Uma molécula simples, robusto e alta taxa de transferência de fluxo alongamento do ensaio implementação para estudar o transporte de moléculas ao longo de DNA

O objetivo geral deste procedimento é construir um ensaio de alongamento de fluxo de molécula única simples, robusto e de alto rendimento para estudar o transporte de moléculas ao longo do DNA. Isso é feito preparando primeiro o DNA lambda marcado com biotina, ligando um oligo marcado com biotina ao DNA lambda. O segundo passo é preparar lamínulas funcionalizadas de polietilenoglicol ou PEG seguindo um protocolo de reação de uma etapa.

Em seguida, uma célula de fluxo de alto rendimento é construída imprensando uma fita dupla face com canais pré-cortados entre uma lamínula funcionalizada com PEG e uma placa de polidimetilsiloxano ou PDMS contendo orifícios de entrada e saída. A etapa final é rastrear trajetórias de moléculas fluorescentes únicas no canal de fluxo usando imagens de fluorescência de reflexão interna total de lapso de tempo ou TIRF. Para identificar as trajetórias de moléculas únicas que se difundem ao longo do lambda-DNA esticado por fluxo, um software de rastreamento de partícula única personalizado confiável e eficiente é usado para analisar imagens de fluorescência brutas.

As principais vantagens dessa configuração de ensaio em relação às alternativas são a confiabilidade da preparação da lamínula, maior capacidade de produção, tempo prático reduzido para preparação de amostras e análise de dados não supervisionada mais simplificada. Demonstrando o procedimento será um pós-doutorado em meu laboratório, Dr.Kan Xiong. Antes de iniciar este ensaio, prepare todos os reagentes necessários conforme descrito no texto do protocolo.

Aqueça 0,5 miligramas por mililitro de estoque de DNA lambda a 65 graus Celsius por 60 segundos e mergulhe no gelo úmido imediatamente. Misture 100 microlitros da solução de DNA lambda com dois microlitros de oligo marcado com biotina 10 micromolares dentro de um tubo de microcentrífuga. Aqueça a mistura a 65 graus Celsius por 60 segundos e depois esfrie lentamente até a temperatura ambiente.

Coloque a mistura no gelo. Adicione 11 microlitros de tampão de reação de DNA ligase T4 e misture delicadamente. Em seguida, dois microlitros equivalentes a 800 unidades de DNA ligase T4 e misture suavemente.

Incube a mistura por duas horas a 16 graus Celsius ou durante a noite a quatro graus Celsius. Purificar o produto utilizando tubos de filtro centrífugo com um limite de peso molecular nominal de 100 quilodaltons. Sonicate as lamínulas número um em etanol a 95% dentro de um frasco de coloração por 10 minutos e depois enxágue com água ultrapura três vezes.

Encha o frasco de coloração com um hidróxido de potássio molar, sonice por 10 minutos novamente e depois enxágue com água ultrapura três vezes. Repita este ciclo duas vezes. Seque as lamínulas sob fluxo de gás nitrogênio limpo e seco.

Limpe e seque as lamínulas realizando tratamento com plasma de ar a 900 militorr de pressão por cinco minutos. Incube lamínulas com 50 microlitros de 25 miligramas por mililitro de silano-polietilenoglicol-biotina dissolvido em etanol a 95% em temperatura ambiente por duas horas. Lave o excesso de polietilenoglicol com água ultrapura e seque as lamínulas revestidas de polietilenoglicol sob fluxo de gás nitrogênio limpo e seco.

Projete canais de fluxo usando software CAD e corte os canais em uma fita dupla face usando um cortador de fita. Remova os resíduos de fita dentro dos canais. Para fazer placas de PDMS, misture bem 45 gramas de PDMS com cinco gramas de reagente de reticulação usando um misturador.

Despeje a mistura em duas placas de Petri de 100 milímetros e deixe as placas dentro de uma câmara de vácuo por cerca de 30 minutos até que todas as bolhas de ar desapareçam. Deixe a louça dentro de um forno a 80 graus Celsius por cerca de duas horas até que o PDMS solidifique. Corte uma placa PDMS que corresponda ao tamanho da fita dupla face com canais pré-cortados.

Retire uma película de proteção da fita dupla face e cole em um lado plano da placa PDMS. Faça furos de saída e entrada na laje PDMS usando um perfurador de biópsia com uma agulha de calibre 23. Retire a outra película de proteção da fita dupla face e cole na superfície funcionalizada da lamínula.

Fixe a célula de fluxo montada em um inserto de platina de microscópio. Carregue todos os reagentes pré-desgaseificados em reservatórios que tenham um tubo Tygon conectado a uma válvula solenóide e outro tubo conectado a um tubo PEEK que impedirá o refluxo dos reagentes. O fluxo de reagentes é controlado por válvulas solenóides que são controladas por um aplicativo de programação de script.

