Name: Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Aprenda um modelo de camundongo para estudar a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno durante coinfecção viral. Este método recapitula a doença exacerbada pela idade em humanos.

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Agradecemos a Nick Lenhard pela leitura crítica e edição deste manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Andrew Camilli e Anthony Campagnari pelas cepas bacterianas e Bruce Davidson pelas cepas virais. Este trabalho foi apoiado pelo National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) para J.L. e pelo National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) para E.N.B.G.

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</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

A maioria dos estudos experimentais existentes de co-infecção por S. pneumoniae/IAV baseia-se na entrega bacteriana nos pulmões de camundongos pré-infectados com IAV. Esses modelos têm auxiliado na identificação de alterações no ambiente pulmonar e na resposta imune sistêmica que tornam o hospedeiro suscetível à infecção bacteriana secundária15,16,17,32,33,34,35,36,37. No entanto, esses modelos falharam em mimetizar a transição de S. pneumoniae de um colonizador assintomático para um patógeno capaz de causar infecções pulmonares e sistêmicas graves. Além disso, esses modelos não são adequados para estudar os fatores do hospedeiro e as interações patógeno-hospedeiro no trato respiratório superior que contribuem para a suscetibilidade à infecção. Um modelo prévio para o movimento de pneumococos da nasofaringe para o pulmão após a infecção por IAV baseava-se em infecção bacteriana da nasofaringe seguida de infecção viral. No entanto, não conseguiu reproduzir os sinais graves da doença observados em pacientes humanos21. O modelo de infecção murina modificado descrito aqui recapitula a transição de S. pneumoniae de carreador assintomático para patógeno causador de doença clínica grave.
Uma etapa crítica desse modelo é o estabelecimento da infecção por S. pneumoniae na nasofaringe. Streptococcus pneumoniae forma biofilmes e coloniza a nasofaringe em diferenteseficiências 21,38. Para estabelecer infecção consistente, são necessárias pelo menos 5 × 106 UFC das cepas bacterianas cultivadas em biofilme testadas até o momento23. Recomenda-se que qualquer nova cepa bacteriana seja testada para infecção estável da nasofaringe antes da infecção viral. Para a coinfecção viral, estudos prévios constataram que a infecção intranasal com IAV é necessária para a dispersão da bactéria da nasofaringe21,22,23. Nesses estudos anteriores, 500 UFP de IAV para parto intranasal foram utilizadas, enquanto neste estudo, 200 UFP foram suficientes para aumentar o número de bactérias na nasofaringe. A infecção pelo VAI não se limita às vias aéreas superiores e pode se disseminar para os pulmões39,40, o que é fundamental para tornar o ambiente pulmonar mais permissivo à infecção bacteriana15,16,41. A entrega de IAV aos pulmões pode ser alcançada por entrega intranasal ou instalação intratraqueal de camundongos anestesiados. Trabalhos anteriores com camundongos BALB/cByJ descobriram que o parto intranasal resulta em pneumonia viral21; no entanto, o acesso do inóculo aos pulmões após a inoculação intranasal é mais restrito em camundongos C57BL/6. Em camundongos C57BL/6, a instalação intratraqueal é necessária para a liberação consistente do vírus23. Nesse modelo, a colonização bacteriana prévia acelera a apresentação dos sintomas da doença após a infecção viral23. Como a própria infecção viral pode causar sintomas da doença com potencial variação na cinética, recomenda-se primeiro testar um intervalo de doses para qualquer nova cepa viral testada e escolher uma dose que revele cinética acelerada em hospedeiros coinfectados.
Os pulmões fornecem outra leitura crítica para a avaliação da doença neste modelo. Para a avaliação da carga de patógenos e do influxo de células imunes, um pulmão do mesmo camundongo pode ser usado. No entanto, como a gravidade da infecção e da inflamação pode diferir entre os lobos, recomenda-se não tomar lobos diferentes do mesmo pulmão para as várias avaliações. Em vez disso, todos os lóbulos podem ser picados em pequenos pedaços, misturados bem juntos e, em seguida, analisados igualmente para as diferentes avaliações. Da mesma forma, a nasofaringe pode ser usada para a enumeração de UFC bacteriana ou PFU viral e resposta imune. No entanto, o número de células obtidas das lavagens e do tecido é muito baixo para realizar citometria de fluxo sem agrupar as amostras de camundongos dentro do mesmo grupo. Alternativamente, a inflamação na nasofaringe pode ser avaliadahistologicamente23.
