Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

O objetivo geral do experimento a seguir é estimar a produção tímica e da medula óssea quantificando os círculos de excisão do receptor de células T ou os círculos de excisão de recombinação de REX e K em um único ensaio. Isso é conseguido construindo primeiro um plasmídeo de inserção tripla contendo fragmentos da sequência de DNA de TRX correto e de um gene de referência de cópia única, a fim de manter uma proporção de um para um para um entre os três alvos após a amplificação do DNA. Em seguida, uma curva padrão é construída realizando diluições seriais do plasmídeo de inserção tripla, o que permite a quantificação absoluta das três sequências alvo por PCR em tempo real.

Finalmente, um ensaio de PCR em tempo real é executado, levando à quantificação absoluta de tres e rachaduras. Os resultados relatados mostram as mudanças na produção tímica e de medula óssea com a idade e o sexo em crianças e adultos saudáveis. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando precisávamos analisar tanto a medula óssea quanto o débito tímico em recém-nascidos ou lactentes, considerando que a quantidade de sangue geralmente coletada é escassa em comparação com os adultos.

Portanto, decidimos combinar os dois métodos de quantificação de rastreamentos e correções em um único ensaio, a fim de otimizar a preparação da amostra e os custos do reagente. A implicação desta técnica se estende ao diagnóstico de deficiências imunológicas primárias e adquiridas, mas o método também pode ser usado em todas as doenças que envolvem perda de células TMB, bem como para estudar uma nova reconstituição após transplante de medula óssea Através deste método pode fornecer informações sobre doenças humanas. Também pode ser aplicado à pesquisa básica, principalmente aquela que envolve a homeostase de linfócitos.

A principal vantagem é que, ao empregar um excedente triplo, apenas uma única cura padrão é necessária, reduzindo assim a variabilidade experimental. Geralmente, indivíduos novos neste método podem ter dificuldades devido ao longo procedimento necessário para a preparação do plasmídeo de inserção tripla ou devido aos problemas relacionados à preparação da curva padrão. Para começar, obtenha uma amostra contendo células com grande probabilidade de ter TRX e rachaduras detectáveis por PCR, como sangue periférico de um indivíduo jovem e saudável coletado em tubos de EDTA usando um método padrão de separação por gradiente de densidade.

Separe as células mononucleares do sangue periférico após extrair o DNA das células de acordo com o protocolo de texto, use primers específicos Fort TRX REX e gene da constante TCR alfa para amplificar o sinal Rex, a junta de sinal Rex articular e os fragmentos de genes da constante TCR alfa. Insira o produto de PCR da junta de sinal Trax no local aceptor TA do vetor topo PCR 2.1 e use o DNA do plasmídeo para transformar células quimicamente competentes XL one blue por choque térmico, isolar colônias brancas resistentes à ampicilina que perderam a complementação da beta lactase em uma nova placa mestra e usar PCR para identificar as colônias contendo o fragmento de trek. Depois de cultivar uma das colônias positivas de trek e isolar o DNA, use SP um para digerir o plasmídeo e o produto amplificado do gene da constante alfa TCR e ligar o fragmento do gene da constante alfa TCR ao plasmídeo.

Repita a transformação, a seleção e expansão de colônias e o isolamento de DNA para inserir o fragmento correto, use três traseiros em vez de SP um para digerir o plasmídeo e o fragmento de PCR correto e repita o processo para ligar e isolar o DNA. Uma vez verificadas as sequências das três inserções, expanda a colônia e purifique o DNA do plasmídeo por preparação MIDI de acordo com o protocolo de texto para preparar uma curva padrão. Depois de calcular a massa e a concentração do plasmídeo como mostrado aqui, descongele uma alíquota do plasmídeo e você mostra uma para linearizar dois microgramas com a alíquota linearizada de DNA.

Use a fórmula C um V um é igual a C dois V dois. Para calcular o volume de diluição necessário para preparar o primeiro ponto da curva-padrão da série, como aqui se mostra, preparar uma série de uma a 10 diluições para obter os restantes pontos da curva-padrão. Armazene a diluição do plasmídeo a 80 graus Celsius negativos até o uso Para preparar amostras para PCR em tempo real, organize uma placa de PCR que inclua pelo menos duas réplicas para cada amostra a ser analisada da seguinte maneira com dois tubos separados, um para Rex e rachaduras e outro para a constante TCR alfa

Prepare as misturas principais para o número total de poços necessários. Adicione 20 microlitros aos poços da placa. Em seguida, adicione cinco microlitros de DNA genômico extraído de células mononucleares do sangue periférico ou P BMCs.

Adicione cinco microlitros de água aos poços de controle sem gabarito antes de usar uma tampa adesiva óptica para selar a placa de reação. Em seguida, descongelar a diluição da curva padrão do ADN do plasmídeo e preparar a diluição mais elevada. Descubra apenas os poços localizados entre as linhas A a H e as colunas de um a quatro.

E após um breve vórtice, adicione cinco microlitros de cada ponto de diluição ao seu designado. Certifique-se de que não haja bolhas no fundo dos poços e que os reagentes estejam assentados no fundo. Use um sistema de PCR em tempo real para executar o ensaio com o seguinte protocolo.

