Utilizando a pedido de clientes Galvanotaxis Chambers para Estudar Direcional migração das células da próstata
December 7th, 2014
Apresentamos um método para aplicar um campo elétrico fisiológico a células migratórias e imortalizadas da próstata em uma câmara de galvanotaxia feita sob medida. Usando este método, demonstramos que 2 linhas de células prostáticas não tumorigênicas demonstram diferentes graus de direcionalidade de migração no campo.
O objetivo geral deste procedimento é realizar Galvan Axxis, um ensaio para avaliar a migração direcional de células em um campo elétrico aplicado. Isso é feito primeiro montando e depois semeando uma câmara de Galvan axxis com as células de interesse. Na segunda etapa, a câmara é selada e um campo elétrico é aplicado para imagens de lapso de tempo.
Na etapa final, a velocidade de migração de células individuais e o ângulo em relação ao campo elétrico são rastreados. Em última análise, co-assinar. O pode ser usado para mostrar como as células respondem ao campo elétrico e se migram direcionalmente para o cátodo.
A principal vantagem desta técnica é a fácil recuperação celular após o Texas dado para análise secundária e a facilidade com que a migração pode ser filmada em alta ampliação e com células marcadas com fluorescência. A visualização deste método é crítica, pois as etapas de montagem de uma câmara são difíceis de aprender sem demonstração Para montar as câmaras inferiores. Comece limpando uma câmara de plástico galvan axxis com dois propanol.
Em seguida, use uma seringa para aplicar selante de silicone de grau marítimo ao redor das aberturas circulares na parte inferior da câmara. Disponha uma lamínula grande sobre o selante e pressione-a no lugar com a ponta de um aplicador de algodão, limpando o excesso de cola com o cotonete. Em seguida, use um marcador de ponta de diamante para cortar uma pequena tampa de vidro para fazer espaços de seis por 25 milímetros e vire a câmara.
Em seguida, use uma seringa para aplicar duas tiras de silicone, criando uma superfície de canal de 10 por 25 milímetros para fixação das células entre as duas aberturas circulares no vidro inferior. Em seguida, cole dois espaços de vidro entre as aberturas circulares, empurrando para baixo os espaços com um novo aplicador de algodão e limpando o excesso de cola como acabamos de demonstrar. Experimente a câmara por 24 horas até que a cola de silicone esteja curada.
No dia seguinte, mergulhe a câmara em água destilada durante a noite para remover o resíduo de ácido acético da cola antes de semear as células na câmara. Seque e limpe as câmaras com dois propanol, como acabamos de demonstrar. Lave-os com PB S3 estéril vezes e, em seguida, verifique o fluxo de líquido entre as duas aberturas circulares nas câmaras.
Depois de confirmar que as câmaras estão em boas condições de funcionamento, coloque-as em placas de cultura estéreis e coloque-as a 37 graus Celsius por 15 minutos. Enquanto as câmaras estão se equilibrando, retire as células da próstata de sua placa de cultura com cinco mililitros de tripsina EDTA a 37 graus Celsius. Após cinco minutos, neutralize a reação com cinco mililitros de 10% de FBS.
Em PBS, transferir as células separadas para tubos de 15 mililitros e centrifugar durante cinco minutos. A 200 vezes, G, aspirar o meio e ressuspender o pellet em um mililitro de meio. Em seguida, depois de contar as células, ajuste a concentração de células para oito por 10 para as quatro células por mililitro com meio de cultura e semente.
350 microlitros da suspensão celular em cada câmara. Incube as células na câmara durante a noite em uma placa de cultura com um lenço umedecido Kim a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, comece a montagem das câmaras superiores aquecendo primeiro 10 mililitros de cultura, médio a 37 graus Celsius para cada câmara galvan AXS.
Enquanto o meio estiver aquecendo, transfira uma câmara Galvan axxis da incubadora para uma placa de aquecimento a 37 graus Celsius e enxágue a câmara com meio de cultura. Para remover as células soltas, deixe 400 microlitros de meio na câmara e, em seguida, use uma seringa para aplicar graxa de alto vácuo em cima de ambos os espaços de vidro. Sele a câmara com uma lamínula e um aplicador de algodão e, em seguida, seque a superfície do vidro.
Em seguida, aplique a graxa de alto vácuo com uma seringa para selar o espaço entre a lamínula e a câmara. Em seguida, adicione o meio de cultura aos reservatórios internos. Remova as bolhas e verifique o fluxo de líquido entre os reservatórios.
Para fazer as pontes de ágar, corte um par de tubos de PVC de duas polegadas, vire-os e coloque os pedaços em um copo de 100 mililitros. Em seguida, adicione 200 miligramas de ágar bact toe em um frasco de 50 mililitros com 10 mililitros de meio de cultura para fazer um gel de ágar 2%. Após 30 segundos no micro-ondas, use uma pipeta de transferência para carregar o gel de ágar no tubo de plástico e deixe as pontes de ágar em temperatura ambiente por 10 minutos para solidificar o ágar.
