Contraste de fase e de interferência diferencial Contrast Microscopy (DIC)
6 de agosto de 2008
Este protocolo destaca os princípios e aplicações práticas de fase e contraste de interferência diferencial (DIC) Microscopia
A microscopia óptica é uma das ferramentas, senão a mais importante, no campo da pesquisa biomédica. Dependendo da sua aplicação, diferentes modos de iluminação são desejáveis para a visualização de espécimes. Este vídeo demonstrará dois modos ópticos de iluminação com luz transmitida: contraste de fase e microscopia DIC, ou contraste de interferência diferencial.
Olá, sou Victoria San Frolic da instalação central de Imagem Óptica do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. Hoje vou mostrar como visualizar corretamente espécimes utilizando microscopia de contraste de fase e contraste de interferência diferencial. Então, vamos começar.
A microscopia padrão em contraste de fase não é adequada para visualizar espécimes transparentes e incolores. A microscopia de contraste de fase é frequentemente utilizada para gerar contraste em espécimes biológicos transparentes e não absorventes de luz. A técnica foi descoberta por Zurich em 1942, que recebeu o Prêmio Nobel por sua conquista.
O microscópio de contraste de fase é um microscópio óptico de campo claro com a adição de objetivas especiais de contraste de fase, que contêm uma placa ou anel de fase, e um anel condensador em vez de um diafragma. O anel geralmente está localizado na torreta do condensador e seu tamanho precisa ser selecionado de acordo com as diferentes objetivas. Após configurar a iluminação de Köhler, escolha a objetiva de fase adequada e, em seguida, gire o anel de fase apropriado para a posição correta no condensador.
Uma vez que o anel de fase do objetivo e o anel do condensador tenham sido corretamente alinhados para serem concêntricos e sobrepostos, podemos visualizar o espécime e ajustar adequadamente o foco. Vamos então demonstrar como é o contraste de fase ao microscópio. Aqui temos uma imagem de um corte de fígado de rato.
Em contraste de fase. Este método realça a aparência do material biológico ao alterar o contraste de diferentes tons de cinza para tons que variam de preto a branco. No entanto, você notará que os espécimes são cercados por um halo, o que obscurece estruturas finas.
Esse halo é um artefato causado pela iluminação pelo anel de fase. Agora você notará que, ao mudarmos para campo claro, este espécime é muito difícil de visualizar. Ao voltarmos ao contraste de fase, podemos ver claramente a estrutura e a forma das células no tecido hepático de rato desde sua introdução no final da década de 1960.
A microscopia de contraste de interferência diferencial ou DIC tornou-se popular na pesquisa biomédica porque produz imagens de alta resolução de estruturas finas ao realçar as interfaces com contraste, gerando uma imagem de uma seção óptica muito fina. De fato, a capacidade do DIC de produzir seções ópticas tornou-o um modo útil de iluminação em luz transmitida para microscopia confocal. O microscópio DIC é um microscópio de campo claro com a adição dos seguintes elementos: um polarizador entre a fonte de luz e o condensador.
Um prisma divisor de feixe DIC no condensador, um prisma combinador de feixe DIC logo atrás da objetiva e um analisador no espaço de infinito antes dos dois feixes. Para obter o melhor desempenho da óptica DIC, é importante primeiro alinhar o microscópio de luz para iluminação de Köhler e, em seguida, posicionar os elementos DIC no trajeto óptico. A luz proveniente da fonte passa por um polarizador e é então dividida pelo primeiro prisma.
Esses feixes emparelhados viajam próximos uns dos outros. Se o par passar pelo mesmo material no espécime, ao ser recombinado pelo segundo prisma, eles não interferem entre si e, portanto, aparecem cinzas. No entanto, em uma borda de uma estrutura, um dos feixes do par passa por um material diferente do seu parceiro e é alterado.
Quando esses feixes são recombinados pelo segundo prisma, eles interferirão de forma construtiva, produzindo um ponto brilhante, ou destrutivamente, produzindo um ponto escuro. Veja a seguir uma imagem de diatomáceas com contraste DIC. Você notará que os detalhes finos da estrutura das diatomáceas são facilmente visíveis.
No entanto, se a óptica DIC for removida, esses detalhes desaparecem. O contraste ao longo do espécime é claro em um lado e mais escuro no outro. Isso dá a impressão de topografia, mas, na verdade, trata-se de uma ilusão.
A direção do efeito de sombra projetada pode ser invertida girando o polarizador através de um ponto de cruzamento até o contraste oposto. Acabamos de revisar os modos ópticos de contraste de fase e DIC. Apenas para lembrá-lo, a eliminação de contraste de fase realça os espécimes contrastados de pretos a brancos e é útil para visualizar espécimes que são incolores e transparentes.
A IC também gera contraste na amostra. Isso é feito criando uma imagem de alta resolução de uma seção óptica fina. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com sua microscopia.
Visão Geral
Este protocolo destaca os princípios e as aplicações práticas da microscopia de contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC). Essas técnicas aumentam a visualização de espécimes biológicos transparentes e incolores, tornando-se ferramentas essenciais na pesquisa biomédica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa Biomédica
- Técnicas de Microscopia
- Imagem Óptica
Contexto
- A microscopia óptica é fundamental para a visualização de espécimes biológicos.
- A microscopia de contraste de fase realça o contraste de espécimes transparentes.
- A microscopia de contraste de interferência diferencial fornece imagens de alta resolução de estruturas finas.
