Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de Caenorhabditis elegans

El objetivo general del siguiente experimento es monitorear el desarrollo del comportamiento y la actividad neuronal de múltiples personas mayores. Esto se logra mediante el cultivo de los gusanos en cámaras microfluídicas aros llenas de alimentos. Las imágenes de calcio a largo plazo se realizan con una cámara E-M-C-C-D y tiempos de exposición cortos activados por TTL.

El procedimiento se puede ampliar escaneando varias cámaras secuencialmente o filmando varias cámaras a la vez. Los resultados muestran el comportamiento larvario y adulto, así como el transitorio de calcio de las neuronas de control. La principal ventaja de esta técnica de microcámara es que el comportamiento y el desarrollo se pueden seguir durante un largo período de tiempo con imágenes de alta calidad.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que es difícil aprender a llenar las microcámaras con la cantidad adecuada de comida y calor. Para comenzar, configure un microscopio con un calentador de tapa, una platina automática y un sistema de cámara E-M-C-C-D. Fabrica sellos de polimetilsuboxano en una instalación de microfluídica o mediante el uso de una fundición comercial.

Corta el chip PDMS en 16 sellos individuales con un bisturí. A continuación, exponga tanto el sello como un portaobjetos de vidrio al plasma de aire durante aproximadamente un minuto antes de colocar el sello en el portaobjetos. Trabaja lentamente para evitar derretir el plástico.

Corta un área cuadrada del fondo de un plato de 3,5 centímetros. Prepara varios platos a la vez. Prepare alícuotas estériles de aerodinámica de alto y bajo punto de fusión antes de usar.

Coloque tres alícuotas de aerodinámica de alto punto de fusión en un bloque calefactor. Además, derrita un eloqua de aerodinámica de bajo punto de fusión antes de transferirlo a un bloque calefactor separado. Primero, tome el plato de plástico con la abertura cuadrada creada anteriormente y colóquelo boca abajo con la abertura hacia arriba.

Use un pedazo de cinta adhesiva de doble cara para cubrir la abertura. Dale la vuelta al plato para que la cinta adhesiva quede en el fondo y colócalo sobre una superficie dura. Corta la abertura con un bisturí.

A continuación, rellene el área que rodea la abertura con dos mililitros de aros de alto punto de fusión. Espere hasta que el agro esté sólido. Una vez solidificado, retire la película protectora que cubre la cinta adhesiva de doble cara en el otro lado.

Esto da como resultado un anillo fino de cinta adhesiva que rodea el exterior de la abertura. El agro sirve como un reservorio de humedad que luego rodeará la muestra. Antes de construir las microcámaras, prepare la superficie del sello PDMS exponiéndola al plasma de aire durante 20 a 60 segundos.

Cree dos espaciadores de igual altura apilando de cinco a nueve portaobjetos de vidrio. Coloque un solo portaobjetos de vidrio entre las dos pilas de espaciadores. A continuación, coloque el portaobjetos de vidrio que contiene el sello PDMS a través de los espaciadores.

Ajuste la altura de los espaciadores para que haya un espacio de 1,5 milímetros entre la superficie de moldeo y el portaobjetos de vidrio. Cuando esté listo, coloque una gota de aros calientes de alto punto de fusión en el portaobjetos cerca del sello PDMS y deslice rápidamente el sello horizontalmente en el aros líquido. Una vez que el aros se haya solidificado y parezca opaco, retira el sello verticalmente con un solo movimiento.

Con un pico de alambre de platino fino, transfiera los huevos o gusanos junto con las bacterias OP 50 a los aros. Use una pestaña para distribuir un huevo o un gusano por cámara junto con la comida. Una almohadilla aros debe contener unos 30 gusanos.

Corta la losa de aros que contiene las micro cámaras en un cuadrado para que encaje bien en la abertura del plato. Use pinzas para levantar la losa y colóquela boca abajo sobre un portaobjetos de vidrio una vez que se haya caído, no levante ni deslice el cubreobjetos. Para evitar empujar el contenido fuera de sus cámaras.

Las cámaras ahora están selladas. A continuación, coloque el cubreobjetos en la abertura del plato de plástico. Presione suavemente la cubierta sobre el anillo hecho de cinta adhesiva de doble cara.

Tenga cuidado de no romper el vidrio. Dé la vuelta al plato y use aros de bajo punto de fusión para llenar el espacio entre la losa agrícola y el depósito de aros para cuando el aros se haya solidificado. Selle el plato con una tapa y param.

Después de terminar la preparación de las microcámaras, revíselas correctamente bajo un microscopio estereoscópico. El llenado de las cámaras y el control de la humedad son fundamentales para el éxito. Para empezar, coloque la placa que contiene las microcámaras en el microscopio y concéntrese en la muestra: Registre 40 fotogramas de imagen en 20 segundos cada media hora durante 24 horas.

A continuación, configure el escaneo para que visite cada gusano utilizando la etapa. Trata de filmar unos 30 gusanos en una sola carrera. Se pueden obtener imágenes de varios gusanos alejando la imagen.

Utilice un aumento más bajo para cubrir varias microcámaras y filmar varias microcámaras adyacentes simultáneamente. Una vez finalizada la adquisición de la imagen, separe los datos de cada cámara individual recortando una región de interés que abarque un animal. El marco y la resta se pueden utilizar para evaluar rápidamente los datos de movilidad.

Después de la obtención de imágenes, las imágenes de calcio se realizan en un microscopio compuesto equipado para epifluorescencia de campo amplio. Para limitar la exposición a la luz, utilice una señal lógica de transistor de transistor que active un LED para iluminar la muestra. Al mismo tiempo, la cámara graba un fotograma.

Ejecute una película en ráfaga durante 24 horas. Que toma imágenes de cada gusano cada 15 a 30 minutos. Primera grabación de 20 segundos con DIC.

Luego 20 segundos con fluorescencia GFP. Y por último, una imagen de la señal MK dos para controlar los niveles de expresión. Para la inspección visual de datos, utilice un mapa de colores falsos para mejorar la visibilidad de pequeños cambios en la intensidad de la fluorescencia.

Por último, realice el análisis de datos de calcio utilizando procedimientos estándar. Este ejemplo muestra el comportamiento de las larvas. Una cámara con mayores dimensiones permite el desarrollo de un huevo a un adulto a largo plazo, aquí se muestran cambios en el comportamiento.

La semilla de larva dote aquí es una etapa de vida alternativa que se lleva a cabo durante condiciones ambientales adversas. Este gusano adulto ha puesto muchos huevos en la cámara. Finalmente, esta imagen muestra a un hermafrodita adulto y un macho apareándose dentro de una cámara de adultos.

Aquí se muestran imágenes de calcio de la interneurona de comando A VA para una larva L. Estas imágenes muestran la actividad del calcio para el mismo tipo de neurona en un animal adulto. La ampliación de las imágenes a largo plazo permite obtener imágenes de 30 gusanos en un chip de cámara.

Al intentar este procedimiento, es importante llenar las cámaras con la cantidad correcta de alimento y asegurar los movimientos correctos de agarro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar las imágenes de micro cámara aros en varias etapas de la vida de la elegancia marina.