Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a estabilidade térmica e a conformação estrutural de proteínas em um ambiente industrial usando calorimetria exploratória diferencial. A calorimetria exploratória diferencial mede a capacidade térmica molar das amostras em função da temperatura e tem sido usada com sucesso para avaliar a estabilidade térmica e a conformação estrutural das proteínas. Este procedimento relativamente simples não depende de helicidade estrutural ou fluoróforos intrínsecos, como é o caso de outros métodos biofísicos.

Outra vantagem dessa técnica é que ela mede diretamente a temperatura de transição térmica e a energia necessária para interromper a interação, estabilizando a estrutura terciária das proteínas. Quando usada em conjunto com a encravia do desdobramento, a temperatura de transição térmica pode servir como um parâmetro útil para monitorar a consistência lote a lote dos processos de fabricação de produtos biológicos. A demonstração visual desse método pode servir como um meio interativo para auxiliar efetivamente os novos usuários em etapas críticas.

Para começar, ligue o calorímetro de varredura diferencial. Em seguida, forneça nitrogênio ao sistema. Isso aumentará a pressão nas células para suprimir a ebulição das amostras, bem como evitar a formação de bolhas em temperaturas elevadas.

Dependendo do material constituinte da célula, ajuste a pressão do suprimento de gás nitrogênio de acordo com a pressão recomendada pelo fabricante para evitar danos à célula. Certifique-se de que todos os reservatórios do agente de limpeza estejam cheios até o volume necessário. Os agentes de limpeza necessários incluem detergente para lavar a célula e água para limpar a célula após cada execução da amostra.

Defina a temperatura do compartimento de retenção da amostra para um valor adequado, de preferência cinco graus Celsius, para manter a integridade da amostra antes do experimento. É importante equilibrar a amostra com o tampão para garantir que a única diferença entre as soluções seja a proteína. Portanto, a diferença observada na capacidade de calor pode ser corretamente atribuída à proteína.

Determinar a concentração da amostra de proteínas utilizando um método adequado de determinação da concentração de proteínas, como o método de Lowry. Para o instrumento usado neste protocolo, a faixa de trabalho preferível é de 0,5 a um miligrama de proteína por mililitro. Dialize a amostra em relação ao tampão que será usado como referência para o experimento.

Desgaseifique a amostra e o tampão de referência no vácuo para se livrar de microbolhas que podem causar imprecisão de volume. Trabalhando em um gabinete de biocontenção de fluxo laminar, use uma micropipeta e pontas estéreis para carregar as amostras em seus respectivos tampão em pares em placas de 96 poços. Encha os dois primeiros pares de poços com tampão para realizar varreduras de tampão-tampão para verificar a adequação do instrumento antes da medição da amostra.

Encha os dois últimos pares de poços com água para a varredura de água para limpar as células. Em seguida, cubra a placa de 96 poços com filme de vedação. Certifique-se de que os poços estejam devidamente vedados antes de retirar a placa do gabinete de biossegurança para evitar a contaminação da amostra.

Por fim, coloque a placa no compartimento de suporte de amostras na orientação correta. Usando o software de aquisição, insira as informações da amostra na ordem em que a chapa foi carregada. Insira as concentrações de proteína, se disponíveis.

Caso contrário, insira a concentração no software de análise antes da análise dos dados. Selecione a opção que garante a limpeza da célula com detergente antes de cada varredura de amostra. A limpeza deve ser seguida por várias etapas de enxágue com água para garantir que nenhum resíduo de detergente seja deixado nas células.

Defina a temperatura inicial do experimento para 20 graus Celsius, que pode variar dependendo da amostra. Para proteínas conhecidas, uma temperatura inicial predeterminada pode ser usada, enquanto uma temperatura inicial mais baixa pode ser aplicada para amostras desconhecidas. Em seguida, defina a temperatura final do experimento.

A temperatura final também pode variar dependendo do conhecimento prévio da amostra. Em seguida, defina a taxa de verificação do experimento. É aconselhável escanear amostras desconhecidas em diferentes taxas de varredura para avaliar a cinética de desdobramento.

Configure o software de aquisição para reescanear as amostras para examinar a reversibilidade da transição térmica. O desdobramento de uma proteína é considerado reversível se a entalpia obtida para a segunda varredura for pelo menos 80% do valor da entalpia da primeira varredura. Ajuste o termostato pós-experimento para 10 graus Celsius para preservar a integridade da célula do calorímetro.

Verifique se os parâmetros de configuração do experimento estão corretos antes de executá-lo. Se tudo estiver no lugar, inicie o experimento. Após o experimento, execute a análise dos dados conforme descrito no protocolo de texto.

Para a análise, a subtração da linha de base é realizada manualmente. A consistência nesta etapa é crucial para obter resultados comparáveis. Mostrado aqui um dado bruto representativo de uma execução experimental, incluindo o buffer e as varreduras de água.

As amostras analisadas são toxinas em seus estados nativos e desintoxicados. As varreduras de amostra são processadas separadamente para derivar a temperatura de fusão e os valores de entalpia para cada amostra. Para o estado nativo, a temperatura de fusão é de 55,55 graus Celsius e a entalpia da toxina é de 3,157 vezes 10 elevado a quinta calorias por mol.

Por outro lado, a temperatura de fusão da toxina em seu estado desintoxicado é de 81,21 graus Celsius e a entalpia é de 3,656 vezes 10 elevado a quinta calorias por mol. A sobreposição dos dados processados da toxina em seus estados nativo e desintoxicado demonstra que a amostra desintoxicada é mais estável termicamente que seu estado nativo de acordo com os valores da temperatura de fusão. Também indica que o processo de desintoxicação introduz mudanças estruturais na estrutura terciária da toxina.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de fornecer um suprimento adequado de detergente e água para evitar a contaminação cruzada da célula e da seringa, pois sua clareza é crucial para resultados precisos. Depois de assistir a este vídeo, você terá uma boa compreensão da calorimetria exploratória diferencial como método para avaliar a estabilidade térmica e a conformação de proteínas. Você também será capaz de fazer deduções significativas das corridas térmicas resultantes.

Seguindo este procedimento, outros métodos como o dicroísmo circular podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as mudanças nas estruturas secundárias durante o desdobramento. Os dados coletados para uma série de lotes do mesmo produto foram usados para criar linhas de base empíricas para examinar o impacto das mudanças no processo, formulação e condições de armazenamento na conformação da estrutura de antígenos proteicos para a produção de vacinas.