Name: Utilizando a pedido de clientes Galvanotaxis Chambers para Estudar Direcional migração das células da próstata (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Aprenda a usar câmaras de galvanotaxia personalizadas para estudar a migração direcional de células da próstata imortalizadas em campos elétricos. Este método permite analisar o comportamento celular em pesquisa sobre câncer de próstata.

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As linhas de células de próstata são gentilmente cedido pelo Dr. Ling-Yu Wang e Dr. Hsing-Jien Kung no Centro de Câncer, UC Davis. Este projecto é financiado pelo NIH galvanotaxis concessão 4R33AI080604.

1. A cultura da próstata Células <ol><li> Cultura A PRN-1-1 e PNT2 próstata células em placas de 100 mm de cultura em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e Antibiótico-antimicótico a 37 ° C com 5% de CO 2. Refrescar o meio de cultura todos os dias até as células atingirem a confluência de 80% para as experiências galvanotaxis. </li></ol> 2. Montagem Galvanotaxis Chambers <ol><li> Montagem câmaras inferiores <ol><li> Wipe uma câmara galvanotaxis plástico com 2-propanol. Aplicar o selante de silicone de grau marinho em torno das aberturas circulares no lado inferior de uma câmara com uma seringa e fixar uma grande lamela (Figura 1). Use a parte de trás de um aplicador de algodão para empurrar para baixo a lamela e limpe o excesso de cola com cotonetes. As aberturas circulares permitir que a forma e a corrente eléctrica para fluir sobre as células localizadas entre os dois reservatórios internos médios. </li><li> Corte uma pequena lamela para fazer 6 mm x 25 espaçadores mm com um marcador de ponta de diamante. </li><li> Vire a câmara. Aplicar duas bandas da cola de silicone com uma seringa e / ou uma espátula de metal para criar uma superfície de canal x 25 mm 10 mm para a fixação das células entre as duas aberturas circulares no fundo de vidro. Cole dois pedaços de vidro espaçador entre as duas aberturas circulares. Use a parte de trás dos aplicadores de algodão para empurrar para baixo os espaçadores e limpe o excesso de cola com cotonetes e / ou palitos de algodão. </li><li> Seca-se a câmara durante 24 horas até que a cola de silicone é curado. Embeber a câmara em água destilada durante a noite para remover o resíduo de ácido acético a partir da cola. Seque a câmara para uso imediato, ou armazenar a câmara para uso posterior em um recipiente limpo. <img alt="Diagrama de configuração da câmara Galvanotaxis detalhando a montagem com espaçadores de vidro, vidro da tampa inferior." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Assembleia da câmara na parte inferior galvanotaxis. A) Um grande lamela está ligado ao fundo de uma câmara de limpeza. B) Two peças de espaçadores de vidro são coladas entre as duas aberturas circulares para criar a 10 mm x 25 milímetros canal para as células para anexar. </li></ol></li><li> Semeando células nas câmaras galvanotaxis <ol><li> Prepare o número de exigir câmaras galvanotaxis necessários para o experimento. Cada linha ou tratamento com células requer uma única câmara galvanotaxis. Limpe as câmaras galvanotaxis com 2-propanol. Lavam-se as câmaras estéreis com PBS 3 vezes e verificar o fluxo de líquido entre as duas aberturas circulares nas câmaras. </li><li> Coloque as câmaras em pratos de cultura de células estéril e permitir que se equilibre a 37 ° C durante 15 min. Separar as células da próstata a partir da sua placa de cultura, utilizando 5 ml de 0,25% de Tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Neutraliza-se a tripsina-EDTA, com 5 ml de 10% de FBS em PBS. </li><li> Transferem-se as células para tubos de 15 ml e centrifugar as células durante 5 min a 200 x g, 37 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura. </li><li> Pegue 20 μl de solução de células para carregar para uma câmara de contagem e calcular o número de células. Ajustar a concentração de células a 8 x 10 4 células / ml com meio de cultura. </li><li> Tome as câmaras galvanotaxis fora da 37 ° C incubadora. Semente de 350 ul da suspensão de células em cada câmara. </li><li> Incubar as células nas câmaras durante a noite em placas de cultura com Kimwipe molhado ou em uma câmara de humidade na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><img alt="Diagrama de migração de células da próstata com configuração de incubadora para análise experimental a 37°C, 5% de CO2." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 2"> Figura 2:. Semear as células à câmara A câmara inferior é seco e limpo células A) da próstata são tripsinizadas, contadas e transferido para a câmara e incubou-se durante a noite B) Uma lamela superior está ligada para vedar a câmara antes de filmar... <ol start="3"><li> Assembling os melhores câmaras <ol><li> Monte a câmara superior antes das filmagens. O microscópio só pode acomodar imagiologia de uma única câmara de galvanotaxis de uma só vez. Aquecer-se 10 ml de meio de cultura a 37 ° C para cada câmara galvanotaxis. Transferir uma câmara galvanotaxis das incubadoras para a 37 ° C placa de aquecimento. </li><li> Lavar as células com meio de cultura para remover as células não ligadas. Deixar a 400 ul de meio na câmara. Use uma seringa para aplicar alta graxa de vácuo no topo de ambos os espaçadores de vidro. </li><li> Adicionar uma pequena lamela para vedar a câmara. Pressione suavemente a lamela com a parte de trás de