Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a fidelidade da segregação cromossômica durante a mitose em um embrião vivo de peixe-zebra usando cromatina marcada com fluorescência e proteínas da membrana celular que serão capturadas usando microscopia confocal de alta resolução. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da mitose, como como os defeitos mitóticos resultam em um defeito de desenvolvimento ou formação de tumor em um organismo vertebrado vivo? A principal vantagem desta técnica é que estamos observando mitose em um organismo vertebrado vivo que permite a coleta de dados fisiologicamente relevantes.

Depois de criar peixes-zebra adultos e injetar ovos com H2A. F/Z-EGFP e/ou pCS2 mCherry-CAAX RNA, aproximadamente duas horas antes da imagem, use um microscópio de dissecação fluorescente para identificar embriões GFP-positivos. Transfira embriões verdes brilhantes que expressam GFP para uma nova placa de Petri de 100 por 15 milímetros com meio azul E3.

Ferva uma solução estoque de agarose de baixo ponto de fusão a 1% em azul E3. Alíquota de três mililitros da agarose derretida em um tubo de cultura de 17 por 100 milímetros. Mantenha a agarose aquecida colocando o tubo de cultura em banho-maria a 42 graus Celsius até que esteja pronto para uso.

Reúna tricaína de 15 milimolares, embriões selecionados, agarose de baixo ponto de fusão, azul E3 e uma placa de cultura com fundo de lamínula de vidro de 35 milímetros e um microscópio de luz dissecante. Em seguida, com uma pinça número cinco, remova cuidadosamente os córions de três embriões e coloque os embriões em um recipiente separado para serem anestesiados. Em seguida, usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas de tricaína 15 milimolar no prato que contém os embriões e cinco mililitros de meio.

Adicione três a quatro gotas de solução de tricaína a 15 milimolares ao tubo de agarose derretida a 1%. Quando os embriões estiverem suficientemente anestesiados, usando um Pipetman P200, com um centímetro da ponta da pipeta cortado, transfira os embriões anestesiados para a placa com fundo de lamínula. Remova qualquer excesso de solução de tricaína azul E3.

Adicione lentamente cinco a 10 microlitros de solução de agarose-tricaína de baixo ponto de fusão sobre os embriões, mantendo cada gota separada, para garantir que os embriões não se aproximem uns dos outros. Em seguida, usando uma agulha de calibre 21 e meio, oriente suavemente os embriões na agarose para a posição desejada, orientando a região de interesse o mais próximo possível da lamínula se estiver usando um microscópio invertido. Devido ao deslocamento que pode ocorrer, pode ser necessário retornar a cada embrião para garantir que eles permaneçam na posição desejada.

Isso pode ter que ser feito várias vezes, até que a posição ideal seja alcançada à medida que o ágar se solidifica. Depois de alguns minutos, para testar se está endurecido, use uma agulha para quebrar um pequeno pedaço de agarose. Quando puder ser puxado para longe da gota, use agarose adicional de baixo ponto de fusão para formar uma cúpula sobre os embriões embutidos, cobrindo toda a lamínula.

Enquanto a agarose se solidifica, prepare três mililitros de meio azul E3 com cinco gotas de tricaína 15 milimolar, para serem colocadas sobre os embriões incorporados durante a imagem. Para realizar imagens confocais 5D de embriões vivos de peixe-zebra, abra o software de imagem e ajuste o microscópio para uma lente de abertura numérica de 60X 1,4. Aplique óleo de imersão na lente e coloque a placa de cultura no suporte de lâminas no microscópio stage.

Usando o controlador de eixo, centralize o embrião de interesse acima da lente objetiva e levante a lente para encontrar a placa de cultura. Despeje a solução de azul E3 e tricaína sobre os embriões embebidos em ágar. Em seguida, clique no ícone Eye Port para view embriões através da ocular.

Desative a seleção de Eye Port e escolha View, Acquisition Controls, A1 Scan Area (Área de varredura A1) para abrir a ferramenta A1 Scan Area (Área de varredura A1). Selecione o canal GFP, reinicie a verificação e concentre-se em uma região de interesse próxima à lamínula. Pare a varredura, selecione os canais GFP e mCherry e defina a opção de média de linha como normal.

