Name: Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Aprenda a quantificar simultaneamente TRECs e KRECs por PCR em tempo real para avaliar a produção timica e da medula ossea. Este metodo utiliza um plasmideo de tripla insercao e curva padrao para quantificacao absoluta.

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Os autores não têm agradecimentos.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A quantificação de TREC e KREC pode ser considerada uma boa estimativa da produção recente de tímico e medula óssea, desde que algumas ressalvas sejam levadas em consideração. Embora um método de quantificação absoluta que emprega a curva padrão exija mais reagentes e mais espaço na placa de reação de PCR em tempo real, ele garante resultados quantitativos altamente precisos porque quantidades de amostra desconhecidas são interpoladas a partir de curvas padrão construídas sobre quantidades conhecidas de material de parti...

Círculos excisão do receptor de células T (TRECs) e os círculos a recombinação de excisão-exclusão K (KRECs) são pequenos elementos de ADN circularizado que são excisados, numa proporção de células T e B-, respectivamente, durante um processo de recombinação de DNA genómico, levando à formação de um repertório altamente diversificada de T e receptores de células-B. Eles não têm qualquer função, mas porque eles são estáveis ​​e não pode ser replicado, eles são diluídos após cada divisão celular, persistindo assim em apenas uma das duas células filhas. Portanto, os seus níveis no sangue periférico pode ser assumida como uma estimativa da potência do timo e da medula óssea. Enquanto o ensaio de TREC tem sido largamente utilizado nos últimos 15 anos, para avaliar a extensão da saída do timo, a um ensaio de KREC, que foi inicialmente desenvolvido para medir a proliferação de células B e a sua contribuição para a homeostase da célula B na saúde e na doença, 2 Só recentemente foi proposta como um marcador de osso marrow saída 3,4. Aqui, descrevemos o método que desenvolvemos para a quantificação simultânea de ambos os TRECs e KRECs. 4 Com este método combinado, a variabilidade associada a quantificação de ADN por PCR em tempo real é eliminada através da utilização de uma única curva padrão obtida por diluição de um plasmídeo de inserção de triplo contendo fragmentos de TRECs, KRECs e de células T constante receptor alfa (TCRAC) gene numa proporção de 1: 1: 1. Isto permite uma avaliação mais precisa do número de exemplares TREC e KREC. Além disso, a quantificação simultânea dos dois alvos na mesma reacção permite a redução de custos de reagentes. O ensaio de TREC / KREC proposto pode ser útil para medir o grau de T e neo-produção de células B em crianças ou adultos com Imunodeficiência Combinada Grave (SCID), 4 imunodeficiência comum variável, cinco doenças auto-imunes, 6-8 e infecção pelo HIV 9. Além disso, ele pode ser usado paramonitorar a recuperação imunológica após o transplante de células-tronco hematopoéticas, 10 de substituição enzimática, 11 e antiviral 9 ou imunomoduladores terapias. 6-8 Finalmente, porque os pacientes SCID são reconhecidos utilizando o ensaio de TREC apesar dos defeitos genéticos subjacentes, e agammaglobulinemia pacientes podem ser identificados usando KREC quantificação , o ensaio TREC / KREC pode também ser usado para detectar imunodeficiências em programas de rastreio neonatal. 12 Neste caso, o ensaio deve ser realizado em ADN extraído de pequenas manchas de sangue apagados e secos em papel de filtro, deve ser altamente sensível e específico para as doenças-alvo, bem como altamente reprodutível e de baixo custo. A introdução de KREC quantificação do ensaio deve melhorar performances de triagem neonatal para imunodeficiências, que tem sido realizada rotineiramente nos algumas partes dos EUA (WI, MA, CA) desde 2008, quando se tornou o primeiro Wisconsin para Introduce da análise de TRECs em seu programa de triagem pós-natal. 13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>método de separação de gradiente de densidade</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>Extração de DNA</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos de DNA não modificados HPSF 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA Polimerase: incluindo 10x Buffer II e 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Clonagem TOPO TA para Subclonagem</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Células Competentes de Grau de Subclonagem</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5,000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TE tampão (1 mM TRIS e 0.1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master</td><td>Mix Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Sondas duplas marcadas HPLC 0.01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Ressuspender o produto liofilizado a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aplicador Termociclador Biosystems 2720</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em Tempo Real Fast 7500</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de Detecção de Sequência SDS 1.4</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificação simultânea de t-célula receptora excisão circles (trecs) e k-excluindo recombinação excisão circles (krecs) por pcr em tempo real

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão K (KRECs) são elementos de DNA circularizados formados durante o processo de recombinação que cria receptores de células T e B. Como os TRECs e KRECs são incapazes de se replicar, eles são diluídos após cada divisão celular e, portanto, persistem na célula. Sua quantidade no sangue periférico pode ser considerada como uma estimativa da produção tímica e da medula óssea. Ao combinar o ensaio TREC bem estabelecido e comumente usado com uma versão modificada do ensaio KREC, desenvolvemos uma PCR quantitativa duplex em tempo real que permite a quantificação de linfócitos T e B recém-produzidos em um único ensaio. O número de TRECs e KRECs é obtido usando uma curva padrão preparada pela diluição em série de juntas de sinal TREC e KREC clonadas em um plasmídeo bacteriano, juntamente com um fragmento do gene da constante alfa do receptor de células T que serve como gene de referência. Os resultados são relatados como número de TRECs e KRECs/106 células ou por ml de sangue. A quantificação desses fragmentos de DNA tem se mostrado útil para monitorar a reconstituição imune após o transplante de medula óssea em crianças e adultos, para melhorar a caracterização de deficiências imunológicas ou para uma melhor compreensão de certas atividades imunomoduladoras de drogas.