um aplicador de algodão. Limpe o meio excesso com cotonetes. </li><li> Seque a superfície do vidro e aplicar vácuo elevado graxa para vedar o espaço entre a lamela e a câmara. Use uma espátula de metal para espalhar a graxa. Adicionar 4 ml de meio de cultura para os reservatórios interno e verificar o fluxo de líquido entre os reservatórios. </li></ol></li><li> Faça agarpontes <ol><li> Corte um par de 2 polegadas tubo longo PVC (503/16 ID x 16/05 x 16/01 OD Wall), virar e inseri-los em um copo de 100 ml. </li><li> Medir 200 mg de Bacto-Agar e adicioná-lo num frasco de 50 ml com 10 ml de meio de cultura para fazer 2% de gel de agar. Micro-ondas por 30 segundos. Carregar o gel de agar para o tubo de plástico com uma pipeta de transferência. Deixar as pontes de agar à temperatura ambiente durante 10 minutos para solidificar o agar. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura para os reservatórios exteriores da câmara galvanotaxis. Inserir as pontes agar para os reservatórios interno e externo médio para conduzir a corrente. </li></ol></li></ol><img alt="Diagrama do experimento de galvanotaxia mostrando a configuração da câmara com pontes de ágar e energia CC para migração celular." fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig3highres.jpg" width="350" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 3"> Figura 3:. Filmar as células na câmara de um diagrama para demonstrar a montagem final da câmara galvanotaxis. A câmara é completamente selado com graxa alto vácuo. O meio é adicionado to encher os reservatórios, e duas pontes de agar são inseridos dentro da câmara. Em seguida, a câmara de galvanotaxis é transferida para o estágio de microscópio e os eléctrodos estão ligados para aplicar o campo eléctrico. Vista lateral da câmara de galvanotaxis montado é mostrado para demonstrar que a corrente eléctrica flui através das células através das pontes de agar e o espaço entre o vidro de cobertura. 3. tempo-lapso <ol><li> Ligar a câmara ambiental a 37 ° C com 5% de CO 2 no ar circulante 2 h antes da imagiologia. </li><li> Ligue o microscópio e iniciar o software de aquisição de imagem. Calibrar o estágio do microscópio e selecione a objetiva de 10X. </li><li> Transfira as câmaras galvanotaxis ao palco microscópio, fixe a câmara com fita adesiva e concentrar-se nas células. Insira os eletrodos galvanotaxis para os reservatórios exteriores com cátodo no lado direito. Fixar o cabo e com os eléctrodos de fita. </li><li> Ligue o bo poderx para aplicar um campo eléctrico para a câmara. Medir a tensão de saída com o voltímetro através da câmara para atingir 2,5 volts para a câmara longo de 25 mm (100 mV / mm). Manter a intensidade do campo durante a experiência, ajustando a corrente de saída. </li><li> Selecione 10 pontos em toda a câmara de filmar no software para gerar dez filmes de lapso de tempo. Configurar as condições de aquisição em 10 minutos de intervalo, durante 2 horas. </li><li> Iniciar filmagens e ajustar a corrente de saída, conforme necessário. </li><li> No final da experiência, remover a câmara da fase e fixar as células com 95% de álcool. Quebre aberto a câmara com uma lâmina de barbear para limpar e reutilizá-lo. </li></ol> 4. Quantificação do Galvanotaxis <ol><li> Gire os filmes lapso de tempo e re-orientar o cátodo para o início das imagens. Exportar os filmes para o software de rastreamento de celular. </li><li> Controlar manualmente a (x-y,) posição de 10-20 células em cada ponto de tempo a partir de cada filme (Figura 4 A, B).As distâncias de migração e os ângulos em relação à direcção norte-sul, a mesma orientação do campo elétrico, será calculado no software de rastreamento de celular (Figura 4C). NOTA: A velocidade de migração média é convertida a partir da distância total migração e tempo total de filmagens. A direccionalidade é convertido a partir dos ângulos em relação ao valor de co-seno. Se as células migram com direcionalidade aleatória, a média de cosseno líquido será próximo de zero. Se as células migram directamente para o cátodo, o valor de co-seno será uma. Se as células migram directamente para o ânodo, o valor de co-seno será -1. </li></ol><img alt="Comparação de migração celular, migração aleatória vs galvanotaxis, diagrama com equação de cosseno para direção." fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51973/51973fig4highres.jpg" width="400" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figura 4"> Figura 4: rastreamento de celular para medir a direcionalidade A) Sobreposição das linhas de monitoramento com imagens das células.. Os (x, y) as posições das células são manually rastreados nos filmes de lapso de tempo. . Se as células migram aleatoriamente, o cosseno médio é próximo de zero B) No entanto, se as células migram para o cátodo ou o ânodo, o valor do cosseno médio está próximo de + (cátodo) ou -. (Ânodo) 1,0 C ) A direccionalidade é apresentado pelo valor de co-seno, a qual é convertida a partir dos ângulos de migração (θ). A co-seno (θ) é igual à razão entre a distância A (a distância de migração) a distância b (a distância projectada para a direcção do campo eléctrico). <ol start="3"><li> Salve as medições. Importar os dados para uma aplicação de base de dados para calcular os resultados combinados. </li><li> Exportar os dados combinados de média velocidade de migração e valor médio de co-seno de uma planilha para plotar os gráficos de barras (Figura 5). </li></ol>