Uma característica crítica desse modelo é que ele recapitula a doença clínica observada nos pacientes. Em humanos, a pneumonia pneumocócica secundária após infecção por VAI frequentemente resulta em sinais óbvios da doença, incluindo tosse, dispneia, febre e dores musculares que podem levar a hospitalizações, insuficiência respiratória e até morte 8,15,42,43. Este modelo recapitula os sinais graves de doença clínica observados em humanos em termos de dificuldade em respirar (refletida no escore respiratório) e mal-estar geral (refletido nos escores de postura e movimento) exibidos pelos camundongos, bem como morte em alguns dos controles jovens saudáveis. Os sintomas exacerbados da doença em camundongos co-infectados são provavelmente resultado tanto da disseminação bacteriana para os pulmões quanto da depuração viral prejudicada em camundongos com carreamento pneumocócico23. Uma limitação do modelo é que a incidência de doença clínica e disseminação bacteriana da nasofaringe varia entre camundongos e é influenciada pela cepa bacteriana, idade do hospedeiro e genótipo21,22,23. Refletindo isso, para cepas invasivas, a progressão de infecção localizada (sem bacteremia detectável) para morte pode ocorrer dentro de 24 h. Portanto, para uma verdadeira avaliação da disseminação sistêmica, a bacteremia deve ser acompanhada em intervalos mais curtos (a cada 6-12 h). Da mesma forma, o escore da doença pode mudar rapidamente, particularmente nas primeiras 72 h após a coinfecção. Portanto, para acompanhar de perto os sintomas da doença, é aconselhável monitorar camundongos três vezes por dia durante os dias 1-3 após a infecção por IAV.
Em resumo, esse modelo replica o movimento de S. pneumoniae de um colonizador assintomático da nasofaringe para um patógeno capaz de causar doença pulmonar e sistêmica na infecção por IAV. Nesse modelo, o IAV desencadeia a transição de S. pneumoniae modificando o comportamento bacteriano na nasofaringe, aumentando a disseminação bacteriana para o pulmão e alterando a imunidade antibacteriana23. Da mesma forma, o carreamento bacteriano atenua as respostas imunes antivirais e prejudica a depuração do IAV dos pulmões23. Isso torna esse modelo ideal para analisar mudanças nas respostas imunes em infecções únicas versus polimicrobianas. Além disso, o curso da doença após a coinfecção é, em parte, dependente da cepa de pneumococo presente na nasofaringe. Portanto, o modelo é adequado para dissecar os fatores bacterianos necessários para a colonização assintomática versus transição patogênica de S. pneumoniae. Por fim, esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento a coinfecções e, embora não tenha sido testado aqui, pode ser facilmente usado para avaliar o impacto do background do hospedeiro no curso da doença. Em conclusão, separar carreador e doença em etapas distintas oferece a oportunidade de analisar as variantes genéticas tanto do patógeno quanto do hospedeiro, permitindo o exame detalhado das interações de um importante patobionte com o hospedeiro em diferentes fases da progressão da doença. No futuro, esse modelo pode ser usado para adaptar opções de tratamento para hospedeiros vulneráveis.

Streptococcus pneumoniae (pneumococo) são bactérias Gram-positivas que residem assintomático na nasofaringe da maioria dos indivíduos saudáveis 1,2. Promovido por fatores não completamente definidos, o pneumococo pode transitar de colonizadores benignos da nasofaringe para patógenos que se disseminam para outros órgãos, resultando em infecções graves, incluindo otite média, pneumonia e bacteremia3. A apresentação da doença pneumocócica é, em parte, dependente de diferenças específicas da cepa, incluindo o sorotipo, que é baseado na composição dos polissacarídeos capsulares. Existem mais de 100 sorotipos caracterizados até o momento, e alguns estão associados a infecções mais invasivas 4,5. Vários outros fatores aumentam o risco de doença pneumocócica. Um desses fatores é a infecção viral, em que o risco de pneumonia pneumocócica é aumentado em 100 vezes pelo IAV 6,7. Historicamente, o S. pneumoniae é uma das causas mais comuns de pneumonia bacteriana secundária após influenza e está associado a piores desfechos8. Outro importante fator de risco é a idade avançada. De fato, o S. pneumoniae é a principal causa de pneumonia bacteriana adquirida na comunidade em idosos acima de 65 anos 9,10. Os idosos são responsáveis pela maioria (>75%) dos óbitos por pneumonia e influenza, indicando que os dois fatores de risco - envelhecimento e infecção por VAI - pioram sinergicamente a suscetibilidade à doença11,12,13,14. No entanto, os mecanismos pelos quais a infecção viral provoca a transição do pneumococo de colonizador assintomático para patógeno invasivo e como este é moldado por fatores do hospedeiro permanecem pouco definidos. Isso se deve em grande parte à ausência de um modelo animal de pequeno porte que recapitule a transição da colonização pneumocócica assintomática para doença clínica crítica.
