Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

O objetivo geral deste procedimento é monitorar a fidelidade da segregação cromossômica durante a mitose em um embrião de peixe-zebra vivo, utilizando proteínas da cromatina e da membrana celular marcadas com fluorescência, que serão capturadas por meio de microscopia confocal de alta resolução. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da mitose, como, por exemplo, como defeitos mitóticos resultam em defeitos no desenvolvimento ou na formação de tumores em um organismo vertebrado vivo? A principal vantagem desta técnica é que estamos observando a mitose em um organismo vertebrado vivo, o que permite coletar dados fisiologicamente relevantes.

Após acasalar peixes-zebra adultos e injetar ovos com RNA H2A.F/Z-EGFP e/ou pCS2 mCherry-CAAX, cerca de duas horas antes da aquisição de imagens, utilize um microscópio estereoscópico fluorescente para identificar embriões positivos para GFP. Transfira embriões brilhantes e verdes, que expressam GFP, para um novo recipiente de Petri de 100 por 15 milímetros contendo meio E3 azul.

Ferva uma solução estoque de agarose a 1% de baixo ponto de fusão em E3 azul. Aliquote três mililitros da agarose fundida em um tubo de cultura de 17 por 100 milímetros. Mantenha a agarose aquecida colocando o tubo de cultura em um banho-maria a 42 graus Celsius até o momento do uso.

Reúna tricaina 15-milimolar, embriões selecionados, agarose de baixo ponto de fusão, E3 azul e um recipiente de cultura com fundo de lamínula de vidro de 35 milímetros, e um microscópio estereoscópico. Em seguida, com pinças número cinco, remova cuidadosamente as corionas de três embriões e coloque os embriões em um recipiente separado para serem anestesiados. Depois, usando uma pipeta de transferência, adicione três gotas de tricaina 15-milimolar ao recipiente contendo os embriões e cinco mililitros de meio.

Adicione três a quatro gotas de solução de tricaina 15-milimolar ao tubo com agarose fundida a 1%. Quando os embriões estiverem suficientemente anestesiados, utilizando um Pipetman P200 com um centímetro da ponteira cortado, transfira os embriões anestesiados para a placa com fundo de lamínula. Remova qualquer excesso da solução azul de tricaina E3.

Adicione lentamente de cinco a 10 microlitros de solução de tricaina com agarose de baixo ponto de fusão sobre os embriões, mantendo cada gota separada, para garantir que os embriões não se desloquem próximos uns dos outros. Em seguida, usando uma agulha de 21 gauge e um e meio, oriente suavemente os embriões na agarose para a posição desejada, posicionando a região de interesse o mais próximo possível da lamínula, caso esteja utilizando um microscópio invertido. Devido aos deslocamentos que podem ocorrer, pode ser necessário retornar a cada embrião para assegurar que permaneçam na posição requerida.

Isso pode precisar ser feito várias vezes, até que a posição ideal seja alcançada enquanto o ágar solidifica. Após alguns minutos, para testar se o ágar já está firme, use uma agulha para separar um pequeno pedaço de agarose. Quando for possível removê-lo da gota, use agarose de baixo ponto de fusão adicional para formar uma cúpula sobre os embriões embutidos, cobrindo toda a lamínula.

Enquanto a agarose solidifica, prepare três mililitros de meio E3 azul com cinco gotas de tricaina 15-milimolar, para ser colocado sobre os embriões embutidos durante a aquisição de imagens. Para realizar a imagem confocal 5D de embriões de peixe-zebra vivos, abra o software de aquisição de imagens e configure o microscópio com uma objetiva de 60X e abertura numérica 1,4. Aplique óleo de imersão na objetiva e coloque a placa de cultura no porta-lâminas sobre a platina do microscópio.

Usando o controlador de eixos, centralize o embrião de interesse acima da lente objetiva e eleve a lente até encontrar a placa de cultura. Despeje a solução azul E3 e tricaina sobre os embriões embutidos em ágar. Em seguida, clique no ícone do Olho do Porta-ocular para visualizar os embriões através da ocular.

Desative a seleção da porta ocular e escolha Visualizar, Controles de Aquisição, Área de Varredura A1, para abrir a ferramenta Área de Varredura A1. Selecione o canal GFP, reinicie a varredura e foque em uma região de interesse próxima à lamínula. Pare a varredura, selecione os canais GFP e mCherry e defina a opção de média de linhas para normal.