Em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura aos reservatórios externos da câmara gal e insira as pontes de ágar nos reservatórios internos e externos do meio para conduzir a corrente para realizar imagens de lapso de tempo da migração. Comece transferindo a câmara de Galvan para uma câmara ambiental de 37 graus Celsius no estágio do microscópio, prendendo a câmara com fita adesiva e focando nas células sob uma objetiva de 10 x. Em seguida, insira os eletrodos Galvan Axxis nos reservatórios externos com o cátodo do lado direito, prendendo o fio e os eletrodos com fita adesiva.
Em seguida, ligue a caixa de energia para aplicar um campo elétrico à câmara e use um medidor de tensão para medir a tensão de saída na câmara para atingir 2,5 volts para a câmara de 25 milímetros de comprimento. Agora selecione 10 pontos na câmara para gerar 10 filmes com lapso de tempo e defina as condições de aquisição para intervalos de 10 minutos por duas horas. Em seguida, comece a filmar e ajuste a corrente de saída conforme necessário para manter a intensidade do campo durante o experimento.
No final do experimento, remova a câmara do palco e fixe as células em álcool a 95%. Em seguida, abra a câmara. A lamínula pode ser guardada para mais tarde.
Coloração e imagem. Limpe a câmara para os próximos anos. Para quantificar o Galvan Axxis, gire os filmes de lapso de tempo para orientar o cátodo para o topo das imagens.
Exporte os filmes para o software de rastreamento de células e rastreie manualmente a posição XY de 10 a 20 células em cada ponto de tempo de cada filme, as distâncias de migração e os ângulos relativos à direção norte-sul, a mesma orientação do campo elétrico será calculada no software de rastreamento de células. Por fim, salve as medições e importe os dados para um aplicativo de banco de dados para calcular os resultados combinados. Neste experimento representativo de Galvan Axxis para linhas de células da próstata foram determinadas a migrar em velocidades semelhantes ao longo de duas horas.
No entanto, a direcionalidade para o campo elétrico foi de 0,7 mais menos 0,3 para o PRNS de uma linha, e de 0,2 mais menos 0,8 para o PNT de duas linhagens, indicando uma diferença significativa no eixo de Galvan dessas duas linhagens celulares, sugerindo que seus mecanismos de sinalização celular direcionam respostas de migração diferencial para o campo elétrico após o desenvolvimento do método Govan Texas. Esta técnica ajuda os pesquisadores a explorar os mecanismos de migração celular direcional no campo elétrico.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método para aplicar um campo elétrico fisiológico a células prostáticas imortalizadas em migração usando uma câmara de galvanotaxia personalizada. Os resultados indicam que duas linhagens de células prostáticas não tumorigênicas exibem diferentes graus de direcionalidade de migração em resposta ao campo elétrico.
Componentes-Chave do Estudo
Área da Ciência
- Migração celular
- Electrofisiologia
- Pesquisa sobre o câncer de próstata
Fundo
- A galvanotaxia é o movimento direcionado de células em resposta a um campo elétrico.
- Este método pode ajudar a entender o comportamento celular na pesquisa de câncer.
- Células prostáticas imortalizadas servem como um modelo para estudar o comportamento de células não tumorigênicas.
- Linhagens celulares diferentes podem responder de forma variável a campos elétricos.
Objetivo do Estudo
- Avaliar a migração direcional de células prostáticas em um campo elétrico.
- Comparar o comportamento de migração de diferentes linhagens celulares prostáticas não tumorigênicas.
- Estabelecer um método confiável para estudar a galvanotaxia in vitro.
Métodos Utilizados
- Montagem de uma câmara de galvanotaxia personalizada.
- Semeadura da câmara com células prostáticas imortalizadas.
- Aplicação de um campo elétrico durante a filmagem em time-lapse.
- Acompanhamento da velocidade e direção de migração de células individuais em relação ao campo elétrico.
Principais Resultados
- Duas linhagens de células prostáticas não tumorigênicas mostraram graus variados de migração direcional.
- As células migraram em direção ao cátodo, indicando uma resposta ao campo elétrico.
- Foi realizada uma análise quantitativa da velocidade de migração e ângulos.
- O método fornece insights sobre o comportamento das células prostáticas sob campos elétricos.
Conclusões
- A câmara de galvanotaxia é uma ferramenta eficaz para estudar a migração celular.
- Diferentes linhagens celulares prostáticas exibem padrões de migração distintos em resposta a campos elétricos.
- Esta pesquisa contribui para a compreensão do papel dos campos elétricos no comportamento celular.