Estudos de co-infecção têm sido classicamente modelados em camundongos inoculados com pneumococos diretamente nos pulmões 7 dias após a infecção por influenza15,16. Isso reproduz a suscetibilidade à pneumonia bacteriana secundária e é ideal para estudar como as respostas imunes antivirais prejudicam as defesas antibacterianas17. Entretanto, estudos longitudinais em humanos têm demonstrado que o carreamento pneumocócico na nasofaringe, onde a bactéria pode formar biofilmesassintomáticos18, está uniformemente associado a doenças invasivas19,20. Isolados bacterianos de infecções de orelha média, pulmão e sangue são geneticamente idênticos aos encontrados na nasofaringe20. Assim, para estudar a transição de carreamento assintomático para doença invasiva após infecção por VA, estabeleceu-se um modelo em que camundongos receberam pneumococo cultivado com biofilme por via intranasal seguido de infecção por IAV na nasofaringe21,22. A infecção viral das vias aéreas superiores levou a alterações no ambiente do hospedeiro que levaram à dispersão dos pneumococos dos biofilmes e sua disseminação para as vias aéreas inferiores21. Essas bactérias dispersas apresentaram expressão regulada de fatores de virulência importantes para a infecção, convertendo-as de colonizadoras em patógenos21. Essas observações destacam a complexa interação entre vírus, hospedeiro e bactéria e demonstram que as alterações no hospedeiro desencadeadas pela infecção viral têm impacto direto no comportamento pneumocócico, que, por sua vez, altera o curso da infecção bacteriana. No entanto, esse modelo falha em recapitular os sinais graves de doença observados em humanos, provavelmente porque o vírus é limitado à cavidade nasal, e os efeitos sistêmicos da infecção viral na imunidade do hospedeiro e danos pulmonares não são recapitulados.
Recentemente, estabelecemos um modelo que incorpora a complexa interação entre o hospedeiro e os patógenos, mas também mimetiza mais de perto a gravidade da doença observada em humanos23. Neste modelo, camundongos são primeiramente infectados intranasalmente com pneumococos cultivados com biofilme para estabelecer carreamento assintomático, seguido por infecção por IAV tanto na nasofaringe quanto nos pulmões. Isso resultou em disseminação bacteriana para os pulmões, inflamação pulmonar e doença que progrediu para letalidade em uma fração de camundongos jovens23. Este estudo prévio demonstrou que tanto a infecção viral quanto a bacteriana alteraram a defesa do hospedeiro: a infecção viral promoveu disseminação bacteriana e a colonização bacteriana prévia prejudicou a capacidade do hospedeiro de controlar os níveis pulmonares de VAI23. O exame da resposta imune revelou que a infecção por IAV diminuiu a atividade antibacteriana dos neutrófilos, enquanto a colonização bacteriana atenuou a resposta do interferon tipo I crítica para a defesa antiviral23. É importante ressaltar que esse modelo reproduzia a suscetibilidade do envelhecimento. Comparados a camundongos jovens, os camundongos velhos apresentaram sinais de doença mais precocemente, apresentaram doença clínica mais grave e sucumbiram à infecção com maior frequência23. O trabalho apresentado neste manuscrito mostra que o grau da doença também é dependente da cepa bacteriana, pois cepas invasivas de pneumococo apresentam disseminação mais eficiente na infecção por IAV, mostram sinais mais evidentes de inflamação pulmonar e resultam em taxas aceleradas de doença em comparação com cepas não invasivas. Assim, este modelo de co-infecção S. pneumoniae/IAV permite o exame detalhado de fatores patogênicos e do hospedeiro e é adequado para estudar respostas imunes a infecções polimicrobianas nas diferentes fases da progressão da doença.

