Adaptação Humanos videofluoroscópicos Andorinha Métodos de Estudo de detectar e caracterizar Disfagia em modelos de doenças Murino

O objetivo geral deste procedimento é estudar a função de deglutição em roedores de comportamento livre, conhecido como estudo de deglutição fluoroscópica por vídeo ou VFSS primeiro. Uma câmara de alimentação é construída para confinar os roedores em um pequeno espaço durante os testes. O segundo passo é realizar o condicionamento comportamental com uma solução de teste para garantir a máxima participação.

O próximo passo é realizar testes VFSS com os camundongos pré-condicionados. Por fim, os vídeos são submetidos à análise quadro a quadro para quantificar os parâmetros da deglutição. Em última análise, esta nova ferramenta de avaliação pode ser usada para detectar e caracterizar a disfagia em modelos de doenças espelhadas e fornecer biomarcadores funcionais para uso em ensaios pré-clínicos.

Tivemos a ideia de usar câmaras de observação porque o teste VFSS em humanos é voluntário e irrestrito, e queríamos imitar de perto o procedimento clínico humano. A principal vantagem dessa técnica sobre métodos semelhantes existentes é que ela provoca rapidamente comportamentos de alimentação voluntária em roedores para permitir testes rápidos de todos os estágios da deglutição. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades com a análise de vídeo porque os movimentos pequenos e rápidos da deglutição e dos camundongos são difíceis de discernir.

Comece montando as câmaras de observação em seguida, monte um sistema de entrega de seringas para fornecer solução às tigelas de pinos durante o teste. Depois de montada, coloque a câmara de observação em um elevador de tesoura motorizado para posicionamento remoto. A principal vantagem da mesa elevatória de tesoura com controle remoto é a segurança aprimorada contra radiação para os pesquisadores, mantendo os roedores que se comportam livremente no campo de visão da fluoroscopia.

Prepare os ratos habituando-os à câmara de observação e submetendo-os a um período noturno de regulação da água. Quando estiver pronto para o teste, remova a câmara da gaiola e limpe-a completamente. Use um marcador de apagamento a seco para rotular cada tubo limpo antes de colocá-lo de volta na gaiola doméstica.

Em seguida, prepare a solução de iohexol com sabor de chocolate para configurar o ambiente de fluoroscopia. Use uma câmara de observação sobressalente e uma tigela de pinos para determinar a altura e a posição ideais dentro do feixe do fluoroscópio que permite a visualização da bebida no plano lateral. Defina a taxa de quadros da fluoroscopia para 30 quadros por segundo.

Taxas de quadros mais altas podem ser usadas, se disponíveis. Certifique-se de que um marcador de calibração radiopaco seja colocado adequadamente na câmera do fluoroscópio para que fique visível no monitor durante todo o teste. Esta etapa é necessária para permitir a calibração das medições de comprimento para reduzir o estresse devido ao manuseio.

Observe a gaiola até que um rato entre livremente na câmara de observação. Uma vez inserida, levante a câmara para fora da gaiola e prenda cuidadosamente a segunda tampa da extremidade. Com testes repetidos, os camundongos podem ser facilmente persuadidos a entrar na câmara quando ela é colocada na frente deles dentro da gaiola ou quando suspensa pela cauda sobre a abertura da câmara.

Posicione a câmara de observação dentro da máquina de fluoroscopia para iniciar o teste VFSS no plano lateral. Em seguida, use um sistema de entrega de seringas para encher a tigela com solução de iohexol com sabor de chocolate. Inicie a gravação da fluoroscopia de vídeo.

Quando o mouse começar a beber durante o teste, use a mesa elevatória com controle remoto para ajustar a posição da câmara de observação para que o mecanismo de deglutição fique visível no campo de view. Pause a gravação cada vez que o mouse se afastar da tigela de pinos para minimizar a duração da exposição à radiação. Retome a gravação quando o mouse retornar à tigela de pinos, reabasteça a tigela de pinos conforme necessário.

O objetivo é registrar várias sessões longas de consumo contínuo, o que é típico da maioria dos camundongos. Nos primeiros dois minutos de teste, pare de testar se o mouse não beber em cinco minutos, devolva os mouses não compatíveis à gaiola doméstica para testar novamente no mesmo dia. Não exceda um regulamento de água de 24 horas.

Ao testar vários ratos da mesma gaiola doméstica. Limpe a tigela e o tubo com uma toalha de papel seca entre os ratos. Apare a ponta do tubo PE conforme necessário.

Se mastigado durante o teste, limpe a câmara de observação conforme necessário para remover qualquer respingo de iohexol nas paredes da câmara. Enxágue a câmara com água da torneira e seque com uma toalha de papel. Use um programa de software de edição de vídeo que permita a análise quadro a quadro das gravações de fluoroscopia de vídeo.

Para quantificar os parâmetros de interesse da deglutição, pelo menos dois revisores treinados devem analisar cada vídeo de forma cega. O revisor principal visualiza cada vídeo para identificar e analisar de três a cinco crises longas de bebida. Este critério é baseado em estudos não radiográficos publicados sobre deglutição mostrando que este parâmetro é suficiente para análise estatística.

O revisor secundário analisa de forma independente as três a cinco medidas por parâmetro de deglutição para cada camundongo que foram inicialmente identificadas e analisadas pelo revisor primário. As discrepâncias dos revisores são então identificadas para cada camundongo e reanalisadas até que 100% de consenso seja alcançado. Os valores incontestáveis para cada parâmetro de deglutição são então calculados para obter o valor médio para cada camundongo.

Quando menos de três medidas forem obtidas para um parâmetro de deglutição, insira um valor ausente no banco de dados estatístico para essa medida. Esses exemplos foram obtidos usando uma posição do sistema de fluoroscopia de baixa energia. Um permite a visualização de toda a cabeça e região torácica proximal.

O ponto de gatilho da deglutição é centralizado dentro do campo de visão. A posição dois permite a visualização do ponto-gatilho da deglutição até a junção gastroesofágica. Observe que o bolo alimentar passa pelo esôfago distal, mesmo na configuração de ampliação mais baixa.

As estruturas ósseas da cabeça e pescoço são facilmente visíveis usando o sistema de fluoroscopia de baixa energia. As estruturas anatômicas também são examinadas em maior ampliação para permitir a quantificação de vários parâmetros adicionais da deglutição. Esta figura mostra resultados preliminares representativos para dois parâmetros de deglutição VFSS, taxa de deglutição e taxa de deglutição com intervalo entre deglutições foi significativamente mais lenta para camundongos SOD um em comparação com C 57 anos.

O intervalo entre as deglutições de camundongos e controles não foi significativamente diferente entre os grupos. Uma vez dominado, a captura de vídeo pode ser concluída em pouco menos de dois minutos por massa, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de utilizar a solução de teste com sabor de chocolate dentro de algumas horas após a preparação para evitar alterações na viscosidade e palatabilidade que podem resultar em comportamentos de evitação.

Essa nova técnica está abrindo caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem comportamentos naturais de alimentação e deglutição em roedores saudáveis e modelos de doenças. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar com sucesso o teste VFSS de roedores que se comportam livremente Para quantificar os comportamentos típicos de alimentação e função de deglutição, não se esqueça de que trabalhar com equipamentos emissores de radiação pode ser extremamente perigoso, e as precauções de radiação para tempo, distância e blindagem devem sempre ser seguidas durante a execução deste procedimento.