Name: Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a isolar RNA de alta integridade do pâncreas de rico em ribonucleases de camundongo. Este método garante número de integridade superior a sete para análises confiáveis de expressão gênica.

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Agradecemos Jianhua Ling, Raymond MacDonald, Galvin Swift, Michelle Griffin, Paul Grippo e Satyanarayana Rachagani por seus comentários úteis, sugestões e partilha de seus protocolos. Este trabalho foi apoiado por U01CA111294 concessão e um Prêmio Idea Desenvolvimento do Programa de Pesquisa intramuros Ohio State University.

1. Preparação As seguintes práticas aderir às políticas estabelecidas pelo Animal Care and Use Committee da Instituição (IACUC). <ol><li> Recomenda-se a isolar não mais de 6 pâncreas do rato em qualquer dia. Tenha todos os instrumentos cirúrgicos limpos e autoclavados, um conjunto por animal. </li><li> Rotular todos os microtubos. Quatro tubos de 2 ml por animal. </li><li> Colocar 8 ml de reagente de lise em 50 ml de tubos de centrífuga em gelo. Nota: Embora o kit de purificação trata com um reagente fenol de tiocianato de guanidina, que é adequado para o isolamento de pâncreas, de reagente de lise é usado por causa dos grandes volumes de que são necessárias por isolamento. </li><li> Dispensar cerca de 10 ml das seguintes soluções em tubos de centrífuga de 15 ml para a limpeza lâminas do homogeneizador. O etanol, 70% (2 tubos), HPLC água (1 tubo) e água de grau HPLC, contendo cerca de 200 mL de RNase afastado ou inativador ribonuclease equivalente. </li></ol&gt; 2. Cirurgia, Dissection Pâncreas e homogeneização <ol><li> Coloque 1-2 ml de isoflurano em um frasco contendo gaze de algodão ou toalhas de papel. Os ratos são colocados numa plataforma que os impede de se atingir a fonte de isoflurano. Adicionar isoflurano fresco para o frasco antes de anestesiar cada rato. </li><li> Delicadamente, coloque o mouse no frasco contendo o isoflurano. Tampe o frasco e monitorar os efeitos da anestesia, rodando suavemente o frasco e para trás. O animal é anestesiado, uma vez que está na incapaz de ficar na sua &quot;própria. </li><li> Para confirmação da anestesia, remover o animal do frasco e aplicar uma pitada do dedo do pé firme. Se o mouse não reagir ao aperto do dedo do pé, vá para o passo 2.5. </li><li> Se o rato reage ao pitada dedo do pé, em seguida, repita os passos de 2,2-2,3. </li><li> Colocar o animal anestesiado na bancada na posição prona. Deslocar colo do rato por força colocando a mão esquerda no colo do mouse. Nósção da mão direita agarrar a cauda do rato e rapidamente puxar para cima em um ângulo de aproximadamente 45 ° para deslocar o colo do útero. </li><li> Fixe a carcaça a uma superfície (um pedaço de isopor nível de cobertas com toalhas de papel), perfurando cada uma das quatro patas do animal na superfície plana usando calibre 25 agulhas hipodérmicas. </li><li> Usando instrumentos cirúrgicos estéreis, corte o meio do mouse aberta e rapidamente remover o pâncreas do mouse. Use a pinça para segurar o pâncreas e cortá-la a partir do baço e do intestino delgado com uma tesoura de mola. Tenha cuidado para não esticar o pâncreas durante a remoção do mouse. O rompimento do tecido poderia liberar ribonuclease. Nota: O tempo que leva a remover o pâncreas do rato é crítica. Um perito deve ser capaz de dissecar o pâncreas em cerca de um minuto ou menos. </li><li> Colocar todo o pâncreas para um tubo de 50 ml contendo 8 ml de reagente de lise frio de gelo. Tampe o tubo e agitar brevemente para imergir o tissue no reagente e avançar para o próximo passo sem demora. A proporção de reagente de lise de tecido é crítica. Ver secção de resultados de uma comparação entre a integridade do RNA isolado utilizando diferentes volumes de reagente de lise. </li><li> Homogeneizar por 5 seg. É importante para pressionar as lâminas homogeneizador para o fundo do tubo de centrífuga para permitir que o tecido seja puxado para dentro das lâminas para homogenização eficiente. </li></ol> 3. Remoção de tecido não digerido Nota: Após a homogeneização, pequenos pedaços de tecido permanecem