<table><tbody><tr><td>Ácido 4-aminobenzóico&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AAA1267318</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>de placas de fundo redondas de 96 poços</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650101</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; m Filtros</td><td>Fisher</td><td>07-201-432</td><td></td></tr><tr><td>Adenina</td><td>Fisher</td><td>AC147440250</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>Avicel</td><td>Fisher</td><td>501785325</td><td>Microcirtallina celulose&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampão de Fixação BD Cytofix</td><td>Fisher</td><td>BDB554655</td><td>Fixation Buffer</td></tr><tr><td>BD Fortessa</td><td></td><td></td><td>Citômetro de fluxo&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo de Polietileno Intramédico BD&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>427410</td><td>Tubulação para lavagem nasal</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Seringas Descartáveis com Pontas Luer-Lok (1 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Coletor de sangue capilar Microtainer e fechamento BD Microgard</td><td>Fisher</td><td>02-675-185</td><td>Tubos de coleta</td></tr><tr><td>de sangue Dinucleotídeo de adenina beta-nicotinamida Fisher</td><td></td><td>AAJ6233703</td><td>Mix IV Estoque</td></tr> de <tr><td>biotina</td><td>Fisher</td><td>AC230090010</td><td>Estoque de vitaminas</td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000644</td><td>Camundongos usados neste estudo</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>C77-500</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>CD103 BV 421</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB562771</td><td>Clone: M290 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD11b APC</td><td>Invitrogen</td><td>50-112-9622</td><td>Clone: M1/70, DF 1:300</td></tr><tr><td>CD11c PE</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB565592</td><td>Clone: N418 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD3 AF 488</td><td>BD Bioscience</td><td>OB153030</td><td>Clone: 145-2C11 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD4 V450</td><td>BD Horizon</td><td>BDB560470</td><td>Clone: RM4.5 DF 1:300</td></tr><tr><td>CD45 APC eF-780</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-9642</td><td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD45 PE</td><td>Invitrogen</td><td>50-103-70</td><td>Clone: 30-F11 DF 1:200</td></tr><tr><td>CD8&alpha; BV 650</td><td>BD Horizon</td><td>BDB563234</td><td>Clone: 53-6.7 DF 1:200</td></tr><tr><td>Cloreto de colina</td><td>Fisher</td><td>AC110290500</td><td>Suplemento final para CDM</td></tr><tr><td>Corning Filtro a Vácuo/Sistemas de Armazenamento Descartáveis</td><td>Fisher</td><td>09-761-107</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Frascos T-25 Tratados com Cultura de Tecidos Corning</td><td>Fisher</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Placas de Poço Múltiplo Transparente Costar</td><td>Fisher</td><td>07-201-590</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; DMEM com L-Glutamina e 4,5 g/L de glicose; Sem piruvato de sódio</td><td>Fisher</td><td>MT10017CM</td><td></td></tr><tr><td>Cianocobalamina</td><td>Fisher</td><td>AC405925000</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>D39</td><td>National Collection of Type Culture (NCTC)</td><td>NCTC 7466</td><td>Streptococcus pneumoniae cepa</td></tr><tr><td>D-Alanina</td><td>Fisher</td><td>AAA1023114</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>D-pantotenato de cálcio</td><td>Fisher</td><td>AC243301000</td><td>estoque de vitaminas</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>Starter stock</td></tr><tr><td>Dnase&nbsp;</td><td>Worthington Bioquímica&nbsp;</td><td></td><td></td>LS002147</tr><tr><td>Eagles Mínimo Essencial</td> Médio <td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>BDH4616-500G</td><td></td></tr><tr><td>EF3030</td><td>Centro de Controle e Prevenção de Doenças&nbsp;</td><td>Disponível através do banco isolado</td><td>solicitação Streptococcus pneumoniae cepa, solicitação usando o nome da cepa</td></tr><tr><td>F480 PE Cy7</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-9713</td><td>Clone: BMB DF 1:200</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Tubos de Centrífuga Cônicos</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td>50 mL tubo de fundo redondo</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Tubos de Teste de Polipropileno de Fundo Redondo Com Tampa</td><td>Fisher</td><td>14-959-11B</td><td>Tubo de fundo redondo de 15 mL</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; Tubos de Ensaio de Poliestireno de Fundo Redondo (5 mL)</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td>Tubos FACS&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermofisher</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato Férrico Nonahidratado</td><td>Fisher</td><td>I110-100</td><td>Mix III