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<li>Mukerjee, E. V., Isseroff, R. R., Nuccitelli, R., Collins, S. D., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+array+for+measuring+wound+generated+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Microneedle array for measuring wound generated electric fields.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 4326-4328 (2006).</li>
<li>Nuccitelli, R., Nuccitelli, P., Li, C., Narsing, S., Pariser, D. M., Lui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electric+field+near+human+skin+wounds+declines+with+age+and+provides+a+noninvasive+indicator+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Rep.+and+Reg%22%5BJournal%5D)">The electric field near human skin wounds declines with age and provides a noninvasive indicator of wound healing.</a> Wound Rep. and Reg. 19, 645-655 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A análise da resposta galvanotaxis de uma célula tem sido um importante indicador funcional para muitos migratório celular ou crescimento processa 27, 28. Aqui usamos uma câmara feito por encomenda com superfície de vidro para filmar duas linhas de células da próstata. Estas linhas de células demonstraram diferentes graus de galvanotaxis, e especula-se que a localização intracelular ou da activação das proteínas de mediar galvanotaxis pode ser interferido durante o processo de geração de linhas de células imo...

Campos eléctricos endógenos são detectados em vários tecidos, tais como pele, 1, 32, 33 e 2 cérebro. O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas particulares, incluindo a orientação desenvolvimento embrionário 3, 4, guiando o crescimento de processos neuronais 5, 6 e promoção do epitélio da córnea e o fechamento da ferida 1, 7. In vitro, a aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas imita o campo elétrico fisiológico e induz a migração de células direcional, ou galvanotaxis. Galvanotaxis foi estudado em fibroblastos 8, queratinócitos de peixe 9, epitelial da córnea humana e queratinócitos 10-12, 13 linfócitos, 2, neuroblastos e as células progenitoras neuronais 14. Quando exposta ao campo aplicado, a maioria das células estudadas migrar direccionalmente para a catódica (-) pólo. No entanto, várias células cancerosas, incluindo altamente metastáticocélulas de cancro da mama humano e a linha de células de cancro da próstata humano PC-3M, mover-se para a anódica (+) pólo 15, 16. Vários mecanismos são propostos para mediar galvanotaxis ou para explicar a capacidade das células para detectar o campo eléctrico, incluindo a activação de receptores EGF 12, o canal de sódio epitelial 17, PI3K e PTEN 18, e liberação de íons cálcio 15, 19. O mecanismo ainda não é totalmente compreendido, e é possível que múltiplas vias de sinalização estão envolvidos em galvanotaxis. O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é útil para caracterizar a migração direccional de aderente, células móveis, quer para controlar a migração de células individuais 10, 12, 17 ou migração de uma folha de células confluentes 18, 20. Esta técnica é uma modificação Peng e Jaffe 21, e Nishimura et al. 10 com câmaras de PVC feito por encomenda, claras, com coversl removívelips permitindo a recuperação de células fácil depois galvanotaxis para análise secundária, como a imagem de imuno-fluorescência. A superfície de vidro dos câmaras galvanotaxis óptico é compatível, o que permite que a película de alta ampliação e com células fluorescentemente marcado. Ele também permite que o desenho experimental com a modificação da superfície de vidro, como a alteração do revestimento de superfície ou encargos. Espaçadores feitos de uma lamela No. são usados ​​nas câmaras para minimizar o fluxo de corrente sobre as células; Por conseguinte, o aquecimento por efeito de Joule, o que é proporcional ao quadrado da intensidade da corrente, não sobreaquecer as células durante a experiência. As pontes que ligam agar evitar o contato direto dos eletrodos com as células e evitar a mudança do meio de pH ou concentração de íons durante galvanotaxis. Duas linhas de células de próstata humana não tumorigénicas foram examinadas quanto à sua resposta galvanotaxis neste estudo. Os PRN-1-1 22 e PNT2 23 são ambos SV40-imortalizada, de crescimento de linhas celulares dependentes de factores expressando os marcadores epiteliais citoqueratina 5, 8, 18 e 19 com pouca ou nenhuma expressão do antigénio específico da próstata (PSA). Ambas as linhas celulares manter a morfologia poligonal de células epiteliais normais, mas cromossoma anormalidade foi observada no cariótipo 22, 24. Embora PRN-1-1 e PNT2 partes comportamentos semelhantes na maior parte das experiências, eles mostram diferenças na formação de estrutura e nos ácinos galvanotaxis. Em uma matriz 3-D, Matrigel, os PRN-1-1 células formam estruturas acinares ocas com lumens que assemelham-se a próstata normal de tecido glandular 25. No entanto, as células PNT2 formar esferóides sólidos sem um lúmen ou epitélio polarizado 26. As células PRN-1-1 também demonstram uma resposta mais elevada do que a galvanotactic PNT2 no estudo corrente. A correlação entre a formação de estrutura e acinar galvanotaxis em PRN-1-1 sugere que os sinais galvanotactic pode desempenhar um papel na organização do prmovimentos dos tecidos glandulares ostate em resposta a campos elétricos endógenos, e fornece mais características de discriminar entre estes 2 linhas celulares.