no reagente de lise. É mais importante para lisar rapidamente o tecido deixando um pouco de tecido não digerido, em vez de ao longo de homogeneização e degradação risco de RNA. <ol><li> Transferência de 2 ml de reagente de lise contendo o pâncreas lisadas para um tubo de microcentrífuga de 2 ml. Colete dois microtubos de homogeneizado por isolamento. Descarte o homogeneizado restante ou armazenar a -80 ° C para estudos futuros. </li><li> Centavorifuge a 4 ° C, 12000 g durante 5 min para sedimentar o tecido não digerido. Este é um passo crítico como transição de tecido não digerido em soluções posteriores de RNA provavelmente vai contaminar a amostra com ribonuclease (passo 5.13). </li><li> Transferir 1 ml do sobrenadante para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Prosseguir com o isolamento imediatamente e armazenar o tubo de replicar-se a -80 ° C para uso futuro. Coloque todos os tubos contendo homogeneizado em gelo molhado enquanto prosseguir para a próxima etapa. </li><li> Descarte o reagente de lise restante em um recipiente de lixo químico apropriado. </li></ol> 4. Limpeza dos Blades homogeneizador <ol><li> Antes de prosseguir para o próximo isolamento, limpeza das lâminas homogeneizador, colocando-os em 10 ml de etanol a 70%. Ative o homogeneizador por cerca de 20 segundos para remover quaisquer pedaços de tecido que podem ser capturados nas lâminas. </li><li> Use uma ponta de 200 mL da pipeta para remover quaisquer peças que permanecem nas lâminas homogeneizador. </li&gt; <li> Repita o passo 4.1 na água, inativador geral Rnase e 70% de etanol. Seque o eixo com um homogeneizador de Kim limpo limpar. </li><li> Repetir o passo 2.1 para o isolamento pâncreas dos animais restantes, mantendo RNA isolado a partir de cada animal, em vez de separar o pool de RNA. </li></ol> 5. Isolamento de ARN A secção que se segue é idêntico ao protocolo do kit de purificação. A vantagem do kit de purificação é que vai isolar o ARN total, incluindo pequenos RNAs. <ol><li> Se estiver usando solução homogeneizado congelado, descongelar no gelo molhado e deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min. </li><li> Adicionar 200 mL de clorofórmio, tampar o tubo e agitar vigorosamente à mão por 15 segundos. Deixe o tubo repousar à temperatura ambiente durante 2-3 minutos. </li><li> Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 xg, a 4 ° C. </li><li> Transferir a fase aquosa superior para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 1,5 volumes de isopropanol e misture bem por pipetagem cima e para baixo várias vezes. </li><li> Transfira até 700 ul da amostra em uma coluna de rotação que é colocada num tubo de recolha de 2 ml. Fechar a tampa e centrifugar a 8000 g durante 15 segundos à temperatura ambiente. </li><li> Descartar o escoamento. </li><li> Repita os passos de 5,5-5,6, utilizando-se o restante da amostra. </li><li> Adicionar 700 mL de buffer ERP para a coluna de centrifugação. Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 x g. Descartar o escoamento. </li><li> Pipetar 500 mL de buffer RPE na coluna de rotação. Centrifugar durante 15 segundos a 8000 x g para lavar a coluna. Descartar o escoamento. </li><li> Adicionar 500 mL de buffer RPE para a coluna de centrifugação. Centrifugar durante 2 minutos a 8.000 xg, para secar a coluna. </li><li> Transferir a coluna de centrifugação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Pipetar 80 mL sem ribonuclease água diretamente sobre a membrana coluna rodada. Centrifugar durante 1 minuto a 8.000 xg, para eluir o ARN. </li><li> Adicionar 1 mL inibidor de RNase à solução de ARN. Armazenar a -80 ° C ou prosseguir para 5.13. </li><li> Para validar a integridade do RNA, primeiro calcular o conce RNAntration e 260/280 escala utilizando um espectrofotômetro. </li><li> Dilui-se uma porção da solução de RNA de cerca de 500 ng / mL com água de grau de biologia molecular. </li><li> Determinar a integridade de ARN (isto é, RIN) usando a análise de electroforese capilar. Cerca de 5 ul da solução de RNA é suficiente para a análise. </li><li> Alíquota da solução de RNA (ver Figura 2) e armazenar a -80 ° C. </li></ol>