estoque</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação Delicada Fisherbrand Fisher</td><td></td><td>08-951-5</td><td>Instrumentos usados para colheita</td></tr><tr><td>Alças de Inoculação Descartáveis Fisherbrand&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22-363-602</td><td>Alças de inoculação&nbsp;</td></tr><tr><td>Pinça de Tecido de Dissecção Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>13-812-38</td><td>para colheita</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga Premium Fisherbrand: 1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-137</td><td>Tubos de Micocentrífuga</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Seringas Estéreis para Uso Único (10 mL)</td> Ácido Fólico <td>Fisher</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>AC216630500</td><td>Estoque de Vitaminas</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 (ATCC)</td> <td>Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; HBSS, cálcio, magnésio, sem fenol vermelho</td><td>Fisher</td><td>14025134</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; MEM (modificação de Temin) (2x), sem fenol vermelho</td><td>Fisher</td><td>11-935-046</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Fisher</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Solução Trypan Blue, 0.4%</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; Tripsina-EDTA (0,25%), vermelho de fenol</td><td>Fisher</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (Certificado ACS)</td><td>Fisher</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher</td><td>AA3643530</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Guanina</td><td>Fisher</td><td>AAA1202414</td><td>Mix II Contas</td></tr> de <tr><td>compensação Invitrogen UltraComp eBeads</td><td>Sulfato</td> de ferro (II) Fisher <td>50-112-9040</td><td></td></tr><tr><td> heptahidratado</td><td>Fisher</td><td>AAA1517836</td><td>Mix III estoque</td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Fisher</td><td>AAJ6027918</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Fisher</td><td>AAA1573814</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Asparagina</td><td>Fisher</td><td>AAB2147322</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AAA1352022</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Fisher</td><td>AAA1043518</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-cisteína monohidratado</td><td>Fisher</td><td>AAA1038914</td><td>Suplemento final para CDM</td></tr><tr><td>L-Cistina</td><td>Fisher</td><td>AAA1376218</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Ácido L-glutâmico&nbsp;</td><td>Estoque</td> de <td>aminoácidos</td><td>Fisher AC156211000</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher</td><td>O2956-100</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-histidina</td><td>Fisher</td><td>AC166150250</td><td>estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Kit de coloração de células mortas azuis fixável, para excitação UV</td><td>Invitrogen</td><td>50-112-1524</td><td>Clone: N/A DF 1:500</td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Fisher</td><td>AC166170250</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Fisher</td><td>BP385-100</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Fisher</td><td>AAJ6222514</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Fisher</td><td>AAA1031822</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Baixa endotoxina BSA&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1470-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-fenilalanina</td><td>Fisher</td><td>AAA1323814</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Fisher</td><td>AAA1019922</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-serina</td><td>Fisher</td><td>AC132660250</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Fisher</td><td>AC138930250</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>Fisher</td><td>AAA1023014</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Fisher</td><td>AAA1272014</td><td>Estoque de aminoácidos</td></tr><tr><td>Ly6C BV 605</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB563011</td><td>Clone: AL-21 DF 1:300</td></tr><tr><td>Ly6G AF 488&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>NC1102120</td><td>Clone: IA8, DF 1:300</td></tr><tr><td>Células do Rim Canino Madin-Darby (MDCK)</td><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano (ATCC)</td><td>CCL-34</td><td>MDCK para análise de PFU&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnésio 7-Hidrato</td><td>Fisher</td><td>60-019-68</td><td>CDM estoque inicial</td></tr><tr><td>Sulfato de Manganês</td><td>Fisher</td><td>M113-500</td><td>Mix I stock</td></tr><tr><td>Água</td><td></td><td></td><td>MilQ Água ultra-pura</td></tr><tr><td>Mouse Fc Block</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB553142</td><td>Clone: 2.4G2 DF 1:100</td></tr><tr><td>MWI VETERINÁRIO&nbsp; POMADA VETERINÁRIA PURALUBE</td><td>Fisher</td><td>NC1886507</td><td>Lubrificante