Ex Cultura Vivo de Pintainho Cerebelar Slices e voltadas para o espaço Eletroporação do grânulo precursores de células

O objetivo geral deste procedimento é direcionar a modificação genética para a camada germinativa externa do cerebelo do pintinho para observar, examinar e modificar a morfologia e o comportamento das células granulares em um ambiente ex vivo. Esse método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurobiologia do desenvolvimento, como como os progenitores neurais migram, proliferam e se diferenciam. A principal vantagem dessa técnica é que ela traz consigo os benefícios consideráveis em custo e conveniência associados aos estudos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre o desenvolvimento de grânulos de frango, ele também pode ser aplicado a outros organismos modelo, como répteis e mamíferos. Para começar, coloque os ovos de galinha marrons fertilizados em uma incubadora de ovos a 38 graus Celsius até que atinjam o embrião. Dia 14 No dia embrionário 14, corte uma abertura no ovo para expor o embrião e decapitar o embrião do pintinho no ovo.

Colocou a cabeça em uma placa de Petri contendo PBS gelado sob microscópio de dissecação. Use uma pinça padrão para fazer uma incisão atrás de cada olho em todo o tecido e remover os olhos e a mandíbula superior. Em seguida, faça uma segunda incisão em toda a faringe para remover a mandíbula inferior.

Em seguida, use uma pinça padrão para remover a pele da superfície do crânio, retirando-a. Em seguida, remova os ossos frontal e parietal, revelando o cérebro de um aspecto ventral. Remova a cartilagem faríngea e o mesênquima auxiliar.

Em seguida, coloque o lado dorsal do cérebro para cima e remova cuidadosamente o mesênquima dorsal do cérebro posterior, tomando cuidado para não danificar o p. Em seguida, faça uma incisão em todo o tecido entre o mesencéfalo e o rombencéfalo para separar o rombencéfalo, incluindo o cerebelo. Faça incisões em todo o tecido nas junções laterais do cerebelo e na placa aller do cérebro posterior.

Remova todo o cerebelo, tomando cuidado para manter a integridade da PIA durante toda a dissecção. Finalmente, remova o plexo coróide em formação e mova o cerebelo dissecado para HBSS gelado. Transfira todo o cerebelo para a plataforma estéril de um picador de tecidos usando uma espátula ou uma pipeta de pastagem de três mililitros com uma ponta cortada.

Para ampliar a abertura, remova o excesso de líquido usando uma pipeta. Defina a velocidade de corte do picador de tecidos para 50% de seu valor máximo. Em seguida, corte o cerebelo na orientação desejada com uma espessura de 300 micrômetros usando uma pipeta de pastagem de três mililitros.

Cubra o cerebelo fatiado em HBSS frio. Em seguida, transfira o HBSS e as fatias para uma placa de Petri de 60 milímetros contendo 20 mililitros de HBSS gelada usando a pipeta de pastagem de três litros com uma ponta cortada, coloque uma placa de Petri sob um microscópio de dissecação iluminado com uma fonte de luz de fibra óptica. Em seguida, use uma pinça de relojoeiro para separar fatias individuais de tecido cerebral e identificar as fatias a serem eletroporadas com base em sua integridade tecidual e posição lateral da mídia.

Construa uma câmara de eletroporação fixando o ânodo de um eletro na base de uma placa de Petri de 60 milímetros. Usando fita isolante, adicione aproximadamente um mililitro de HBSS para cobrir o eletrodo. Em seguida, uma cultura de 0,4 micrômetro.

Insira na parte superior do eletrodo coberto com HBSS. Use uma pipeta de pastagem de três mililitros com uma ponta cortada para transferir as fatias identificadas até cinco por inserção para a inserção de cultura. Em seguida, separe as fatias e deixe-as assentar na cultura.

Insira em uma orientação sagital. Usando uma pipeta, remova o excesso de meio das fatias do cérebro. Deixe o inserto descansar no eletrodo para que haja contato entre o inserto e o eletrodo.

Nesta configuração. O inserto de cultura com as fatias repousará sobre a superfície do meio, mantendo o circuito, mas permitindo o direcionamento espacial do cátodo. Usando uma ponta de pipeta P 10, pipete cinco microlitros de DNA diluído com 20% de verde rápido sobre a superfície de uma região alvo de cada fatia.

A adição de verde rápido garante que a solução de DNA seja viscosa o suficiente para proibir a ampla dispersão do DNA. Em seguida, coloque o cátodo do tecido-alvo desejado e eletrolítico as amostras. Evite o contato direto do cátodo com o tecido, colocando-o o mais próximo possível do tecido, sem realmente tocá-lo.

Repita a eletroporação em várias regiões da camada externa de grânulos em cada fatia cerebelar individual, conforme desejado. Quando terminar, transfira o folheto de cultura para uma placa de Petri de 30 milímetros Para cada cultura. Adicione um mililitro de meio de cultura pré-aquecido embaixo do inserto de cultura.

Certifique-se de que a pastilha não flutue no meio. A inserção de cultura deve estar em contato com o meio, mas as fatias não devem ser banhadas nele. Incube as culturas por até três dias, substituindo toda a cultura.

Médio a cada 24 horas com pré-aquecimento fresco, meio seguindo cultura. Transfira as fatias nas inserções de cultura para um prato de 30 milímetros contendo 4% de formaldeído por uma hora. Certifique-se de adicionar o paraformaldeído em cima da cultura.

Insira uma vez fixado. Lave as fatias três vezes em PBS por cinco minutos cada. Em seguida, use uma tesoura oftálmica para dissecar cada uma das fatias cerebelares eletroporadas e cultivadas da cultura.

Insira cortando ao redor de cada fatia e removendo-a junto com a região anexada da inserção. Não tente remover a fatia da superfície de inserção. Monte as fatias em aproximadamente um mililitro de um meio de montagem de sua escolha sob uma lamínula, tomando cuidado para não introduzir bolhas.

Quando as lâminas estiverem secas, colete-as e visualize-as usando digitalização a laser. Calbindina por microscopia confocal. A coloração do tecido cerebelar E 14 é mostrada aqui em vermelho após eletroporação com um plasmídeo GFP de controle em um, dois e três dias in vitro.

A coloração consistente com calbindina mostra que a integridade do tecido é mantida em cultura por pelo menos três dias in vitro. Aqui estão imagens de baixa ampliação de plasmídeos codificados em RFP e GFP que foram eletroporados com sucesso na camada externa de grânulos em vários locais. O plasmídeo GFP foi direcionado para um único fum, conforme indicado pelo asterisco.

Um exemplo é mostrado aqui onde uma construção que codifica GFP impulsionada por um intensificador 8 0 1 foi eletroporada na camada externa de grânulos. A expressão de 8 0 1 define os precursores das células granulares na camada externa de grânulos. Várias morfologias celulares são claramente visíveis em três dias in vitro e o comportamento celular pode ser monitorado.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como eleger fatias cerebelares individuais com uma variedade de ferramentas genéticas para observar e manipular o desenvolvimento das células granulares. Após este procedimento, outros métodos, como imuno-histoquímica, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a integridade estrutural do tecido e localizações relativas de diferentes tipos de células, como células de Perkin ou Bergman gl Uma vez dominado. Essa técnica pode ser feita em cerca de duas horas para uma dúzia de embriões de galinha, se for executada corretamente.