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Cells</td></tr><tr><td>pRNS-1-1 células</td><td></td><td></td> da próstata <td>Lee, et al. (1994)</td></tr><tr><td>Células da próstata PNT2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95012613-1VL</td><td>Berthon, et al. (1995)</td></tr><tr><td colspan="4">Medium and solutions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>aquece até 37 &graus; C antes do uso</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino - Premium</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% em PBS, aqueça até 37 &graus; C antes</td></tr><tr><td>de usar Antibiótico-Antimicótico (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>15240</td><td>adicione 5 ml a 500 ml de meio</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>BDH1133-5GL</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td> <td>-</td><td></td> <td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na2HPO4 e 1,5 mM KH2PO4 em 1.000 ml de H2 O, pH para 7,4 e autoclavado, aquecer até 37 &graus; C antes de usar</td></tr><tr><td>0,25% de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td>aquece até 37 &graus; C antes de usar, trate as células por 3-5 min a 37 & C</td></tr><tr><td colspan="4">Dispositivo Galvanotaxixe</td></tr><tr><td>Câmaras Galvanotaxis</td><td>Precision Plastics Inc, CA</td><td></td><td>Personalizado (1/4" x 2" x 3,5"), câmaras de PVC transparentes e não tóxicas. Entre em contato com os autores para obter as especificações do projeto.</td></tr><tr><td>Eletrodos Galvanotaxis</td><td>UCD eletrodos</td><td>enrolados de platina para</td>loja <td></td> elétrica com cabos flexíveis</tr> Caixa <tr><td>de energia Galvanotaxis</td><td>Engenharia de substrato, CA</td><td></td> saída <td>de energia CC projetada sob medida com voltímetro</td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio, grande, 45 x 50 mm, nº 1.5</td><td>Fisher</td><td>12-544-F</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura do microscópio, pequeno, 25 x 25 mm, nº 1</td><td>ThermoScientific</td><td>3307</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de ponta de diamante</td><td>ThermoScientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>Selante de silicone de grau marinho, transparente</td><td>3M</td><td>051135-08019</td><td></td></tr><tr><td>Graxa de alto vácuo</td><td>Dow Corning</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 6 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-64</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Nichiryo, 1,5 ml</td><td>Nichiryo</td><td>SG-M</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de algodão</td><td>Produtos Médicos Purtian</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Qtips</td><td>Johnson & Tubo</td><td></td> de PVC Nalgene 180 da Johnson 729389 <td></td></tr><tr><td></td><td>Nalgene</td><td>8000-9030</td><td>503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall</td></tr><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>0140-01</td><td>faz solução de ágar 2%</td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Personna</td><td>74-0001</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipamentos e Software</td></tr><tr><td>Centrífuga de Bancada</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>operada com um rotor A-4-62</td></tr><tr><td>Celômetro Auto T4</td><td>Nexcelom</td><td>Câmaras de contagem de celômetro T4</td><td></td>automático</tr><tr><td></td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-002</td><td>carga 20 &#956; l soluções celulares para contar</td></tr><tr><td>Temperatura de Cultura Placa de aquecimento</td><td>Bel-Art Scienceware</td><td>370150000</td><td>para manter as câmaras de galvanotaxia em 37 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio Eclipse TE-2000 com platina motorizada e câmara ambiental</td><td>Lente objetiva Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor 10X/0.30</td><td></td> Câmera CCD Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>Retiga EX&nbsp;</td><td>Câmara</td><td>CCD refrigerada Qimaging, monocromática, ar comprimido de 12 bits</td>com 5% de CO2Airgas pedido especial Volocity 6.3 PerkinElmer Software de aquisição de imagem Improvision OpenLab 5.5.2 PerkinElmer Software de rastreamento de células e personalizado para medir ângulos de migração FileMaker Pro Advanced, 8.0 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FileMaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 2008 para Mac</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando a pedido de clientes galvanotaxis chambers para estudar direcional migração das células da próstata