para os olhos para infecção</td></tr><tr><td>NCI-H292 linha celular de carcinoma mucoepidermóide&nbsp;</td>Linha <td>de células epiteliais pulmonares</td> <td>ATCC</td><td>CRL-1848</td> H292 para crescimento de biofilme</tr><tr><td>Niacinamida</td><td>Fisher</td><td>18-604-792</td><td>Estoque de vitaminas</td></tr><tr><td>NK 1.1 AF 700</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-4692</td><td>Clone: PK136 DF 1:200</td></tr><tr><td>Oxirase Para Caldo 50Ml Garrafa 1/Pk</td><td>Fisher</td><td>50-200-5299</td><td>Para remover oxigênio de culturas</td></tr><tr><td>líquidas Paraformaldeído 4% em PBS</td><td>Thermoscientific</td><td>J19932-K2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Pivetal&nbsp;</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-8440</td><td>Isoflurano para anestesia durante a infecção&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfato de Potássio Dibásico</td><td>Fisher Chemical</td><td>P288-500</td><td>Estoque inicial</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio Monobásico</td><td>Fisher Chemical</td><td>P285-500</td><td>Estoque inicial</td></tr><tr><td>Cloridrato de piridoxal&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>AC352710250</td><td>Estoque de vitaminas</td></tr><tr><td>Cloridrato de piridoxamina</td><td>Fisher</td><td>AAJ6267906</td><td>Mix I estoque</td></tr><tr><td>Riboflavina</td><td>Fisher</td><td>AC132350250</td><td>estoque de vitaminas</td></tr><tr><td>Acetato de sódio</td><td>VWR</td><td>0530-500G</td><td>Estoque inicial</td></tr><tr><td>Azida de sódio&nbsp;</td><td>Biorreagentes Fisher</td><td>BP922I-500</td><td>Para tampão FACS</td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio</td><td>Fisher Chemical</td><td>S233-500</td><td>Estoque inicial e suplemento final para CDM</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Dibásico</td><td>Fisher Chemical</td><td>S374-500</td><td>Estoque inicial</td></tr><tr><td>Fosfato de Sódio Monobásico</td><td>Fisher Chemical</td><td>S369-500</td><td>Estoque inicial</td></tr><tr><td>TCR APC&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>50-112-8889</td><td>Clone: GL-3 DF 1:200</td></tr><tr><td>TCR&beta; APC-Cy7</td><td>BD Pharmigen</td><td>BDB560656</td><td>Clone: H57-597 DF 1:200</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Blood Agar com Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>R01227</td><td>Placas de ágar sangue com o antibiótico gentamicina&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Tripsina, TPCK Treated</td><td>Fisher</td><td>PI20233</td><td></td></tr><tr><td>Tialidrato</td> Estoque de vitaminas <td></td><td>Fisher</td><td>AC148991000</td></tr><tr><td>TIGR4</td><td>ATCC</td><td>BAA-334</td><td>Streptococcus pneumoniae cepa</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Fisher</td><td>AC157300250</td><td>Mix II estoque</td></tr><tr><td>Worthington Biochemical Corporation&nbsp; Colagenase, Tipo 2, 1 g</td><td>de Fisher</td><td>NC9693955</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de camundongo para a transição de streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

O Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é um colonizador assintomático da nasofaringe na maioria dos indivíduos, mas pode evoluir para patógeno pulmonar e sistêmico após a infecção pelo vírus influenza A (IAV). A idade avançada aumenta a suscetibilidade do hospedeiro à pneumonia pneumocócica secundária e está associada a desfechos agravados da doença. Os fatores do hospedeiro que conduzem esses processos não estão bem definidos, em parte devido à falta de modelos animais que reproduzam a transição da colonização assintomática para a doença clínica grave. 
Este artigo descreve um novo modelo de camundongo que recria a transição de pneumococos de carreador assintomático para doença após infecção viral. Nesse modelo, camundongos são primeiro inoculados intranasalmente com pneumococos cultivados com biofilme para estabelecer carreamento assintomático, seguido por infecção por IAV tanto na nasofaringe quanto nos pulmões. Isso resulta em disseminação bacteriana para os pulmões, inflamação pulmonar e sinais óbvios de doença que podem evoluir para letalidade. O grau da doença é dependente da cepa bacteriana e dos fatores do hospedeiro. 
É importante ressaltar que esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento, pois em comparação com camundongos jovens, os camundongos velhos apresentam doença clínica mais grave e sucumbem à doença com mais frequência. Ao separar carreador e doença em etapas distintas e fornecer a oportunidade de analisar as variantes genéticas do patógeno e do hospedeiro, este modelo de co-infecção S. pneumoniae/IAV permite o exame detalhado das interações de um importante patobionte com o hospedeiro em diferentes fases da progressão da doença. Esse modelo também pode servir como uma importante ferramenta para identificar potenciais alvos terapêuticos contra pneumonia pneumocócica secundária em hospedeiros suscetíveis.

Este artigo descreve um novo modelo de camundongo para a transição de pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Este modelo pode ser facilmente adaptado para estudar interações polimicrobianas e patógeno-hospedeiro durante as diferentes fases de progressão da doença e em vários hospedeiros.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Este método descreve um novo modelo de camundongo para estudar a transição do pneumococo de um colonizador assintomático para um patógeno causador de doença durante a infecção viral. Ele imita mais de perto o que acontece em humanos. Esse modelo pode ser uma ferramenta importante para identificar potenciais alvos terapêuticos contra a pneumonia pneumocócica secundária em hospedeiros suscetíveis.Esse modelo reproduz a suscetibilidade do envelhecimento. Portanto, ele pode ser usado para entender quais aspectos do hospedeiro se tornam defeituosos com a idade e nos permite adaptar as opções de tratamento para hospedeiros idosos vulneráveis. O crescimento do biofilme pneumocócico é um desafio, uma vez que as diferentes cepas levam diferentes quantidades de tempo.Meu conselho é tentar cultivar o biofilme antes de executar o estudo com animais. Uma vez que as células H292 são 100% confluentes, lave as células três vezes com PBS. Em seguida, adicione 250 microlitros de paraformaldeído a 4% por poço para fixar as células e incube por uma hora no gelo ou durante a noite a quatro graus Celsius.Strake streptococcus pneumoniae cepa de interesse na placa de ágar sangue e incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, inocular as bactérias da placa em meio fresco e quimicamente definido ou CDM mais Oxyrase, lavando as bactérias da placa adicionando um mililitro do MDL mais Oxyrase e levantando suavemente as colônias bacterianas usando o lado de uma ponta de pipeta de um mililitro, tomando cuidado para não raspar o ágar. Diluir a cultura bacteriana em MDL mais Oxirase para um OD inicial de 600 de 0,05.Em seguida, cresça as bactérias em um tubo cônico de 50 mililitros frouxamente tampado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até que OD de 0,2 seja alcançado. Em seguida, vórtice o tubo de cultura bacteriana. Semeando 0,5 mililitros da cultura nas células H292 fixas e adicionando mais 0,5 mililitros de MDL mais meio Oxyrase por poço.Adicione MDL mais Oxyrase aos poços de controle sem bactérias. Incubar a placa durante 48 horas a 34 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. A cada 12 horas, após a semeadura inicial, substitua suavemente os 0,5 mililitros do meio por MDL fresco mais Oxirase.Tenha cuidado para não atrapalhar a formação do biofilme. Verifique o fundo da placa para biofilme e procure aumentar a nebulosidade com o passar do tempo devido ao crescimento do biofilme. Após 48 horas, remova o sobrenadante e lave o biofilme duas vezes com um mililitro de PBS.Em seguida, ressuspenda o biofilme em um mililitro de MDL fresco e pipete para cima e para baixo vigorosamente para levantar o biofilme. Para cada cepa bacteriana, agrupe a cultura de todos os poços em um tubo de 50 mililitros. Misture bem inclinando suavemente o tubo bem tampado para cima e para baixo várias vezes.Em seguida, adicione 40% de glicerol e MDL em volumes iguais para obter uma suspensão bacteriana com uma concentração final de 20% de glicerol. Alíquota um mililitro em um tubo de microcentrífuga, congele rapidamente no gelo seco e economize a menos 80 graus Celsius. Descongele as alíquotas cultivadas no gelo e gire a 1.700 G por cinco minutos.Retire e descarte cuidadosamente o sobrenadante sem interromper o pellet. Em seguida, lave o pellet ressuspendendo-o em um mililitro de PBS e gire-o novamente. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet no volume necessário para atingir a concentração desejada.Inocular o camundongo C57 preto seis machos por via intranasal com cinco vezes 10 até a sexta colônia formando unidades ou UFC pipetando cinco microlitros do inóculo diluído em cada naris. Após a inoculação, segure o rato com firmeza, estabilizando a cabeça até que o volume seja inalado. Uma vez que o vírus tenha descongelado, dilua o vírus em PBS para a concentração desejada.Coloque lubrificante oftálmico nos olhos do rato antes da anestesia. Infectar imediatamente o camundongo anestesiado com 50 microlitros de 20 unidades formadoras de placa, ou PFU, do vírus influenza A ou IAV intratraquealmente usando pinças rombas para puxar a língua para fora da boca e pipetando o volume de líquido pela traqueia. Após a recuperação, inocular intranasalmente 10 microlitros de 200 UFP de IAV usando o método de inoculação descrito anteriormente.Para a coleta pulmonar, usando tesoura de dissecção, corte as laterais da caixa torácica exposta e puxe suavemente as costelas para cima em direção à cabeça do mouse para expor o coração. Insira uma agulha de calibre 25 acoplada a uma seringa de 10 mililitros pré-cheia com PBS no ventrículo direito e comece a perfundir lentamente. Procure clareamento dos pulmões como indicador de perfusão bem-sucedida.Lave