Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo com crista de ribonuclease. Isso é feito removendo rapidamente o pâncreas da carcaça de um camundongo sacrificado. Em seguida, o pâncreas submergiu em reagente de lise e o tecido é homogeneizado.

Após a centrifugação, o RNA é isolado do sobrenadante usando protocolos padrão e a solução inibidora de RNAs é adicionada à solução final de RNA. A etapa final é limpar cuidadosamente as lâminas do homogeneizador, removendo quaisquer pedaços de tecido presos nas lâminas e, em seguida, realizando uma série de lavagens com etanol e água. Em última análise, este procedimento permite o isolamento de RNA para pâncreas de camundongo com um número de integridade de RNA maior que sete para ser usado para análise de expressão gênica de rotina.

Meu nome é Tom Schmid e trabalho com RNA há mais de 20 anos e, em todo esse tempo, não experimentei nada tão difícil quanto isolar RNA com alta integridade para o pâncreas de camundongo. A técnica que vamos mostrar foi desenvolvida para o pâncreas de camundongos, mas realmente não há razão para que não possa ser usada para uma variedade de outros tecidos, incluindo tecidos de células humanas, linhagens celulares ou outros tecidos de camundongos, incluindo tecidos ricos em nuclease de costelas, como o baço. O uso das sugestões deste protocolo permitirá isolar o RNA com alta integridade do pâncreas de camundongos.

Isso pode ser usado para muitas aplicações downstream, como QPCR, matrizes de expressão gênica ou RNA-Seq. Ola Elgamal. Um estudante de pós-graduação sênior em meu laboratório demonstrará essa técnica após a eutanásia do mouse conforme descrito no protocolo de texto.

Prenda a carcaça perfurando cada um dos animais com quatro patas em uma superfície plana usando agulhas hipodérmicas de calibre 25 usando instrumentos cirúrgicos estéreis. Corte a parte central do mouse e remova rapidamente o pâncreas do mouse. Use a pinça para segurar o pâncreas e corte-o do baço e do intestino delgado usando uma tesoura de mola.

Tenha cuidado para não esticar o pâncreas durante a remoção do mouse. A ruptura do tecido pode liberar ribonuclease. Coloque todo o pâncreas em um tubo de 50 centímetros cúbicos contendo oito mililitros de reagente de lise gelada.

Tampe o tubo e agite brevemente para imergir o tecido no reagente e prossiga imediatamente para a próxima etapa sem demora. Em seguida, homogeneizar o pâncreas Por cinco segundos. É importante pressionar as lâminas do homogeneizador no fundo do tubo da centrífuga para permitir que o tecido seja puxado para dentro das lâminas para uma homogeneização eficiente.

Para remover o tecido não digerido, transfira dois mililitros de reagente de lise contendo o pâncreas lisado para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Colete dois tubos de microcentrífuga de homogenato por centrífuga de isolamento a quatro graus Celsius, 12.000 vezes G por cinco minutos para pellet o tecido não digerido. Esta é uma etapa crítica, pois a transferência de tecido não digerido para soluções subsequentes de RNA provavelmente contaminará a amostra com ribonuclease.

Limpe as lâminas do homogeneizador colocando-as em 10 mililitros de etanol a 70%. Ative o homogeneizador por cerca de 20 segundos para remover quaisquer pedaços de tecido que possam estar presos nas lâminas. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para remover quaisquer pedaços que permaneçam nas lâminas do homogeneizador.

Limpe as lâminas do homogeneizador novamente em água, ativador syn de RNA geral e etanol 70%. Por fim, seque o eixo do homogeneizador com um lenço umedecido limpo. Transfira um mililitro do SNA para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Coloque todos os tubos contendo homogeneizado no gelo úmido enquanto prossegue para a próxima etapa. Proceder imediatamente com o isolamento do ARN e conservar o tubo replicado a 80 graus Celsius negativos para utilização futura. Descarte o reagente de lise restante em um recipiente de resíduos químicos apropriado.

A seção a seguir usa um kit de purificação de RNA. A vantagem do kit de purificação é que ele isolará o RNA total, incluindo pequenos RNAs. Comece o isolamento adicionando 200 microlitros de clorofórmio à solução homogeneizada.

Tampe o tubo e agite vigorosamente com a mão por 15 segundos. Em seguida, deixe o tubo repousar em temperatura ambiente por dois a três minutos após a centrifugação por 15 minutos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius. Transfira a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga.

Adicione 1,5 volumes de isopropanol e misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira até 700 microlitros da amostra para uma coluna de centrifugação que é colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Feche a tampa e centrifugue a 8.000 vezes G por 15 segundos à temperatura ambiente e depois descarte o fluxo.

Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão RWT à coluna de centrifugação e centrifugue. Como antes, descarte o fluxo através da pipeta de 500 microlitros de buffer RPE na coluna de centrifugação e centrifugue novamente para lavar a coluna. Depois de descartar o fluxo, adicione mais 500 microlitros de buffer RPE à centrífuga da coluna giratória por dois minutos a 8.000 vezes G.To seque a coluna, transfira a coluna giratória para uma pipeta de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro 100 microlitros de água livre do núcleo da costela diretamente na centrífuga de membrana da coluna giratória por um minuto a 8, 000 vezes G para eluir, o RNA.

Em seguida, adicione um microlitro de inibidor de RNAs à solução de RNA e prossiga para determinar a integridade do RNA usando análise de eletroforese capilar, conforme descrito no protocolo de texto, a comparação do número de integridade do RNA ou RIN do RNA isolado do pâncreas de camundongo revela uma correlação direta entre o volume de reagente de lise usado na homogeneização e a integridade do RNA. Os resultados indicam que oito mililitros de reagente de lise devem ser usados Neste protocolo, o inibidor da ribonuclease foi adicionado à solução aquosa de RNA e a integridade do RNA foi comparada após o congelamento e descongelamento. O RIN para a solução de RNA com inibidor foi de 7,3 mais ou menos 0,15 em comparação com 2,9 mais ou menos 0,65 para a solução que não continha inibidor para examinar a possibilidade de que o congelamento repetido desnature o inibidor da ribonuclease, tornando-o ineficaz.

Uma solução de RNA contendo inibidor da ribonuclease foi testada. As soluções de RNA que foram congeladas e descongeladas até cinco vezes ainda produziram um RIN de sete ou mais. Enquanto as soluções que foram congeladas e descongeladas seis vezes ou mais produziram um RIN abaixo de sete primos aleatórios, o CDNA foi sintetizado a partir do RNA e a expressão de três genes de manutenção foi medida por QPCR.

Usando técnicas padrão, os dados validam o uso bem-sucedido do RNA pancreático de camundongo em uma técnica padrão de biologia molecular. Uma vez devidamente treinados, os alunos de pós-graduação e pós-doutorado devem ser capazes de concluir essa técnica em cerca de 30 minutos. E eu só quero contar um pouco sobre como estamos usando isso.

Estamos estudando modelos de camundongos transgênicos de câncer de pâncreas e estamos usando essa técnica para isolar o RNA. E então, quando obtivermos o RNA, estudaremos a expressão gênica do micro RNA nesses animais.