemente a pálpebra e protrair o globo ocular. Posicione a pinça atrás do globo ocular e puxe.

Em seguida, transfira o globo ocular para a área seca de uma placa de Petri, contendo um pequeno volume de PBS com cálcio e magnésio sob um microscópio estereoscópico. E use a ponta de uma pinça superfinas para perfurar o olho no limbo corneano. A seguir, segurando o globo ocular com uma pinça fina em ângulo de 45 graus, use uma tesoura de mola para cortar ao redor do limbo corneano até que aproximadamente metade da circunferência seja cortada.

Transfira o globo ocular para PBS e use um segundo par de pinças finas com ângulo de 45 graus para separar a córnea e a esclera. A lente e a retina sairão intactas. Certifique-se de que a lente e a retina estejam separadas e transfira a retina para um tubo de ensaio de poliestireno de 5,4 mililitros, contendo dois mililitros de PBS com cálcio e magnésio.

Para obter uma suspensão de células individuais das células da retina, utilize um kit de dissociação de tecido neuronal de acordo com as instruções do fabricante e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão de marcação. Em seguida, transfira a amostra para um poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços. Após a centrifugação, inverta a placa para descartar o sobrenadante e bloquee os receptores FC com 25 microlitros de tampão de marcação contendo anticorpo contra CD16, CD32 por poço durante cinco minutos à temperatura ambiente.

A seguir, marque as células com os anticorpos de interesse por 15 minutos em temperatura ambiente e no escuro. Em seguida, centrifugue as células e lave com 200 microlitros de tampão de marcação fresco por poço. Agora, ressuspenda os pellets em 200 microlitros de tampão de marcação e corante de viabilidade e transfira as amostras para tubos microtituláveis de 1,2 mililitro.

Em seguida, lave as cavidades com mais 100 microlitros de tampão de marcação e corante de viabilidade e reúna as lavagens com as amostras correspondentes para análise por citometria de fluxo. Este método pode ser utilizado em camundongos pós-natais com 10 a 20 dias de idade ou adultos e pode ser adaptado para testar o efeito de compostos e/ou a manipulação genética da fagocitose microglial. Por exemplo, neste experimento, após desafio intraperitoneal com doses variáveis de LPS, uma dose de 1,42 miligrama por quilograma de LPS foi determinada como capaz de induzir um aumento estatisticamente significativo na porcentagem de micróglias fagocíticas, em comparação com os controles desafiados com veículo.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser concluída em seis horas se for realizada corretamente. Após este procedimento, outros métodos, como separação celular seguida de qPCR ou análise proteômica, podem ser utilizados para responder perguntas adicionais sobre as diferenças entre micróglias fagocíticas e não fagocíticas na retina. Ao desenvolver esta técnica, esperamos que agora seja possível para cientistas da visão e neurocientistas explorar mais profundamente a função fagocítica das micróglias in situ e em um contexto fisiologicamente relevante.