<ol><li>Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).</li>
<li>Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biologically+active+ribonucleic+acid+from+sources+enriched+in+ribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease.</a> Biochemistry. 18, 5294-5299 (1979).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).</li>
<li>Griffin, M., Abu-El-Haija, M., Abu-El-Haija, M., Rokhlina, T., Uc, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+and+versatile+method+for+isolation+of+high-quality+RNA+from+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Simplified and versatile method for isolation of high-quality RNA from pancreas.</a> Biotechniques. 52, 332-334 (2012).</li>
<li>Iyer, V. R., Eisen, M. B., Ross, D. T., Schuler, G., Moore, T., Lee, J. C., Trent, J. M., Staudt, L. M., Hudson Jr, J., Boguski, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+in+the+response+of+human+fibroblasts+to+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program in the response of human fibroblasts to serum.</a> Science. 283, 83-87 (1999).</li>
<li>Lenstra, J. A., Beintema, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino+acid+sequence+of+mouse+pancreatic+ribonuclease.+Extremely+rapid+evolutionary+rates+of+the+myomorph+rodent+ribonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+biochemistry++FEBS%22%5BJournal%5D)">The amino acid sequence of mouse pancreatic ribonuclease. Extremely rapid evolutionary rates of the myomorph rodent ribonucleases.</a> European journal of biochemistry FEBS. 98, 399-408 (1979).</li>
<li>Mullin, A. E., Soukatcheva, G., Verchere, C. B., Chantler, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+situ+ductal+perfusion+to+facilitate+isolation+of+high-quality+RNA+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Application of in situ ductal perfusion to facilitate isolation of high-quality RNA from mouse pancreas.</a> Biotechniques. 40, 617-621 (2006).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRio%2C+DC+%22RNA+A+Laboratory+Manual%22">RNA A Laboratory Manual</a>. , Cold Springs Harbor Laboratory Press. Cold Springs Harbor, NY. (2011).</li>
<li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nat Protoc. 4, 37-43 (2009).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments++JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. , (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Isolar RNA a partir de tecidos que são ribonuclease rico representa um grande desafio para os experimentos de biologia molecular. Vários reagentes e kits estão disponíveis no mercado que são baseada principalmente no método fenol tiocianato de guanidina de extração de RNA. Tiocianato de guanidina desnatura a proteína e, assim, reduz a actividade da ribonuclease. No entanto, a magnitude da ribonuclease no pâncreas requer modificações adicionais para protocolos padrão de isolamento de RNA. Um protocolo é relatado aqui que...