Agora, escolha Visualizar, Controles de Aquisição, Aquisição ND, para abrir a ferramenta A1 de Aquisição ND. Inicie a varredura. Em seguida, utilizando o controlador de eixos, posicione os embriões de modo que a área de varredura seja preenchida com a maior parte do peixe-zebra possível.

Defina o limite superior do Z-stack no ponto em que as células estão fora de foco, permitindo um espaço adicional de três micrômetros acima da amostra, para crescimento e movimento celular. Em seguida, defina o limite inferior no ponto em que as células deixam de ser visíveis e defina o tamanho do passo do intervalo Z como dois micrômetros. Para os experimentos demonstrados aqui, ajuste, respectivamente, a potência do laser de imagem, o HV ou ganho e os níveis de compensação, conforme listado abaixo.

Uma vez definidos os parâmetros, desligue a varredura para evitar exposição desnecessária ao laser, que pode causar fototoxicidade e fotobranqueamento da amostra. Agora, selecione o ícone de média de linha 2X, que oferece a melhor qualidade de imagem e o tempo de varredura mais rápido. Selecione o intervalo de tempo e a duração necessários para o experimento.

Para divisões celulares do tipo selvagem, intervalos de dois minutos durante um período de duas horas são adequados para determinar a duração da mitose. Divisões que ativam o ponto de verificação da montagem do fuso por mais de trinta minutos são mais adequadas para intervalos de quatro a cinco minutos durante quatro horas, a fim de preservar a fluorescência, como demonstrado aqui. Para salvar automaticamente o arquivo enquanto ele está sendo adquirido, marque a caixa Salvar no Arquivo e nomeie o arquivo.

Por fim, verifique novamente se todos os parâmetros estão configurados corretamente e clique em Executar Agora. Após a conclusão da aquisição, para visualizar o arquivo em formato tridimensional, clique no ícone Limite de Volume. Esta figura demonstra a capacidade de observar diversas divisões celulares utilizando um amplo campo de visão da cauda de um peixe-zebra selvagem AB.

As divisões celulares são indicadas por asteriscos. O filme correspondente é mostrado aqui. Em média, foram observadas 50 células em divisão em AB e 30 células em divisão no mutante aurora B.

Para levar em consideração o número reduzido de células em mitose imagiadas no embrião mutante da aurora B, calculou-se a razão entre o número de células em mitose e o número total de células imagiadas, sugerindo que não há um número menor de células passando por mitose nos embriões mutantes da aurora B, mas, sim, um número menor de células totais sendo imagiadas. Para quantificar a duração da mitose, multiplica-se o número de intervalos de tempo que compõem uma divisão celular pelo intervalo de tempo entre cada Z-stack. Conforme revelado neste gráfico, o tempo médio de divisão do tipo selvagem AB é de 25 minutos, e de 58 minutos para o mutante aurora B.

Como observado em embriões selvagens, cada fase mitótica pode ser distinguida. No entanto, defeitos mitóticos são observados no embrião mutante aurora B, que incluem parada mitótica e citocinese falhada, resultando em uma célula binucleada e subsequente formação de micronúcleos, o que sustenta o aumento do tempo de divisão medido nesse mutante. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em uma hora, desde a triagem de embriões até o ajuste dos parâmetros do microscópio confocal.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar o contexto do experimento em questão, conforme se relaciona com a região de interesse, duração temporal, intervalo de tempo e profundidade em Z. Isso ajudará a maximizar a eficiência, bem como a prevenir fotodegradação e fototoxicidade. Após este procedimento, outros métodos, como espalhamentos cromossômicos, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a causa dos defeitos mitóticos observados, ou o uso de um tratamento farmacológico para determinar os efeitos sobre a progressão mitótica, duração ou destino celular.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de biologia explorarem a mitose no contexto da biologia do desenvolvimento e da biologia do câncer utilizando peixe-zebra. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como embutir embriões de peixe-zebra, capturar imagens vivas da mitose e analisar a frequência mitótica, duração e o destino celular. Não se esqueça de que trabalhar com lasers de alta potência e luz fluorescente pode ser prejudicial aos olhos, e precauções, como evitar o contato direto dos olhos com os lasers, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.