O ensaio foi realizado em uma amostra representativa de 87 controles saudáveis: 42 crianças com idades entre 0-17 (masculino / feminino: 25/17) e 45 adultos com idades entre 24-60 (homens / mulheres: 29/16). Os resultados foram obtidos como TRECs e KRECs por 10 6 PBMC, e, em seguida, os TRECs e KRECs por ml de sangue foram calculados. O número de TRECs diminui com a idade, devido a involução do timo, 4, em especial de uma forma muito acentuada de 0 a 3 - 4 anos. Em adul...

Aqui, descrevemos um método para quantificação simultânea de círculos de excisão de receptores de células T (TRECs) e círculos de excisão de recombinação de exclusão de K (KRECs). O ensaio TREC/KREC pode ser usado como marcador de débito tímico e de medula óssea.

Quantificação simultânea de T-célula receptora Excisão Circles (TRECs) e K-Excluindo Recombinação Excisão Circles (KRECs) por PCR em tempo real

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

O objetivo geral do experimento a seguir é estimar a produção tímica e da medula óssea quantificando os círculos de excisão do receptor de células T ou os círculos de excisão de recombinação de REX e K em um único ensaio. Isso é conseguido construindo primeiro um plasmídeo de inserção tripla contendo fragmentos da sequência de DNA de TRX correto e de um gene de referência de cópia única, a fim de manter uma proporção de um para um para um entre os três alvos após a amplificação do DNA. Em seguida, uma curva padrão é construída realizando diluições seriais do plasmídeo de inserção tripla, o que permite a quantificação absoluta das três sequências alvo por PCR em tempo real.Finalmente, um ensaio de PCR em tempo real é executado, levando à quantificação absoluta de tres e rachaduras. Os resultados relatados mostram as mudanças na produção tímica e de medula óssea com a idade e o sexo em crianças e adultos saudáveis. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando precisávamos analisar tanto a medula óssea quanto o débito tímico em recém-nascidos ou lactentes, considerando que a quantidade de sangue geralmente coletada é escassa em comparação com os adultos.Portanto, decidimos co

simultaneous-quantification-t-cell-receptor-excision-circles-trecs-k

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

A compartimentação de proteínas, quer no interior da membrana plasmática ou em localizações intracelulares é um mecanismo de regulação que pode influenciar grandemente os resultados de sinalização, daí, para compreender a sinalização é importante para estudar o comportamento espacial e temporal das proteínas envolvidas. Descrevemos aqui um sistema de microscopia TIRF base para estudar a transdução de sinal em células T, mas é amplamente aplicável.

A técnica de microscopia TIRF para imagens em tempo real, simultâneo da TCR e seus associados proteínas sinalizadoras

Nós descrevemos um método para a quantitativa, a medição em tempo real de DNA glicosilase e as actividades de endonucleases de AP em células lisados ​​nucleares. O ensaio produz taxas de actividade de reparação de ADN passíveis de análise cinética e é adaptável para a quantificação da actividade de reparação de ADN em tecido e lisados ​​tumorais ou com proteínas purificadas.

Quantitativa, análise em tempo real da Base de Dados de atividade de reparo de excisão em lisados ​​celulares Utilizando Lesão específicos Beacons Molecular

Os cromossomos projetados do projeto Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, podem ser distinguidos de suas contrapartes nativas usando um ensaio de genotipagem baseado em PCR chamado PCRTagging, que tem um endpoint de presença/ausência. Aqui, descrevemos um método de detecção de PCR em tempo real de alto rendimento para genotipagem de PCRTag.

Análise qPCRTag - A High Throughput, PCR em Tempo Real Ensaio para Sc2.0 Genotipagem

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Aqui, apresentamos um protocolo para o ex vivo deteção qualitativa do antígeno-específicos CD8+ T células. Análise é possível com suspensões celulares único de órgãos ou de pequenas quantidades de sangue. Uma ampla gama de estudos requer a análise das respostas de célula de T citotóxicas (vacinação e estudos de imunoterapia do câncer).

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Aqui, apresentamos um protocolo para gerar clones de células de câncer que contém uma marca de sequência MS2 em um único subtelomere. Esta abordagem, baseando-se no sistema MS2-GFP, permite a visualização de transcrições endógenas de oligospermia repetição contendo RNA (TERRA) expressado de um único dos telômeros em células vivas.

Geração de Clones de células câncer Visualizar oligospermia Repeat-contendo RNA TERRA expressado de um único dos telômeros em células vivas

Aqui descrevemos um método robusto de determinar a identidade e a pureza das células imunes através de assinaturas epigenéticas detectadas usando PCR quantitativo (qPCR). A demetilação do DNA em um lócus específico serve como um identificador exclusivo para um determinado tipo de célula e permite a identificação de células CD8+, regulatóriaou ou Th17 T.

Determinação da identidade celular imune e pureza usando PCR quantitativo baseado em epigenética

O protocolo atual descreve um método de isolamento de DNA a partir de amostras de sangue e biópsias intestinais, geração de bibliotecas TCRβ e IGH PCR para sequenciamento de próxima geração, desempenho de uma execução de NGS e análise de dados básicos.

Análise de repertório imune do receptor de células T e B usando sequenciamento de última geração

Aprenda a quantificar simultaneamente TRECs e KRECs por PCR em tempo real para avaliar a produção timica e da medula ossea. Este metodo utiliza um plasmideo de tripla insercao e curva padrao para quantificacao absoluta.

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