Isolamento de RNA com elevada integridade é necessária para experiências de biologia molecular de rotina, tais como transferência Northern 9, qRT-PCR 1 ou a expressão do gene de perfil 5. A maioria dos métodos contemporâneos de isolamento de ARN são baseados em modificações dos protocolos de tiocianato de guanidina 2, 3. Tiocianato de guanidina é uma grande proteína desnaturante e vai efectivamente interromper a actividade de ribonuclease sob a maioria das condições. O método popular de Chomczynski e Sacchi 3 combinada de fenol na solução de tiocianato de guanidina a lise, reduzindo o tempo de isolamento de cerca de 4 horas. Muitos reagentes de extracção de RNA comercialmente disponíveis baseiam-se no método de Chomczynski e Sacchi 3. Ribonuclease tecidos ricos, como pâncreas humano ou mouse apresenta um desafio adicional para isolar RNA. Rato pâncreas pode conter até 75 mg de ribonuclease 6 alguns dos quais será lançado during destruição do tecido pancreático resultante em autólise tecido. As modificações dos protocolos de tiocianato de guanidina foram utilizados com êxito para isolar o ARN a partir de pâncreas com alta integridade 2, 4, 7, 10. Infusão de ARN estabilização reagente em rato pâncreas isolamento facilitada do RNA com elevada integridade 4, 7, 10, no entanto, a infusão de soluções para o pâncreas exige muita destreza, pode exigir instrumentos especializados, como um microscópio de dissecação e interrompendo a arquitetura do tecido durante o procedimento pode resultar em lise celular. Perfusão tecidual com reagente estabilização RNA pode interferir com outras aplicações, incluindo o isolamento de proteínas e coloração histológica. Além disso, esta técnica não é adequada para o isolamento de RNA a partir de pâncreas humanos. Outros protocolos requerem a preparação de soluções específicas pelo pesquisador 2. Relata-se um protocolo para isolar RNA com alta integridade de rato pâncreas. The protocolo utiliza elementos de métodos publicados anteriormente e é em grande parte baseada nos protocolos de reagentes padrão fenol / guanidina à base de tiocianato de lise. Ela não requer a preparação de soluções especializados, nem requer a infusão de reagentes para o pâncreas. As etapas críticas para o isolamento do ARN de sucesso incluem uma alta fenol / à base de guanidina lise reagente à relação do tecido, remoção de tecido não digerido antes da separação de fases e a inclusão de um inibidor da ribonuclease-se à solução de ARN resultantes. Usando estas e outras modificações, que tipicamente isolar o ARN com RIN superior a 7 para ser utilizado para análise da expressão do gene de rotina.

<table><tbody><tr><td>Power Gen 500&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-261-03&nbsp;</td><td>Homogeneizador</td></tr><tr><td>5424R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Microcentifuge refrigerado</td></tr><tr><td>Trizol reagente</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Lysis reagent</td></tr><tr><td>Student Vannas tesoura de mola</td><td>Fisher</td><td>91500-09&nbsp;</td><td>Use para cortar o pâncreas de tecidos anexados</td></tr><tr><td>Tesoura cirúrgica, 6 polegadas</td><td>Fisher</td><td>08-951-20</td><td>Use para cortar scin de camundongo</td></tr><tr><td>Pinça de extremidade romba</td><td>Fisher</td><td>1381239</td><td>Use para segurar o pâncreas durante a dissecção</td></tr><tr><td>de Isoflurano USP</td><td>Abbott Labs</td><td>4/8/5210</td><td>Rnase anestésico</td></tr><tr><td>(40 U/&micro; l)</td> <td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Rnase inhbitor</td></tr><tr><td>Rnase Away</td><td>Ambion</td><td>10328-011</td><td>Inativador geral Rnase</td></tr><tr><td>HPLC grau água</td><td>Fisher</td><td>W5-4</td><td>Para lavar lâminas homogeneizadoras</td></tr><tr><td>Água de grau de biologia molecular</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.03</td><td>Eluição de RNA</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Kit</td></tr> <tr><td>de purificaçãoTubos de microcentrífuga de 2 ml, certificados Rnase Dnase free</td><td>USA Scientific Plastics</td><td>1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l pontas de pipeta</td><td>Rainin</td><td>GPL200F</td><td>Para limpeza de lâminas homogeneizadoras</td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Fisher</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo</td><td>ND-1000</td><td>Espectrofotômetro</td></tr><tr><td>Bioanalisador</td><td>Analisador</td> de eletroforese capilar Agilent <td></td><td>para medir a integridade do RNA</td></tr><tr><td>Reagente de Estabilização de RNA</td> <td>Ambion</td><td></td><td>RNAlater</td></tr><tr><td>RNeasy&nbsp; colunas giratórias&nbsp;</td><td>Colunas Qiagen</td><td></td><td>Spin como parte do kit miRNeasy Mini</td></tr><tr><td>Ratos</td><td>Chales River</td><td>Cepa C57BL/6</td><td>Sua idade variou de 4 a 12 meses.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Ratos&nbsp;</td><td>Jackson Lab</td><td>cepa 129</td><td>Sua idade variou de 4 a 12 meses. &nbsp;</td></tr></tbody></table>

