Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

O objetivo geral deste procedimento é desenvolver um ensaio simples, robusto e de alto rendimento para esticamento de moléculas únicas em fluxo, destinado ao estudo do transporte de moléculas ao longo do DNA. Isso é realizado primeiramente preparando DNA lambda marcado com biotina, ligando um oligonucleotídeo marcado com biotina ao DNA lambda. O segundo passo consiste em preparar lamínulas funcionalizadas com polietilenoglicol (PEG), seguindo um protocolo de reação em um único passo.

Em seguida, constrói-se uma cubeta de fluxo de alto rendimento, montando uma fita dupla face com canais pré-cortados entre uma lamínula funcionalizada com PEG e um bloco de polidimetilsiloxano ou PDMS contendo orifícios de entrada e saída. O passo final consiste em rastrear as trajetórias de moléculas fluorescentes individuais no canal de fluxo utilizando imagens de fluorescência de reflexão interna total, ou TIRF, com lapso de tempo. Para identificar as trajetórias de moléculas individuais difundindo ao longo do DNA lambda esticado pelo fluxo, utiliza-se um software personalizado confiável e eficiente de rastreamento de partículas únicas para analisar as imagens brutas de fluorescência.

As principais vantagens dessa configuração de ensaio em comparação com alternativas são a confiabilidade na preparação de lamínulas, maior capacidade de throughput, redução do tempo de manipulação manual no preparo das amostras e uma análise de dados não supervisionada mais simplificada. O procedimento será demonstrado por um pós-doutorando do meu laboratório, Dr. Kan Xiong. Antes de iniciar este ensaio, prepare todos os reagentes necessários conforme descrito no texto do protocolo.

Aqueça o estoque de DNA lambda a 0,5 miligramas por mililitro a 65 graus Celsius por 60 segundos e mergulhe imediatamente em gelo úmido. Misture 100 microlitros da solução de DNA lambda com dois microlitros de oligo marcado com biotina a 10 micromolar em um tubo de microcentrífuga. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por 60 segundos e depois resfrie lentamente até a temperatura ambiente.

Coloque a mistura no gelo. Adicione 11 microlitros de tampão de reação da T4 DNA ligase e misture suavemente. Em seguida, adicione dois microlitros equivalentes a 800 unidades de T4 DNA ligase e misture suavemente.

Incube a mistura por duas horas a 16 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Purifique o produto utilizando tubos de filtro centrífugo com limite nominal de peso molecular de 100 kilodaltons. Sonique lâminas número um em etanol 95% dentro de um frasco de coloração por 10 minutos e, em seguida, enxágue três vezes com água ultrapura.

Encha o frasco de coloração com hidróxido de potássio 1 M, sonique por 10 minutos novamente e, em seguida, lave três vezes com água ultrapura. Repita este ciclo duas vezes. Seque as lamínulas sob fluxo de gás nitrogênio seco e limpo.

Limpe e seque ainda mais as lamínulas realizando um tratamento com plasma de ar a uma pressão de 900 militorr por cinco minutos. Incube as lamínulas com 50 microlitros de silano-polietilenoglicol-biotina a 25 miligramas por mililitro dissolvido em etanol a 95% à temperatura ambiente por duas horas. Remova o excesso de polietilenoglicol com água ultrapura e seque as lamínulas recobertas com polietilenoglicol sob fluxo de gás nitrogênio seco e limpo.

Projete canais de fluxo usando software CAD e corte os canais em uma fita dupla face utilizando um cortador de fita. Remova os resíduos de fita dentro dos canais. Para fabricar lâminas de PDMS, misture completamente 45 gramas de PDMS com cinco gramas de reagente de reticulação usando um misturador.

Despeje a mistura em dois recipientes de Petri de 100 milímetros e deixe-os dentro de uma câmara de vácuo por cerca de 30 minutos, até que todas as bolhas de ar desapareçam. Deixe os recipientes dentro de uma estufa a 80 graus Celsius por cerca de duas horas, até que a PDMS solidifique. Corte uma placa de PDMS que tenha o mesmo tamanho da fita dupla face com canais pré-cortados.

Retire um filme protetor da fita dupla face e adira a um lado plano do bloco de PDMS. Faça furos para a saída e entrada utilizando um furador de biópsia com agulha de 23 graus. Retire o outro filme protetor da fita dupla face e adira à superfície funcionalizada da lamínula.

Fixe a célula de fluxo montada em um suporte de microscópio. Carregue todos os reagentes pré-desgaseificados em reservatórios que possuam uma tubulação de Tygon conectada a uma válvula solenoide e outra tubulação conectada a uma tubulação de PEEK que impedirá o refluxo de reagentes. O fluxo de reagentes é controlado por válvulas solenoides que são acionadas por um aplicativo de programação por script.