Utilizing Custom-designed Galvanotaxis Chambers to Study Directional Migration of Prostate Cells

O campo eléctrico fisiológico serve funções biológicas específicas, tais como dirigir a migração de células no desenvolvimento embrionário, crescimento neuronal e reparação epitelial. A aplicação de um campo eléctrico de corrente directa para células cultivadas in vitro, induz a migração de células direccional, ou galvanotaxis. O método galvanotaxis 2-dimensional demonstramos aqui é modificado com feito por encomenda poli (cloreto de vinilo) (PVC) câmaras, superfície de vidro, eléctrodos de platina e a utilização de uma fase motorizada no qual as células são criadas imagens. As câmaras de PVC e eletrodos de platina apresentam baixa toxicidade e são acessíveis e re-utilizável. A superfície de vidro e a platina motorizada microscópio melhorar a qualidade das imagens e permitir a possibilidade de alterar a superfície do vidro e tratamentos para as células. Filmamos o galvanotaxis de dois, linhas de células não-tumorais imortalizada com SV40 próstata, PRN-1-1 e PNT2. Estas duas linhas de células mostram velocidades de migração semelhantes e ambos migrar em direcçãocátodo, mas mostram um grau diferente de direcionalidade em galvanotaxis. Os resultados obtidos através deste protocolo sugerem que os PRN-1-1 e as linhas de células PNT2 podem ter diferentes características intrínsecas que governam as suas respostas migratórias direcionais.

Duas linhas de células da próstata (PRN-1-1 e PNT2) foram investigadas com este método. As células em ambas as linhas de migrar a velocidades similares de 1,0 +/- 0,3 micra / min ao longo de 2 horas (Figura 5A). No entanto, o direccionamento para o campo eléctrico é de 0,7 +/- 0,3 para a PRN-linha 1-1, e 0,2 +/- 0,8 para a linha PNT2 (Figura 5B). Os resultados mostram uma diferença significativa na galvanotaxis destas duas linhas celulares (p &lt;0,01, as células foram rastreados 100), ...

Apresentamos um método para aplicar um campo elétrico fisiológico a células migratórias e imortalizadas da próstata em uma câmara de galvanotaxia feita sob medida. Usando este método, demonstramos que 2 linhas de células prostáticas não tumorigênicas demonstram diferentes graus de direcionalidade de migração no campo.

Utilizando a pedido de clientes Galvanotaxis Chambers para Estudar Direcional migração das células da próstata