isolamento de rna rato pâncreas: um tecido rico em ribonuclease

RNA Isolation from Mouse Pancreas: A Ribonuclease-rich Tissue

O isolamento de RNA de alta qualidade de tecidos ricos em ribonuclease, como o pâncreas de camundongos, apresenta um desafio. Como a principal função do pâncreas é ajudar na digestão, o pâncreas de camundongo pode conter até 75 mg de ribonuclease. Relatamos modificações dos protocolos padrão de reagentes de lise de tiocianato de fenol/guanidina para isolar o RNA do pâncreas de camundongos. O tiocianato de guanidina é um forte desnaturante proteico e interromperá efetivamente a atividade da ribonuclease na maioria das condições. No entanto, modificações críticas nos protocolos padrão são necessárias para isolar com sucesso o RNA de tecidos ricos em ribonuclease. As principais etapas incluem uma alta proporção de reagente de lise para tecido, remoção de tecido não digerido antes da separação de fases e inclusão de um inibidor de ribonuclease na solução de RNA. Usando essas e outras modificações, isolamos rotineiramente o RNA com o número de integridade do RNA (RIN) maior que 7. O RNA isolado é de qualidade adequada para análise de expressão gênica de rotina. A adaptação deste protocolo para isolar o RNA de tecidos ricos em ribonucleases além do pâncreas deve ser prontamente alcançada.

O rendimento de ARN total a partir de 1 ml de homogeneizado de lise é de 20-40 ug. OD 260/280 proporções são normalmente em torno de 2.0 e RIN são consistentemente superior a 7,0. Se o NIR é ≤ 6, o isolamento necessita de ser repetida. Ocasionalmente, um RIN que é maior do que 8,0 seja alcançado. Os dois métodos mais comumente usados ​​de eutanásia de camundongos antes da remoção do pâncreas são CO 2 asfixia ou inalação de isoflurano. Ambas as técnicas são seguidas por deslocament...

Relatamos um procedimento para isolar RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo rico em ribonuclease.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