Prepare um canal de fluxo fluindo em tampão em branco. Insira três outros tubos PEEK nos orifícios de entrada. Tenha cuidado para não induzir a formação de bolhas de ar dentro do canal.

Conecte um tubo Tygon com um tubo PEEK curto do orifício de saída a um sample recipiente de resíduos. Flua em 0,2 miligramas por mililitro de solução de estreptavidina e incube por cinco minutos. Em seguida, flua em um tampão em branco para lavar a estreptavidina não ligada.

Administrar um miligrama por mililitro de solução de albumina de soro bovino e incubar durante um minuto. Em seguida, flua em tampão em branco para lavar a albumina de soro bovino não ligada. Fluir em solução de biotina-lambda-DNA 100 picomolar e incubar por 10 minutos.

Em seguida, flua em um tampão em branco para lavar os DNAs lambda não ligados. Para verificar a qualidade da lamínula funcionalizada PEG, flua no corante de coloração de DNA, como o corante SYTOX Orange, e inicie a imagem de fluorescência. Se a qualidade da lamínula for boa, a densidade dos DNAs lambda esticados por fluxo será alta.

Além disso, ajuste o ângulo TIRF para obter a maior relação sinal-ruído de imagens de DNAs lambda quase totalmente esticados. Para rastrear trajetórias de moléculas únicas, inicie incubações dentro de um novo canal e, em seguida, funda moléculas marcadas com fluoróforo subnanomolar a uma taxa de fluxo alta o suficiente usando uma bomba de seringa e colete imagens de fluorescência de lapso de tempo com uma taxa de quadros de 100 Hertz. Normalmente, 10.000 quadros são coletados em um campo de visão e filmes de vários campos de visão são coletados.

No final, flua no corante de coloração de DNA novamente para confirmar que os DNAs ainda podem ser esticados por fluxo. Um software personalizado de rastreamento de partícula única será usado para identificar trajetórias de moléculas únicas que se difundem ao longo do DNA. O software determinará primeiro as posições do centróide de partículas únicas com alta precisão.

Remova as partículas que estão presas na superfície da lamínula e, em seguida, vincule as partículas em diferentes quadros para formar trajetórias de lapso de tempo. A partir dessas trajetórias, as constantes de difusão 1D serão estimadas. Para iniciar a análise de dados, abra um aplicativo de programação de script e vá para o diretório do software de rastreamento de partícula única.

Abra um script chamado largedataprocess3.m. Um parâmetro importante a ser definido é o valor limite para detecção de partícula única. Para determinar o valor limite ideal, execute o determine_threshold_value.

m script. Esse script visualizará como o valor limite afeta a detecção de partícula única. Depois de determinar o valor limite ideal, execute o largedataprocess3.

m script. Após a conclusão da análise de rastreamento de partícula única, as trajetórias brutas serão filtradas executando o trajectory_filtering. m script.

Uma interface gráfica do usuário ou GUI é criada para visualizar a etapa de filtragem. No painel GUI, defina o deslocamento mínimo ao longo do DNA, MinXDisp, para dois pixels. Defina o deslocamento máximo transversal ao DNA, MaxYDisp, para dois pixels.

Defina o número mínimo de quadros, minFrames, como 10. Defina o número mínimo de estados de trigêmeos, minTriplets, como 10. Defina a constante de difusão mínima ao longo do DNA, D_par como zero.

Defina a constante de difusão máxima estimada transversal ao DNA, D_trans, para 10 mega pares de bases ao quadrado por segundo. Defina o parâmetro estatístico mínimo, Chi2 Stat, como menos cinco. Defina a proporção mínima de deslocamento ao longo do DNA para aquela transversal ao DNA, MinX / Y, para dois.

Todas as trajetórias brutas que passarem por esses parâmetros de filtragem serão listadas na tabela um e as que não passarem serão listadas na tabela três. Clique em um número de trajetória na tabela um. A trajetória será exibida nos gráficos um e dois.

Clique no botão play para reproduzir as imagens de fluorescência brutas. Clique em adicionar à tabela2 se essa trajetória for uma única trajetória deslizante de molécula. No final, todas as trajetórias adicionadas à tabela2 serão salvas ao fechar a GUI.

As trajetórias que passaram por todas as etapas de filtragem são agrupadas a partir das quais a constante de difusão média será estimada. Para calcular as constantes médias de difusão, basta executar o script calculate_mean_diffusion_constant.m. Este procedimento beneficiará muitas pessoas que estudam biofísica de molécula única in vitro.