Agora, escolha Exibir, Controles de aquisição, Aquisição ND, para abrir a ferramenta A1 ND Acquisition. Comece a digitalizar. Em seguida, usando o controlador de eixo, posicione os embriões de forma que a área de varredura seja preenchida com o máximo possível de peixe-zebra.

Defina o limite superior da pilha Z para onde as células estão fora de foco, permitindo um espaço extra de três micrômetros acima da amostra, para crescimento e movimento celular. Em seguida, defina o limite inferior para onde as células não são mais visíveis e defina o tamanho do passo do intervalo Z para dois micrômetros. Para os experimentos demonstrados aqui, ajuste a potência do laser de imagem, HV ou ganho e níveis de deslocamento, respectivamente, conforme listado abaixo.

Uma vez definidos os parâmetros, desligue a varredura para evitar exposição desnecessária ao laser que pode causar fototoxicidade e fotobranqueamento da amostra. Agora, selecione o ícone de média de linha 2X, que fornece a melhor qualidade de imagem e o tempo de digitalização mais rápido. Selecione o intervalo de tempo apropriado e a duração de tempo necessários para o experimento.

Para divisões celulares de tipo selvagem, intervalos de tempo de dois minutos com duração de duas horas são adequados para determinar a duração mitótica. As divisões que ativam o ponto de verificação da montagem do fuso por mais de trinta minutos são mais adequadas para intervalos de quatro a cinco minutos por quatro horas, a fim de preservar a fluorescência, conforme demonstrado aqui. Para salvar automaticamente o arquivo à medida que ele está sendo adquirido, marque a caixa Salvar em arquivo e nomeie o arquivo.

Por fim, verifique novamente se todos os parâmetros estão definidos corretamente e clique em Executar agora. Após a conclusão da aquisição, para visualizar o arquivo em um formato tridimensional, clique no ícone Limite de Volume. Esta figura demonstra a capacidade de observar muitas divisões celulares usando um amplo campo de visão de uma cauda de peixe-zebra do tipo selvagem AB.

As divisões celulares são denotadas por asteriscos. O filme correspondente é mostrado aqui. Em média, foram observadas 50 células em divisão em AB e 30 células em divisão no mutante aurora B.

Para explicar o número reduzido de células mitóticas fotografadas no embrião mutante da aurora B, a proporção de células mitóticas para o número de células fotografadas foi calculada, sugerindo que não há um número menor de células passando por mitose nos embriões mutantes da aurora B, mas, sim, um número menor de células totais sendo fotografadas. Para quantificar a duração mitótica, o número de intervalos de tempo que ocupam uma divisão celular é multiplicado pelo intervalo de tempo entre cada pilha Z. Conforme revelado neste gráfico, o tempo médio de divisão do tipo selvagem AB é de 25 minutos e 58 minutos para o mutante aurora B.

Como visto em embriões do tipo selvagem, cada fase mitótica pode ser distinguida. No entanto, defeitos mitóticos são observados no embrião mutante aurora B, que incluem parada mitótica e citocinese arquivada, resultando em uma célula binucleada e subsequente formação de micronúcleos, que suportam o aumento do tempo de divisão medido neste mutante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em uma hora, desde a triagem de embriões até a configuração dos parâmetros do microscópio confocal.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar o contexto do experimento em questão, pois ele se refere à região de interesse, duração de tempo, intervalo de tempo e profundidade Z. Isso ajudará a maximizar a eficiência, além de evitar o fotobranqueamento e a fototoxicidade. Após este procedimento, outros métodos, como a disseminação de cromossomos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a causa dos defeitos mitóticos observados ou o uso de um tratamento medicamentoso para determinar os efeitos na progressão mitótica, duração ou destino celular.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da biologia explorarem a mitose no contexto da biologia do desenvolvimento e do câncer usando o peixe-zebra. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como incorporar embriões de peixe-zebra, capturar imagens ao vivo da mitose e analisar a frequência, a duração e o destino das células mitóticas. Não se esqueça de que trabalhar com lasers de alta potência e luz fluorescente pode ser prejudicial aos olhos, e cuidados, como evitar o contato direto dos olhos com os lasers, devem sempre ser tomados durante a realização deste procedimento.