Isolation of high-quality RNA from ribonuclease-rich tissue such as mouse pancreas presents a challenge.  As a primary function of the pancreas is to aid ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA com alta integridade do pâncreas de camundongo com crista de ribonuclease. Isso é feito removendo rapidamente o pâncreas da carcaça de um camundongo sacrificado. Em seguida, o pâncreas submergiu em reagente de lise e o tecido é homogeneizado.Após a centrifugação, o RNA é isolado do sobrenadante usando protocolos padrão e a solução inibidora de RNAs é adicionada à solução final de RNA. A etapa final é limpar cuidadosamente as lâminas do homogeneizador, removendo quaisquer pedaços de tecido presos nas lâminas e, em seguida, realizando uma série de lavagens com etanol e água. Em última análise, este procedimento permite o isolamento de RNA para pâncreas de camundongo com um número de integridade de RNA maior que sete para ser usado para análise de expressão gênica de rotina.Meu nome é Tom Schmid e trabalho com RNA há mais de 20 anos e, em todo esse tempo, não experimentei nada tão difícil quanto isolar RNA com alta integridade para o pâncreas de camundongo. A técnica que vamos mostrar foi desenvolvida para o pâncreas de camundongos, mas realmente não há razão para que não possa ser usada para uma variedade de outros tecidos, incluindo tecidos de células humanas, linhagens celulares ou outros tecidos de camundongos, incluindo tecidos ricos em nuclease de costelas, como o baço. O uso das sugestões deste protocolo permitirá isolar o RNA com alta integridade do pâncreas de camundongos.Isso pode ser usado para muitas aplicações downstream, como QPCR, matrizes de expressão gênica ou RNA-Seq. Ola Elgamal. Um estudante de pós-graduação sênior em meu laboratório demonstrará essa técnica após a eutanásia do mouse conforme descrito no protocolo de texto.Prenda a carcaça perfurando cada um dos animais com quatro patas em uma superfície plana usando agulhas hipodérmicas de calibre 25 usando instrumentos cirúrgicos estéreis. Corte a parte central do mouse e remova rapidamente o pâncreas do mouse. Use a pinça para segurar o pâncreas e corte-o do baço e do intestino delgado usando uma tesoura de mola.Tenha cuidado para não esticar o pâncreas durante a remoção do mouse. A ruptura do tecido pode liberar ribonuclease. Coloque todo o pâncreas em um tubo de 50 centímetros cúbicos contendo oito mililitros de reagente de lise gelada.Tampe o tubo e agite brevemente para imergir o tecido no reagente e prossiga imediatamente para a próxima etapa sem demora. Em seguida, homogeneizar o pâncreas Por cinco segundos. É importante pressionar as lâminas do homogeneizador no fundo do tubo da centrífuga para permitir que o tecido seja puxado para dentro das lâminas para uma homogeneização eficiente.Para remover o tecido não digerido, transfira dois mililitros de reagente de lise contendo o pâncreas lisado para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros. Colete dois tubos de microcentrífuga de homogenato por centrífuga de isolamento a quatro graus Celsius, 12.000 vezes G por cinco minutos para pellet o tecido não digerido. Esta é uma etapa crítica, pois a transferência de tecido não digerido para soluções subsequentes de RNA provavelmente contaminará a amostra com ribonuclease.Limpe as lâminas do homogeneizador colocando-as em 10 mililitros de etanol a 70%. Ative o homogeneizador por cerca de 20 segundos para remover quaisquer pedaços de tecido que possam estar presos nas lâminas. Em seguida, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para remover quaisquer pedaços que permaneçam nas lâminas do homogeneizador.Limpe as lâminas do homogeneizador novamente em água, ativador syn de RNA geral e etanol 70%. Por fim, seque o eixo do homogeneizador com um lenço umedecido limpo. Transfira um mililitro do SNA para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.Coloque todos os tubos contendo homogeneizado no gelo úmido enquanto prossegue para a próxima etapa. Proceder imediatamente com o isolamento do ARN e conservar o tubo replicado a 80 graus Celsius negativos para utilização futura. Descarte o reagente de lise restante em um recipiente de resíduos químicos apropriado.A seção a seguir usa um kit de purificação de RNA. A vantagem do kit de purificação é que ele isolará o RNA total, incluindo pequenos RNAs. Comece o isolamento adicionando 200 microlitros de clorofórmio à solução homogeneizada.Tampe o tubo e agite vigorosamente com a mão por 15 segundos. Em seguida, deixe o tubo repousar em temperatura ambiente por dois a três minutos após a centrifugação por 15 minutos a 12.000 vezes G e quatro graus Celsius. Transfira a camada aquosa superior para um tubo de microcentrífuga.Adicione 1,5 volumes de isopropanol e misture bem pipetando para cima e para baixo várias vezes. Transfira até 700 microlitros da amostra para uma coluna de centrifugação que é colocada em um tubo de coleta de dois mililitros. Feche a tampa e centrifugue a 8.000 vezes G por 15 segundos à temperatura ambiente e depois descarte o fluxo.Em seguida, adicione 700 microlitros de tampão RWT à coluna de centrifugação e centrifugue. Como antes, descarte o fluxo através da pipeta de 500 microlitros de buffer RPE na coluna de centrifugação e centrifugue novamente para lavar a coluna. Depois de descartar o fluxo, adicione mais 500 microlitros de buffer RPE à centrífuga da coluna giratória por dois minutos a 8.000 vezes G.To seque a coluna, transfira a coluna giratória para uma pipeta de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro 100 microlitros de água livre do núcleo da costela diretamente na centrífuga de membrana da coluna giratória por um minuto a 8, 000 vezes G para eluir, o RNA.Em seguida, adicione um microlitro de inibidor de RNAs à solução de RNA e prossiga para determinar a integridade do RNA usando análise de eletroforese capilar, conforme descrito no protocolo de texto, a comparação do número de integridade do RNA ou RIN do RNA isolado do pâncreas de camundongo revela uma correlação direta entre o volume de reagente de lise usado na homogeneização e a integridade do RNA. Os resultados indicam que oito mililitros de reagente de lise devem ser usados Neste protocolo, o inibidor da ribonuclease foi adicionado à solução aquosa de RNA e a integridade do RNA foi comparada após o congelamento e descongelamento. O RIN para a solução de RNA com inibidor foi de 7,3 mais ou menos 0,15 em comparação com 2,9 mais ou menos 0,65 para a solução que não continha inibidor para examinar a possibilidade de que o congelamento repetido desnature o inibidor da ribonuclease, tornando-o ineficaz.Uma solução de RNA contendo inibidor da ribonuclease foi testada. As soluções de RNA que foram congeladas e descongeladas até cinco vezes ainda produziram um RIN de sete ou mais. Enquanto as soluções que foram congeladas e descongeladas seis vezes ou mais produziram um RIN abaixo de sete primos aleatórios, o CDNA foi sintetizado a partir do RNA e a expressão de três genes de manutenção foi medida por QPCR.Usando técnicas padrão, os dados validam o uso bem-sucedido do RNA pancreático de camundongo em uma técnica padrão de biologia molecular. Uma vez devidamente treinados, os alunos de pós-graduação e pós-doutorado devem ser capazes de concluir essa técnica em cerca de 30 minutos. E eu só quero contar um pouco sobre como estamos usando isso.Estamos estudando modelos de camundongos transgênicos de câncer de pâncreas e estamos usando essa técnica para isolar o RNA. E então, quando obtivermos o RNA, estudaremos a expressão gênica do micro RNA nesses animais.