50 graus Celsius por dois minutos e aquecimento inicial a 95 graus Celsius por 10 minutos, seguido por 45 ciclos de desnaturação a 95 graus Celsius por 15 segundos. E uma sonda de primer combinada e ajoelhado e alongamento a 60 graus Celsius por um minuto. Para analisar os dados de PCR em tempo real, abra o arquivo de resultados salvo no software e clique na guia de resultados na parte superior da janela.

Clique no menu de análise e selecione as configurações de análise. Deixe o software determinar o limite automaticamente selecionando todos os detectores e CT automático para o ciclo de limite. Deixe o software definir a linha de base automática para eliminação em segundo plano por padrão.

Clique na guia chamada gráfico de amplificação e, na parte mais à direita da janela, selecione um dos três detectores no menu suspenso correspondente. Logo abaixo selecione TC manual para definir manualmente um limite na parte inferior da janela, selecione os poços correspondentes aos pontos de diluição da curva padrão do detector escolhido para mostrar os gráficos de amplificação clicando e arrastando o mouse sobre as células correspondentes da tabela. Para ajustar o limite manualmente, arraste a linha vermelha de limite para cima e para baixo e clique em analisar para reanalisar os resultados.

Para verificar como a definição do limite afeta os resultados, selecione a guia de relatório e veja o TC resultante dos respectivos pontos de diluição da curva padrão. Ao mover o limite para obter o posicionamento ideal na guia de gráfico de amplificação, verifique se o limite está em uma região de amplificação exponencial suficientemente acima do ruído de fundo, mas abaixo da fase de platô. Se o gráfico de amplificação não for mostrado em escala logarítmica, clique com o botão direito do mouse no gráfico para recuperar as configurações do gráfico e defina a configuração pós-execução Y ais como log.

Defina o limite na metade da parte linear do gráfico e observe as curvas de amplificação aproximadamente paralelas umas às outras. Clique na guia do relatório para ver os resultados da TC. Certifique-se de que o posicionamento do limite produziu resultados que maximizem a precisão das duas réplicas de cada curva padrão.

Pontos de diluição. Verificar se o limiar está colocado no ponto que melhor reflecte as ordens extremas de grandeza dos pontos de diluição da curva-padrão no separador de relatório. Arraste o mouse novamente na tabela na parte inferior da janela para selecionar as células correspondentes aos poços da curva padrão Para todos os detectores, verifique se o TC resultante dos três alvos é muito semelhante nos mesmos pontos de diluição.

Por exemplo, diferença, não mais de 0,5 CT reajuste os limites, se necessário, e verifique novamente na guia relatório na parte inferior da janela. Selecione os poços NTC e verifique se não há amplificação nos poços NTC, o que corresponde a um CT de indeterminado. Selecione a guia da curva padrão e, à direita da janela de plotagem, selecione detectores no menu suspenso e veja se a inclinação da curva padrão relatada varia entre 3,55 negativos e 3,32 negativos, o que corresponde a eficiências de PCR de 91 a 100%Certifique-se de que o coeficiente de determinação ou R ao quadrado seja superior a 0,998 verificando seu valor logo abaixo da inclinação e interceptação.

Clique na guia do relatório e, nas células correspondentes da tabela abaixo do gráfico, verifique se o TC do controle positivo é consistente com os resultados dos ensaios anteriores no mesmo controle positivo conhecido. Clique no menu arquivo, salve e exporte para um arquivo CSV para exportar as quantidades de todos os poços em um arquivo de texto contendo valores separados por vírgula. Por fim, importe o arquivo CSV em um software de planilha e calcule o número de faixas ou correções por 10 para os seis PBMs definindo a seguinte fórmula adequadamente.

O ensaio descrito neste vídeo foi realizado em uma amostra representativa de 87 controles saudáveis. 42 crianças de zero a 17 anos e 45 adultos de 24 a 60 anos. Como mostrado aqui, o número de caminhadas diminuiu drasticamente com a idade devido à involução tímica de zero a três a quatro anos em adultos.

O número de caminhadas também depende do sexo porque diminui mais rapidamente nos homens do que nas mulheres, o que pode afetar a capacidade de definir intervalos de referência apropriados. Esses gráficos mostram que o número de trincas, no entanto, diminuiu com a idade semelhante ao padrão observado com T TREXs apenas em crianças. Já em adultos, a produção de medula óssea é bastante estável ao longo da vida e não depende do sexo.

A preparação do plasmídeo triplo em inserção requer cerca de duas ou três semanas, mas depois disso, os lotes de plasmídeo armazenados durarão três anos. A parte restante da técnica pode ser feita em apenas quatro a cinco horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é muito importante realizar toda a manipulação relacionada ao plasmídeo em uma área dedicada para evitar a contaminação cruzada do DNA.

Também é essencial verificar a estabilidade do tubo padrão ao analisar os resultados após seu desenvolvimento. Essa técnica forneceu aos pesquisadores no campo da imunologia clínica ou hematologia, uma ferramenta aprimorada para a identificação de deficiências imunológicas primárias para monitorar o resultado da reconstituição imunológica, após o transplante de medula óssea, ou simplesmente estudar a homeostase dos linfócitos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter o triplo no plasmídeo, preparar a curva padrão, executar o experimento de PCR em tempo real e realizar os cálculos necessários para obter uma quantificação absoluta reprodutível de trax e rachaduras.