The physiological electric field serves specific biological functions, such as directing cell migration in embryo development, neuronal outgrowth and ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar Galvan Axxis, um ensaio para avaliar a migração direcional de células em um campo elétrico aplicado. Isso é feito primeiro montando e depois semeando uma câmara de Galvan axxis com as células de interesse. Na segunda etapa, a câmara é selada e um campo elétrico é aplicado para imagens de lapso de tempo.Na etapa final, a velocidade de migração de células individuais e o ângulo em relação ao campo elétrico são rastreados. Em última análise, co-assinar. O pode ser usado para mostrar como as células respondem ao campo elétrico e se migram direcionalmente para o cátodo.A principal vantagem desta técnica é a fácil recuperação celular após o Texas dado para análise secundária e a facilidade com que a migração pode ser filmada em alta ampliação e com células marcadas com fluorescência. A visualização deste método é crítica, pois as etapas de montagem de uma câmara são difíceis de aprender sem demonstração Para montar as câmaras inferiores. Comece limpando uma câmara de plástico galvan axxis com dois propanol.Em seguida, use uma seringa para aplicar selante de silicone de grau marítimo ao redor das aberturas circulares na parte inferior da câmara. Disponha uma lamínula grande sobre o selante e pressione-a no lugar com a ponta de um aplicador de algodão, limpando o excesso de cola com o cotonete. Em seguida, use um marcador de ponta de diamante para cortar uma pequena tampa de vidro para fazer espaços de seis por 25 milímetros e vire a câmara.Em seguida, use uma seringa para aplicar duas tiras de silicone, criando uma superfície de canal de 10 por 25 milímetros para fixação das células entre as duas aberturas circulares no vidro inferior. Em seguida, cole dois espaços de vidro entre as aberturas circulares, empurrando para baixo os espaços com um novo aplicador de algodão e limpando o excesso de cola como acabamos de demonstrar. Experimente a câmara por 24 horas até que a cola de silicone esteja curada.No dia seguinte, mergulhe a câmara em água destilada durante a noite para remover o resíduo de ácido acético da cola antes de semear as células na câmara. Seque e limpe as câmaras com dois propanol, como acabamos de demonstrar. Lave-os com PB S3 estéril vezes e, em seguida, verifique o fluxo de líquido entre as duas aberturas circulares nas câmaras.Depois de confirmar que as câmaras estão em boas condições de funcionamento, coloque-as em placas de cultura estéreis e coloque-as a 37 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto as câmaras estão se equilibrando, retire as células da próstata de sua placa de cultura com cinco mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, neutralize a reação com cinco mililitros de 10% de FBS.Em PBS, transferir as células separadas para tubos de 15 mililitros e centrifugar durante cinco minutos. A 200 vezes, G, aspirar o meio e ressuspender o pellet em um mililitro de meio. Em seguida, depois de contar as células, ajuste a concentração de células para oito por 10 para as quatro células por mililitro com meio de cultura e semente.350 microlitros da suspensão celular em cada câmara. Incube as células na câmara durante a noite em uma placa de cultura com um lenço umedecido Kim a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, comece a montagem das câmaras superiores aquecendo primeiro 10 mililitros de cultura, médio a 37 graus Celsius para cada câmara galvan AXS.Enquanto o meio estiver aquecendo, transfira uma câmara Galvan axxis da incubadora