Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

O objetivo geral do protocolo a seguir é examinar os efeitos da infecção microbiana na inflamação crônica in vivo usando um modelo animal fisiologicamente relevante. Isso é conseguido infectando camundongos por via oral com porphyromonas gingivalis para induzir inflamação crônica local e sistêmica. A ressonância magnética pode então ser utilizada para medir a progressão da inflamação sistêmica em animais vivos, enquanto a perda óssea inflamatória local é avaliada por microtomografia computadorizada e as placas ateroscleróticas podem ser visualizadas por coloração lipídica na face após o sacrifício.

Em última análise, as diferenças no volume ósseo alveolar e o acúmulo de placas ateroscleróticas entre camundongos infectados com P gingivalis e controles não infectados podem ser medidas com base na análise de microtomografia computadorizada e na coloração lipídica da face, respectivamente. A principal vantagem do nosso modelo animal é que ele permite examinar os mecanismos hospedeiros e patogênicos envolvidos na inflamação crônica e, especificamente, em locais distantes da infecção. Assim, você pode olhar para locais sistêmicos, bem como locais de infecção usando camundongos transgênicos e mutantes bacterianos definidos.

Este modelo pode ajudar a identificar os principais aspectos da patogênese, como fatores microbianos e do hospedeiro que contribuem para a doença. Embora esse método possa fornecer informações sobre os mecanismos específicos do hospedeiro e do patógeno envolvidos na perda óssea inflamatória e na aterosclerose, ele também pode ser adaptado para outros modelos de doenças em camundongos, incluindo artrite reumatóide, diabetes e câncer. Esta é a instalação central de ressonância magnética de alto campo da Universidade de Boston, e meu colega de pós-doutorado Ning vai demonstrar aspectos da imagem de camundongos Comece listrando talos congelados de pêssego gingivalis 3 81 em placas de ágar sangue anaeróbico e incube as placas em uma câmara anaeróbica a 37 graus Celsius.

Após três a cinco dias, use os organismos cultivados em placas para inocular cinco mililitros de culturas líquidas de caldo de infusão de coração cerebral, ou BHI. Após o crescimento durante a noite, transfira as culturas para 45 mililitros de BHI e incube as culturas anaeróbias por mais 18 a 24 horas. Na fase logarítmica intermediária, colha as bactérias por centrifugação por 10 minutos a 7.000 GS e temperatura ambiente e, em seguida, ressuspenda completamente o pellet em cinco mililitros de PBS com uma pipeta sorológica após lavar o pellet três vezes em 50 mililitros de PBS Resus, o pellet em PBS de modo que uma diluição de um a 10 da cultura tenha uma densidade óptica de 1,0 a 660 nanômetros.

Em seguida, saia o suficiente de carboximetilcelulose de viscosidade média para atingir uma solução de 2% de peso para volume e adicione lentamente a etilcelulose da caixa de carbox à suspensão bacteriana durante o vórtice para evitar aglomeração. Para medir a progressão da inflamação em C dois. Primeiro, coloque um suporte de animal com a cabeça do camundongo em decúbito dorsal em uma sonda vertical de 30 milímetros e no orifício vertical de um scanner 11.7 TMRI.

Após os processos de oscilação e calço, use uma sequência rara para adquirir imagens de reconhecimento ao longo de três orientações ortogonais para criar imagens coronais e sagitais axiais. Em seguida, depois de usar a angiografia por ressonância magnética de baixa resolução para confirmar que as imagens adquiridas estão dentro da região alvo, realize uma angiografia por ressonância magnética de alta resolução da artéria inominada com uma sequência de eco gradiente 3D não fechada usando os seguintes parâmetros. Uma espessura de laje de 1,5 centímetros, um ângulo de inversão de 45 graus, um tempo de repetição de 20 milissegundos, um tempo de eco de 2,2 milissegundos, um campo de visão de 1,5 por 1,5 por 1,5 centímetros, uma matriz de 1 28 por 1 28 por 1 28 e um número da média de quatro para um tempo total de varredura de aproximadamente 22 minutos.

Em seguida, selecione uma imagem axial da artéria denominada 0,3 a 0,5 milímetros abaixo da bifurcação subclávia para análise de ROI Para fixar a aorta, mantendo o tecido coberto de PBS o tempo todo. Comece colocando a aorta na posição anatômica com os bulbos da aorta à esquerda. Em seguida, coloque pinos de mnuchin temporários consecutivamente nos cinco locais a seguir, o topo da aorta abaixo do terceiro ramo do arco, no meio da aorta descendente perto da extremidade inferior da aorta descendente e acima do ramo da artéria femoral.

Em seguida, use uma tesoura de mola extra fina para cortar o lado esquerdo da aorta, começando no ramo esquerdo da artéria femoral até abaixo do ramo mais baixo da aorta ascendente. Então, depois de cortar e prender cada galho para expor sua superfície interna, continue a prender o tecido. Toda a superfície interna é exposta e claramente visível de cima e livre de interferência visual dos pinos.

Para corar os lipídios e quantificar as lesões, comece cobrindo a aorta fixada com solução de Sudan four ou óleo vermelho O recém-preparada. Após 50 minutos, lave o tecido com isopropanol a 70% por um a cinco minutos e, em seguida, enxágue suavemente a aorta com água bidestilada até que a água que sai do tecido não fique mais vermelha. Em seguida, cubra a aorta com PBS e coloque uma régua ao lado do tecido para auxiliar na calibração da imagem.

Em seguida, capture imagens do tecido com a câmera de alta resolução conectada a um microscópio de dissecação, salvando as imagens como arquivos TIFF. Finalmente, no software de análise de imagens, rastreie manualmente cada superfície íntima para determinar sua área. Em seguida, para calcular a área da lesão usando o limite de cor automatizado, defina um limite para cada imagem para definir uma intensidade de cor que discrimine as lesões das áreas normais.

A porcentagem da superfície intimal coberta por lesões ateroscleróticas pode então ser calculada neste experimento representativo com camundongos infectados com p gengiralis. A análise volumétrica revelou que os camundongos infectados apresentam perda óssea significativa em comparação com os controles não infectados. A inspeção visual da hemimaxila reconstruída ilustra um aumento na área de superfície exposta das raízes molares em camundongos infectados em comparação com controles propensos à aterosclerose.

Um camundongo deficiente em POE. P gingivalis induz uma inflamação crônica que leva à perda óssea alveolar e deposição de placa inflamatória dentro do seio aórtico e de uma artéria nominal tão cedo quanto 24 horas após a última infecção, que pode ser monitorada em camundongos vivos por ressonância magnética in vivo em vários momentos pós-infecção, como nessas imagens representativas. Além disso, nas medições faciais da aorta de Sudan, quatro manchas demonstram que a infecção por p gengivalis aumenta significativamente a deposição lipídica e as áreas lesionais na superfície íntima.

Além disso, a análise imuno-histoquímica das lesões do seio aórtico revela um aumento da infiltração de micrófagos e expressão elevada do receptor imune inato toll-like receptor dois IVs infectados com camundongos. Ao tentar este procedimento, é importante considerar os pontos de tempo de duração experimental em que a inflamação é avaliada devem estar adequadamente alinhados com a progressão da doença. Após a ressonância magnética de outras pessoas, outros métodos, como em pé facial ou histoquímica imunológica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a carga aterosclerótica global ou os componentes celulares da lesão.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de um modelo de camundongo in vivo, que permite examinar os fatores hospedeiros e patogênicos envolvidos na inflamação crônica. Não se esqueça de que trabalhar com patógenos pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso adequado de EPI devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento.