Estudar DNA Looping por Single-Molecule FRET

Este estudo apresenta um procedimento experimental detalhado para medir a dinâmica de loop de DNA de cadeia dupla usando uma única molécula de fluorescência Resonance Energy Transfer (FRET). O protocolo também descreve como extrair a densidade de probabilidade looping chamado o factor de J.

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar como a dinâmica de looping do DNA de fita dupla é afetada pela forma intrínseca do DNA sem o uso de proteínas de ligação ao DNA. Isso é conseguido incorporando moléculas de corante em fragmentos de DNA de fita dupla de diferentes curvaturas, de modo que o loop de DNA possa ser monitorado por ressonância de fluorescência, transferência de energia ou traste. Os eventos reversíveis de looping e un looping das moléculas de DNA individuais podem então ser observados por microscopia de reflexão interna total.

A taxa de looping do DNA pode então ser extrapolada a partir das trajetórias de tempo de cada fluorescência de molécula única. Em última análise, a probabilidade de looping do DNA em relação à forma intrínseca do fragmento pode ser medida. A principal vantagem deste ensaio de loop de DNA é que ele não depende da proteína de ligação ao DNA A, o que pode afetar a cinética de loop do DNA A.

O protocolo simples é sobre o uso de uma técnica chamada fluorescência, ressonância, transferência de energia e síntese de DNA baseada em PCR. Para medir a probabilidade de aparência do DNA Comece projetando DNAs globalmente curvos repetindo uma sequência de 10 MER. Por exemplo, esta sequência representativa é um DNA curvo de 186 pares de bases, onde X é uma base extra aleatória e as sequências que flanqueiam a sequência repetitiva de 10 mers são sequências adaptadoras.

Em seguida, execute a PCR com os primers um e dois com a marcação do doador de trastes SI três do primer dois nas cinco extremidades principais. Em seguida, execute a PCR com os primers três e quatro com a marcação SCI cinco do aceptor de trastes através da espinha dorsal e do ligante de biotina nas cinco extremidades principais do primer três. Depois de purificar os produtos de PCR usando um kit de limpeza de PCR, misture os produtos marcados com SCI três e os cinco marcados com SCI em um tampão para troca de fita em concentrações finais de 0,4 micromolar e 0,1 micromolar, respectivamente.

Em seguida, incube os fios a 98,5 graus Celsius por dois minutos, resfriando gradualmente a cinco graus Celsius com uma taxa de rampa de 0,1 graus Celsius por segundo e, em seguida, incubando a cinco graus Celsius por duas horas. Para trocar os fios para preparar a célula de fluxo, use uma furadeira e brocas de diamante para criar de seis a sete pares de furos ao longo das duas bordas opostas de uma lâmina de vidro de três por uma polegada. Quando todos os furos tiverem sido perfurados, esfregue a lâmina sob água corrente para remover qualquer pó de vidro visível.

Coloque as lâminas na vertical em uma jarra de vidro e encha-a com água destilada. Sonicar o frasco por 15 minutos e, em seguida, transferir as lâminas para um frasco de vidro dedicado à limpeza com acetona. Encha o frasco com acetona e sonice as lâminas em acetona por mais 15 minutos.

Em seguida, borrife as lâminas com etanol e depois com água para enxaguá-las e, em seguida, transfira as lâminas para um frasco de polipropileno. Encha o frasco de polipropileno com hidróxido de potássio de cinco molares e, em seguida, sonice as lâminas por mais 15 minutos após a última lavagem, enxágue as lâminas em água destilada, seguido de mais 15 minutos. Sonicação depois de limpar as lamínulas.

Da mesma forma, dispense 80 microlitros de solução de PEG recém-preparada em cada lâmina e, em seguida, abaixe suavemente uma lamínula sobre o pino. Após 45 minutos, use uma pinça para remover as lamínulas das lâminas, enxágue as lâminas e as lamínulas com uma quantidade abundante de água destilada. Em seguida, seque-os em um desidratado quando as lamínulas e as lâminas estiverem secas, coloque tiras finas de fita adesiva dupla na lâmina para formar canais, alinhe uma lamínula sobre as tiras e pressione firmemente a lamínula para formar canais estanques ao líquido.

Em seguida, use epóxi de cinco minutos para selar as bordas dos canais para imobilizar as moléculas para microscopia. Primeiro, injete 15 microlitros de solução de neu tradina em um canal. Após dois minutos, enxágue o canal com 100 microlitros de tampão T 50 e, em seguida, injete 50 microlitros de amostra de DNA no canal.