para uma placa de aquecimento a 37 graus Celsius e enxágue a câmara com meio de cultura. Para remover as células soltas, deixe 400 microlitros de meio na câmara e, em seguida, use uma seringa para aplicar graxa de alto vácuo em cima de ambos os espaços de vidro. Sele a câmara com uma lamínula e um aplicador de algodão e, em seguida, seque a superfície do vidro.Em seguida, aplique a graxa de alto vácuo com uma seringa para selar o espaço entre a lamínula e a câmara. Em seguida, adicione o meio de cultura aos reservatórios internos. Remova as bolhas e verifique o fluxo de líquido entre os reservatórios.Para fazer as pontes de ágar, corte um par de tubos de PVC de duas polegadas, vire-os e coloque os pedaços em um copo de 100 mililitros. Em seguida, adicione 200 miligramas de ágar bact toe em um frasco de 50 mililitros com 10 mililitros de meio de cultura para fazer um gel de ágar 2%. Após 30 segundos no micro-ondas, use uma pipeta de transferência para carregar o gel de ágar no tubo de plástico e deixe as pontes de ágar em temperatura ambiente por 10 minutos para solidificar o ágar.Em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura aos reservatórios externos da câmara gal e insira as pontes de ágar nos reservatórios internos e externos do meio para conduzir a corrente para realizar imagens de lapso de tempo da migração. Comece transferindo a câmara de Galvan para uma câmara ambiental de 37 graus Celsius no estágio do microscópio, prendendo a câmara com fita adesiva e focando nas células sob uma objetiva de 10 x. Em seguida, insira os eletrodos Galvan Axxis nos reservatórios externos com o cátodo do lado direito, prendendo o fio e os eletrodos com fita adesiva.Em seguida, ligue a caixa de energia para aplicar um campo elétrico à câmara e use um medidor de tensão para medir a tensão de saída na câmara para atingir 2,5 volts para a câmara de 25 milímetros de comprimento. Agora selecione 10 pontos na câmara para gerar 10 filmes com lapso de tempo e defina as condições de aquisição para intervalos de 10 minutos por duas horas. Em seguida, comece a filmar e ajuste a corrente de saída conforme necessário para manter a intensidade do campo durante o experimento.No final do experimento, remova a câmara do palco e fixe as células em álcool a 95%. Em seguida, abra a câmara. A lamínula pode ser guardada para mais tarde.Coloração e imagem. Limpe a câmara para os próximos anos. Para quantificar o Galvan Axxis, gire os filmes de lapso de tempo para orientar o cátodo para o topo das imagens.Exporte os filmes para o software de rastreamento de células e rastreie manualmente a posição XY de 10 a 20 células em cada ponto de tempo de cada filme, as distâncias de migração e os ângulos relativos à direção norte-sul, a mesma orientação do campo elétrico será calculada no software de rastreamento de células. Por fim, salve as medições e importe os dados para um aplicativo de banco de dados para calcular os resultados combinados. Neste experimento representativo de Galvan Axxis para linhas de células da próstata foram determinadas a migrar em velocidades semelhantes ao longo de duas horas.No entanto, a direcionalidade para o campo elétrico foi de 0,7 mais menos 0,3 para o PRNS de uma linha, e de 0,2 mais menos 0,8 para o PNT de duas linhagens, indicando uma diferença significativa no eixo de Galvan dessas duas linhagens celulares, sugerindo que seus mecanismos de sinalização celular direcionam respostas de migração diferencial para o campo elétrico após o desenvolvimento do método Govan Texas. Esta técnica ajuda os pesquisadores a explorar os mecanismos de migração celular direcional no campo elétrico.