lentamente para evitar a quebra do tecido pulmonar. Levante o coração com pinças e faça um corte para separar os pulmões e o coração. Uma vez separado, pegue todos os lóbulos do pulmão com pinça e enxágue em um prato com PBS estéril para remover qualquer sangue residual.Em uma placa de Petri, pique o pulmão em pedaços pequenos e misture bem. Remova metade da mistura pulmonar para determinar a UFC bacteriana ou a UFP viral e coloque-a em um tubo de fundo redondo de 15 mililitros pré-preenchido com 0,5 mililitros de PBS para homogeneização. Retirar a outra metade do pulmão para citometria de fluxo e colocá-lo em uma placa de 24 poços não tratada com cultura de tecidos com cada poço pré-preenchido com 0,5 mililitros de RP10.Deixar à temperatura ambiente até ao processamento. Para homogeneizar o tecido coletado, limpe a sonda homogeneizadora, colocando-a em etanol 70% e ligando o homogeneizador a 60% de potência por 30 segundos. Repita este passo em água estéril durante 10 segundos.Homogeneizar cada tecido por um minuto. Para enumeração dos números bacterianos, diluições seriadas em placas de ágar sangue. Para calcular o total de UFC use 10 microlitros para chapear e anotar o volume final em mililitros para cada amostra.Plaquear as amostras de nasofaringe em placas de ágar sangue suplementadas com três microgramas por mililitro de gentamicina para selecionar o crescimento de S pneumoniae enquanto inibe o crescimento de outros microrganismos. Incubar durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para citometria de fluxo, adicione 500 microlitros de tampão de digestão a cada poço de uma placa de 24 poços contendo uma amostra de pulmão.Incubar a placa por 45 minutos a uma hora. Em seguida, usando uma micropipeta P-1000, mova os pulmões digeridos e coloque-os no filtro. Em seguida, use o êmbolo de uma seringa de três mililitros para amassar a amostra.O inóculo de crescimento de biofilme de S.pneumoniae resulta em carreamento pneumocócico consistente restrito à nasofaringe, evitando disseminação sistemática. A apresentação da doença em camundongos coinfectados com S pneumoniae IAV foi dependente da cepa bacteriana. Embora não tenha havido diferença significativa no número bacteriano da nasofaringe entre nenhuma das cepas, S pneumoniae, TIGR4 e D39, mas não EF3030 disseminaram-se para os pulmões até 48 horas após a infecção por IAV.40% dos camundongos infectados com S pneumoniae TIGR4 apresentaram disseminação bacteriana para os pulmões e, destes, metade deles tornou-se bacterêmica. Camundongos infectados com S pneumoniae D39 apresentaram 100% de disseminação para os pulmões e metade disso apresentou bacteremia. No rastreamento da sobrevida global, independentemente da cepa bacteriana, a taxa de sobrevivência dos camundongos coinfectados foi significativamente menor do que os camundongos isolados desafiados com S pneumoniae.Esse modelo também foi usado para avaliar a presença de várias células imunes nos pulmões após a infecção pelo IAV. As cepas bacterianas D39 e TIGR4 provocaram um aumento significativo acima da linha de base no influxo de células imunes inflamatórias da circulação, como neutrófilos e monócitos, enquanto EF3030 não.Essas respostas antivirais foram significativamente embotadas em camundongos infectados intranasalmente com S pneumoniae antes do desafio viral. Em camundongos infectados, os títulos virais não variaram entre as coortes jovens e envelhecidas. Camundongos velhos apresentaram sinais mais precoces e significativamente mais graves da doença e morreram mais rápido, dentro de 24 horas, enquanto os controles jovens sobreviveram melhor à infecção.Separar o carreamento e a doença em etapas distintas nos permite examinar tanto a resposta imune quanto os fatores bacterianos e/ou virais importantes em diferentes fases da progressão da doença. Esperamos que este modelo seja adaptado por outros laboratórios para estudar outras interações polimicrobianas e interações de patógenos hospedeiros durante diferentes fases de progressão da doença e entre os vários hospedeiros.

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Research

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Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Estabelecer um modelo de camundongo bacteriana crônica infectados com...

Crônico Salmonella Modelo de camundongos infectados

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Processamento de Tecidos Infectados para Enumeração Bacteriana em um Modelo de Co-Infecção de Camundongos

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

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Os modelos animais provaram ser ferramentas valiosas para a definição de acolhimento e de patógenos mecanismos específicos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação crônica. Aqui nós descrevemos um modelo do rato de infecção oral com o patógeno humano Porphyromonas gingivalis e metodologias detalhe para avaliar a progressão da inflamação em sites locais e sistêmicos.

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