Após cinco minutos, enxágue o DNA não ligado com 100 microlitros de tampão T 50 e, em seguida, preencha o canal com um tampão de imagem que contém o sistema de eliminação de oxigênio. Agora coloque óleo de imersão na objetiva do microscópio e, em seguida, use clipes de amostra para fixar a célula de fluxo ao estágio do microscópio. Ligue o laser de 532 nanômetros.

Use a visualização ao vivo das imagens fluorescentes no monitor para refinar. Ajuste o foco. Comece a aquisição de dados com o laser de 532 nanômetros ligado.

Pare a aquisição de dados quando a maioria das moléculas tiver fotoclareado para processar e analisar as imagens, use um script MATLAB para examinar todos os traços de tempo de molécula única que mostram várias transições entre os sinais de traste alto e baixo. Identifique os estados em loop e sem loop e, em seguida, encontre o limite que separa as duas distribuições determinando a interseção entre as duas curvas gaussianas ajustadas. Em seguida, calcule a eficiência frontal F dividindo a intensidade da ficção científica pela soma das intensidades SCI três e ficção científica.

Atribuindo os estados de loop com valores de traste altos e os estados de desloop com valores de traste baixos. Em seguida, usando um script MATLAB, analise o número cumulativo de moléculas ou NFT que fizeram um loop, ou seja, que atingiram o estado de traste alto em diferentes lapsos de tempo. Desde o início da aquisição de dados, o subloop K da taxa de looping pode ser extraído ajustando o NFT com uma função exponencial.

Se o NFT aumentar bi, basicamente ele pode ser equipado com uma função exponencial dupla, conforme ilustrado na equação. Nesse caso, o subloop K é obtido a partir dessa equação para determinar o fluxo do fator J. 20 microlitros de 30 a 50 picaMolar biotina sci cinco oligo ou primer três em um dos canais revestidos de porca como acabamos de demonstrar.

Em seguida, enxágue o canal com 100 microlitros de T 50 para lavar os oligos não ligados e, em seguida, flua o tampão de imagem recém-preparado complementado com oligo PS três para a câmara. Mantenha o laser de 532 nanômetros ligado e, em seguida, ligue brevemente o laser de 640 nanômetros para identificar os locais de qualquer oligo de ficção científica ligado à superfície. Em seguida, desligue o laser de 640 nanômetros e comece a monitorar o sinal do traste.

Use um script MATLAB para analisar o número de moléculas que começam no estado não ligado. Isso é com uma baixa intensidade de cinco sci, mas depois se transforma no estado IL. Ou seja, com uma alta intensidade de ficção científica em função do tempo a partir dos traços de intensidade de ficção científica, traça esse número de moléculas de ane versus o tempo ajustando a curva com uma única função exponencial para obter a taxa de ealing.

K sub anil, repita o experimento em diferentes concentrações de oligo do SI três para confirmar a linearidade entre a taxa de ajoelhamento e a concentração do reagente. Extraia a segunda ordem de uma constante de taxa de ajoelhar K prime sub ail da encosta. Finalmente, calcule o fator J onde K sub loop é a taxa de looping medida sob as mesmas condições de buffer para testar o efeito da curvatura intrínseca do DNA de fita dupla no looping.

Neste experimento, um par de bases 186 reto e um curvo. Os DNAs de fita dupla foram construídos em comparação com o DNA direto. O DNA curvo foi determinado para produzir mais eventos de trastes altos durante o mesmo período de tempo.

O DNA curvo também fez um loop quatro vezes mais frequente do que o DNA direto durante o mesmo tempo de aquisição, demonstrando que a curvatura intrínseca do DNA pode afetar significativamente a dinâmica do looping. Nesta etapa de análise final, o fator J foi calculado dividindo a taxa de looping pela primeira ordem, uma constante de taxa de ajoelhamento, e foi determinado como 61 mais ou menos três anos molares para o DNA reto e 265 mais ou menos 48 nanomolares para o DNA da curva de acordo com achados anteriores. Seguindo este procedimento, os efeitos do fator de acidente na mobilidade do looping, como temperatura, não tensionado e viscosidade, podem ser estudados.

Este protocolo será útil não apenas para estudar a física do polímero do DNA, mas também para demonstrar o poder da fluorescência de molécula única para estudantes de pesquisa iniciantes ou público leigo.