utilizing-custom-designed-galvanotaxis-chambers-to-study-directional

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Imagem lapso de tempo de cultura de tecidos 3D permite estudar o comportamento migratório de células individuais provenientes de eminência ganglionar em reação ao extrato de proteínas fracionadas do córtex cerebral.

Comportamento migratório de células geradas em culturas Eminence ganglionares

Uma abordagem para analisar a migração de células explantadas (células tronco da crista neural) é descrita. Este método é barato, suave, e é capaz de distinguir a quimiotaxia tanto de quimiocinese e outras influências sobre a polaridade migratórias tais como aqueles derivados de interacções célula-célula dentro da cultura de células primária tronco da crista neural.

Análise de Tronco de Migração da crista neural celular usando uma modificação Zigmond Ensaio Câmara

O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Neste protocolo demonstramos como construir câmaras personalizados que permitem a aplicação de um campo elétrico de corrente contínua para permitir lapso de tempo de imagem do cérebro adulto derivado translocação de células neurais precursor durante galvanotaxis.

Um Ensaio Galvanotaxis para Análise de Precursores Neurais Cinética migração celular em um campo aplicado externamente Corrente Contínua Elétrica

Um método quantitativo para estudar a migração espontânea de células em um microambiente confinado unidimensional é descrito. Este método tira vantagem de canais microfabricados e pode ser utilizado para estudar a migração de grande número de células em condições diferentes nas experiências individuais.

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A migração celular é uma parte importante do desenvolvimento e da vida humana. A fim de entender os mecanismos que podem alterar a migração celular, apresentamos um sistema de difusão de gradiente planar para investigar a quimiotaxia em uma matriz de colágeno 3D, o que permite superar as limitações modernas da câmara de difusão dos ensaios existentes.

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Muitos dispositivos microfluídicos foram desenvolvidos para uso no estudo da eletrotaxia. No entanto, nenhum desses chips permite o estudo eficiente dos efeitos simultâneos de campo químico e elétrico (EF) nas células. Desenvolvemos um dispositivo à base de polimetilmetacrilato que oferece FE coexistente melhor controlada e estimulação química para uso em pesquisa de eletrotaxia.

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ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.

Imagiologia G protein-coupled receptor mediada por quimiotaxia e seus eventos de sinalização em células de HL60 de Neutrófilos-like

Este protocolo detalha um método personalizada para medir a migração celular em resposta a quimioatractores, que também podem ser utilizados para determinar a taxa de difusão de um fármaco a partir de uma matriz de polímero.

A Câmara customizáveis ​​para a migração celular de medição

Aqui, descrevemos técnicas de imagem ao vivo-celular para medir quantitativamente a migração e invasão de células-tronco tumor glioblastoma cerebral ao longo do tempo e sob várias condições de tratamento.

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Aprenda a usar câmaras de galvanotaxia personalizadas para estudar a migração direcional de células da próstata imortalizadas em campos elétricos. Este método permite analisar o comportamento celular em pesquisa sobre câncer de próstata.

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