Prime um canal de fluxo passando tampão sem amostra. Insira outros três tubos de PEEK nos orifícios de entrada. Tenha cuidado para não induzir a formação de bolhas de ar dentro do canal.

Conecte uma tubulação de Tygon com uma tubulação curta de PEEK do orifício de saída até um recipiente de descarte de amostra. Passe uma solução de estreptavidina a 0,2 miligramas por mililitro e incube por cinco minutos. Em seguida, passe tampão sem componente para remover a estreptavidina não ligada.

Fluxione uma solução de albúmina sérica bovina a um miligrama por mililitro e incube por um minuto. Em seguida, fluxione tampão sem componente para remover a albúmina sérica bovina não ligada. Fluxione uma solução de DNA-lambda biotinilado a 100 picomolares e incube por 10 minutos.

Em seguida, faça passar tampão branco para lavar o excesso de DNA lambda não ligado. Para verificar a qualidade da lamínula funcionalizada com PEG, introduza um corante fluorescente para DNA, como o corante SYTOX Orange, e inicie a aquisição de imagens por fluorescência. Se a qualidade da lamínula for boa, a densidade dos DNA lambda esticados pelo fluxo será alta.

Além disso, ajuste o ângulo de TIRF para obter a maior relação sinal-ruído nas imagens de moléculas de lambda-DNA quase totalmente esticadas pelo fluxo. Para rastrear as trajetórias de moléculas individuais, inicie as incubações dentro de um novo canal, em seguida, introduza moléculas marcadas com fluoróforo em subnanomolar com uma taxa de fluxo suficientemente alta utilizando uma bomba de seringa e colete imagens de fluorescência em intervalos de tempo com uma taxa de quadros de 100 hertz. Normalmente, 10.000 quadros são coletados em um único campo de visão, e filmes de múltiplos campos de visão são adquiridos.

No final, realize novamente o fluxo do corante para coloração de DNA para confirmar que os DNAs ainda podem ser esticados por fluxo. Um software personalizado de rastreamento de partículas únicas será usado para identificar as trajetórias de moléculas individuais difundindo ao longo do DNA. O software determinará primeiramente as posições dos centróides das partículas individuais com alta precisão.

Remova as partículas aderidas à superfície da lamínula e, em seguida, vincule as partículas em diferentes quadros para formar trajetórias em lapso de tempo. A partir dessas trajetórias, serão estimadas as constantes de difusão 1D. Para iniciar a análise de dados, abra um aplicativo de programação de scripts e acesse o diretório do software de rastreamento de partículas individuais.

Abra um script chamado largedataprocess3.m. Um parâmetro importante a ser definido é o valor de limiar para a detecção de partículas individuais. Para determinar o valor de limiar ideal, execute o determine_threshold_value.

script. Este script mostrará como o valor do limiar afeta a detecção de partículas individuais. Após determinar o valor ideal do limiar, execute o largedataprocess3.

script. Após a conclusão da análise de rastreamento de partículas individuais, as trajetórias brutas serão filtradas executando o script trajectory_filtering.m.

Uma Interface Gráfica com o Usuário ou GUI é criada para visualizar a etapa de filtragem. No painel da GUI, defina o deslocamento mínimo ao longo do DNA, MinXDisp, como dois pixels. Defina o deslocamento máximo transversal ao DNA, MaxYDisp, como dois pixels.

Defina o número mínimo de quadros, minFrames, como 10. Defina o número mínimo de estados do tríade, minTriplets, como 10. Defina a constante mínima de difusão ao longo do DNA, D_par, como zero.

Defina a constante máxima de difusão estimada transversal ao DNA, D_trans, como 10 megabases ao quadrado por segundo. Defina o parâmetro estatístico mínimo, Chi2 Stat, como menos cinco. Defina a razão mínima de deslocamento ao longo do DNA em relação ao deslocamento transversal ao DNA, MinX/Y, como dois.

Todas as trajetórias brutas que atendem a esses parâmetros de filtragem serão listadas na tabela um e aquelas que não atendem serão listadas na tabela três. Clique em um número de trajetória na tabela um. A trajetória será exibida nos gráficos um e dois.

Clique no botão de reprodução para visualizar as imagens brutas de fluorescência. Clique em adicionar à tabela2 se esta trajetória for uma trajetória de deslizamento de molécula única. No final, todas as trajetórias adicionadas à tabela2 serão salvas ao fechar a interface gráfica.

As trajetórias que passaram por todas as etapas de filtragem são agrupadas para que a constante média de difusão seja estimada. Para calcular as constantes médias de difusão, basta executar o script calculate_mean_diffusion_constant.m. Este procedimento beneficiará muitas pessoas que estudam biofísica de moléculas únicas in vitro.