rna-isolation-from-mouse-pancreas-a-ribonuclease-rich-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Isolamento Islet murino de pâncreas

Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.

Rato Ilhéu de Langerhans isolamento usando uma combinação de colagenase purificada e Protease Neutra

Apresentamos aqui um protocolo para o isolamento de ilhotas do modelo de camundongo com diabetes tipo 2, Leprdb e detalhes de um ensaio de células vivas para medição da secreção de insulina de ilhotas intactas que utiliza microscopia de 2 fótons.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modelo de Diabetes Tipo 2: Isolamento de ilhotas pancreáticas e células vivas 2-Photon Imagens de ilhotas intactas

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 - 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Este protocolo da isolação da ilhotas descreveu uma rota nova da injeção do colagenase para digerir o tecido exócrina e um procedimento simplificado do inclinação para purificar os ilhotas dos ratos. Envolve a digestão enzimática, separação de gradiente/purificação, e Islet mão-picking. O isolamento bem-sucedido pode produzir 250 – 350 de alta qualidade e ilhotas totalmente funcionais por mouse.

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

A pureza e integridade do RNA isolado é um passo vital nos ensaios dependentes do RNA. Aqui, apresentamos um método prático, rápido e barato para extrair RNA de uma pequena quantidade de tecido pancreático não danificado.

Extração rápida e econômica do RNA do tecido pancreático de rato

Este protocolo descreve o isolamento de células endoteliais de camundongos de todo o pâncreas.

Isolamento de células endoteliais pancreáticas de camundongo

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intercelular na patogênese do Diabetes Induzido por Pancreatite Aguda.

Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Aprenda a isolar RNA de alta integridade do pâncreas de rico em ribonucleases de camundongo. Este método garante número de integridade superior a sete para análises confiáveis de expressão gênica.

Isolamento de RNA Rato Pâncreas: Um tecido rico em Ribonuclease

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