- Ambas as técnicas são essenciais para uma análise eficaz dos espécimes.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso da microscopia de contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC).
- Explicar a configuração e o alinhamento das técnicas de microscopia.
- Destacar as vantagens desses métodos na observação de materiais biológicos.
Métodos Utilizados
- Configuração da iluminação de Köhler para distribuição ideal de luz.
- Utilização de objetivas e anéis de contraste de fase.
- Implementação de óptica DIC, incluindo polarizadores e prismas divisores de feixe.
- Comparação da visibilidade do espécime sob diferentes técnicas de microscopia.
Resultados Principais
- A microscopia de contraste de fase revela estruturas celulares em espécimes transparentes.
- A microscopia de contraste de interferência diferencial realça detalhes finos e fornece um efeito topográfico.
- Ambas as técnicas melhoram significativamente a clareza de espécimes biológicos.
- Artefatos como halos na microscopia de contraste de fase são observados e explicados.
Conclusões
- O contraste de fase é eficaz para visualizar espécimes incolores e transparentes.
- A microscopia de contraste de interferência diferencial oferece imagens de alta resolução de estruturas finas.
- Os dois métodos são valiosos para o avanço da pesquisa nas ciências biológicas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A microscopia de contraste de fase e a microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) permitem a visualização de espécimes biológicos transparentes e não absorventes à luz, apoiando fluxos de trabalho de descoberta precoce nos quais é necessária a imagem sem marcação. Essas técnicas proporcionam desvio de risco mecanicista ao revelar detalhes estruturais e morfologia funcional em células e tecidos vivos sem fixação ou coloração. A integração delas nos fluxos de descoberta melhora a confiança na validação de alvos, permitindo a observação direta de respostas fenotípicas e arquitetura celular em condições próximas às fisiológicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a observação sem marcadores de espécimes transparentes, como células vivas e cortes de tecidos, para avaliar alterações morfológicas associadas à modulação do alvo.
- Valor Operacional: Facilita a triagem rápida de fenótipos celulares sem necessidade de marcadores fluorescentes ou fixação química, reduzindo o tempo de preparação do ensaio.
- Valor Preditivo: Aumenta a confiança nas hipóteses sobre o alvo ao permitir a visualização direta de fenótipos estruturais e funcionais em sistemas relevantes para doenças.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece imagens com alto contraste e sem marcação, adequadas para o desenvolvimento de ensaios fenotípicos nos quais a transparência oculta detalhes na microscopia de campo claro.
- Valor Operacional: Permite a padronização das condições de aquisição de imagens por meio da iluminação de Köhler e do alinhamento preciso de placas de fase ou prismas de contraste de interferência diferencial (DIC), melhorando a reprodutibilidade entre experimentos.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de placas de múltiplos poços quando integrado a sistemas automatizados de microscopia, apoiando campanhas de triagem de média produtividade.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta as fases de descoberta e pré-clínica ao permitir a realização de imagens consistentes de células primárias, explantes e modelos de embriões em diferentes fluxos de trabalho.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Revela detalhes estruturais finos nas interfaces teciduais, ajudando a esclarecer os mecanismos de ação em sistemas biológicos complexos.
- Sistemas Relevantes para Doenças: Aplicável a espécimes espessos, incluindo seções de tecido, ovos e embriões, apoiando a avaliação em modelos fisiologicamente complexos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A microscopia de contraste de fase e de contraste de interferência diferencial funcionam como tecnologias habilitadoras no continuum da descoberta, apoiando a verificação de hipóteses na biologia inicial, a preparação de ensaios na triagem e a análise morfológica na pesquisa translacional.
- Biologia Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses ao permitir a observação direta das respostas celulares a perturbações em espécimes transparentes e não corados.
- Triagem: Apoia o desenvolvimento de ensaios por meio de imagens reproduzíveis e de alto contraste de espécimes sem marcação, reduzindo a variabilidade nas leituras fenotípicas.
- Análise: Gera medições quantitativas de intensidade e contraste em interfaces estruturais, permitindo comparação objetiva entre condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Garante continuidade ao fornecer visualização consistente de tecidos primários e explantes desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Representa uma capacidade de imagem reutilizável entre departamentos, reduzindo redundâncias na alocação de recursos de microscopia.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao revelar detalhes estruturais finos e características topológicas em espécimes vivos e não corados.
- Valor Operacional: Promove a padronização por meio de procedimentos definidos de alinhamento para anéis de fase e óptica DIC, melhorando a reprodutibilidade diária.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao aumentar a confiança nas observações fenotípicas, reduzindo assim a eliminação tardia devido à complexidade biológica inesperada.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em evidências fenotípicas diretas e livres de marcadores obtidas de sistemas relevantes para doenças.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em alinhamento óptico, incluindo iluminação de Köhler e centralização precisa de placas de fase ou prismas DIC.
- Depende de hardware especializado: objetivas para contraste de fase com anéis de fase, anéis do condensador, polarizadores, prismas divisores e combinadores de feixe e analisadores.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de iluminação e alinhamento para garantir resultados consistentes entre usuários e locais.
- As considerações para adaptação incluem o casamento de índice de refração e a espessura da amostra, que afetam a qualidade do corte em DIC e os artefatos de halo no contraste de fase.
- As limitações práticas incluem artefatos de halo no contraste de fase que podem obscurecer estruturas finas, e o efeito de sombra direcional em DIC, que é uma ilusão óptica e não representa a verdadeira topografia.
